멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

요약

2리포터 판독값을 제공하는 비드계 멀티플렉스 분석분석을 위한 유량 분석 시스템은 SARS-CoV-2에 대한 중화 IgG 및 IgM 항체를 동시에 측정할 수 있는 멀티플렉스 세론및 항체 중화 분석분석의 개발에 사용되었다.

초록

COVID-19 전염병은 SARS-CoV-2와 같은 새로운 병원체를 가진 감염의 민감하고 특정 혈청학적 검출을 위한 신속한 고처리방법의 필요성을 강조하고 있다. 멀티플렉스 세로지학적 검사는 병원체 커버리지를 최적화하는 여러 항원에게 항체를 동시에 분석하고 유기체 및 개별 숙주 반응의 가변성을 조절할 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 여기서 우리는 3개의 주요 SARS-CoV-2 항원-스파이크 (S) 단백질, 스파이크 안지오텐신 변환 효소-2 (ACE2) 수용체 결합 도메인 (RBD), 및 뉴클레오캡 (NCD)에 IgM과 IgG 항체 둘 다 검출할 수 있는 SARS-CoV-2 IgG 3-플렉스 형광 마이크로스피어 기지를 둔 분석체를 기술합니다. 분석은 증상 발병으로부터 ≥21일 에서 얻은 혈청에서 IgG에 대한 SARS-CoV-2 참조 분석과 유사한 성능을 보였지만 증상 발병으로부터 ≤5일 이내에 수집된 샘플로 더 높은 감도를 보였다. 또한, 중화 분석 형식으로 용용 성 ACE2를 사용하여, 항체 결합의 억제는 S 및 RBD에 대해 입증되었다.

서론

COVID-19 전염병은 SARS-CoV-2와 같은 새로운 병원균의 진단 및 감시에 사용할 수 있는 빠른 고처리량, 고성능 혈청 학적 검사를 신속하게 개발하고 구현할 수 있다는 중요성을 강조했습니다. 멀티플렉스 혈청 학적 테스트는 동시에 유기체및 감염에 대한 숙주 반응에 대한 광범위한 병원균 적용 및 제어를 제공하는 여러 항원으로 항체를 동시에 분석 할 수 있기 때문에 전염병에서 매우 유용 할 수 있습니다. 다중형 비드 계 분석, SARS-CoV-2 IgG 3Flex(3Flex)의 개발, 즉 스파이크(S) 단백질, 스파이크 안지오텐신-변환 효소-2(ACE2) 수용체 결합 도메인(RBD), 및 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드(NC)를 검출할 수 있는^{것으로 최근 1보고되었다.} 3Flex는 증상 발병후 ≥21일 이내에 얻은 혈청에 대한 SARS-CoV-2 IgG 분석과 유사한 성능을 보였지만 증상 발병으로부터 ≤5일 이내에 수집된 샘플로 더 높은 감도를 보였다. 또한, 중화 분석 형식으로 용용 ACE2를 사용하는 S 및 RBD 항원용 항체 결합억제가 입증되었다. 멀티플렉스 비드 기반 기술은 멀티플렉스 세로지학적 테스트를 위한 입증된 기술로 널리 채택되었으며 짧은 결과, 작은 샘플 요구 사항 및 저노동^2,3,4를포함한 대규모 스크리닝에 뚜렷한 장점이 있다.

최근에는 이전 작업^1에서입증된 시스템의 동일한 하이플렉스, 높은 처리량 기능을 제공하지만 두 리포터 채널의 추가 이점을 제공하는 새로운 유동 분석 기기가 출시되었습니다. 단일 반응에서 두 개의 형광 기자 신호를 측정하는 능력은 각 샘플에 대한 별화당 두 가지 결과를 평가할 수 있으며 일반적으로 별도의 반응 웰^5에서수행해야 하는 이소타이핑 응용 분야에 이상적입니다. 이중 리포터 기능은 샘플 볼륨 요구량의 절반으로 각 샘플의 두 배의 데이터를 제공하므로 단일 리포터 시스템에 비해 명확한 이점이 있습니다. 이 연구는 표준 서학적 분석 프로토콜을 자세히 설명하고 중화 분석에 대한 적응을 설명합니다. 또한, 이 보고서는 단일 기자 분석의 이중 기자 분석체를 이중 기자 종양 분석으로 변환한 후, 이중 기자 중화 분석, SARS-CoV-2 S, RBD 및 Nc 항원에 대한 IgG 및 IgM 등산화 항체의 중화를 동시에 측정한다. 분석 프로토콜의 시각적 개요는 그림 1에서제공됩니다.

프로토콜

SARS-CoV-2 진단 분석을 위해 이전에 시험된 잔류 인간 혈청 견본은 로체스터 기관 검토 위원회의 대학에 의해 승인된 이 연구 결과에서 이용되었습니다.

1. 시약 및 장비

1. 상업적인 근원에서 코로나바이러스 항원 및 인간 IgG 및 IgM을 가져옵니다.
2. 계측기 공급업체로부터 분석 제어(AC) 비드 세트(45 및 220)를 획득합니다. AC 비드 세트 45 모니터 중앙형 형광 강도 (MFI) 단일 기자 채널 (RP1) 악기에 수집. AC 비드 세트 220 모니터 MFI 컬렉션에 두 번째 리포터 채널(RP2).
3. 결합 확인에 사용되는 검출 항체 및 항원 특이토끼 세라 및 항체를 획득한다.
4. 스테레프타비딘, R-phycoerythrin 컨쥬게이트(SAPE) 또는 플루오로포어 슈퍼 브라이트 436(SASB; 405나노미터(nm)에서 의 흥분및 436nm에서 배출되는 스트렙타비딘 컨쥬게이트를 가진 비오틴 표지 항체로 검출을 수행한다.
5. 인간 ACE2 단백질을 얻습니다(즉, SARS 수용체). 사용하기 전에, 유광수물(DEPC 처리, 오토클레이브 및 0.2-μm 멸균 여과)에서 1 mg/mL 농도로 용해하여 lyophilized ACE2 단백질을 재수화하고 4°C에 저장한다.
6. 96웰의 구속력이 없는 표면(NBS) 검정 플랫 하부 플레이트에서 모든 반응을 수행합니다. 분석 인큐베이션 단계를 위해 96 개의 마이크로 플레이트 알루미늄 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 분석 세척 단계에 마그네틱 플레이트 분리제를 사용하십시오.

2. 항원 결합 및 항체 결합 대조군 비드 제제

1. 카메론 외^1에설명된 바와 같이 자성, 폴리스티렌 및 색으로 구분된 마이크로스피어 세트(6.5-μm 직경)를 S, RBD 및 Nc 항원과 결합한다. 코로나바이러스 항원은 10pmol/10⁶ 구슬(S)과 100pmol/10⁶ 구슬(RBD 및 Nc)에 결합된다. 인간 IgG 또는 IgM과 결합된 제어 구슬은 이전에 설명된^1과같이 생성됩니다. IgG와 IgM은 5 μg/10⁶ 구슬에 결합되어 있습니다.
2. 커플링 후, 비드 농도를 결정하고 각 주식을 1 x 10⁶ 구슬/mL로 희석하여 설명된 절차^6을이용하여 한다.
3. 카메론 외^1에설명된 바와 같이 토끼 또는 양성 인간 세라로부터 항원 특이적 항체와 항원 결합의 확인을 수행한다.
   1. 분석의 생체 화 된 반인간 IgG / SAPE 검출 시약, 그리고 IgM과 물리 에리스린 (PE)라벨 염소 안티 - 인간 IgM과 인간 IgG 커플링을 확인합니다.
      참고: 이러한 시약에 사용하기 에 최적의 농도가 알려져 있지 않기 때문에 결합 확인은 단백질 특정 혈청 또는 항체의 적정을 사용하여 수행됩니다. 혈청의 경우, 시리얼 폴드 희석제는 mg/mL 주식으로 공급되는 항체의 경우 시리얼 μg/mL 희석 계열이 사용된다.
4. 멀티플렉스 비드 믹스에 사용하기 전에 두 리포터 채널에서 MFI 수집을 모니터링하는 분석 제어(AC) 구슬을 1 x 10⁶ 구슬/mL 농도로 희석한다.

3. 신선한 멀티플렉스 비드 믹스 준비

1. 멀티플렉스 비즈믹스를 개별 커플 비즈에서 매일 신선하게 준비하고 비드 스톡을 1 x 10⁶ 구슬/mL로 제어합니다.
   참고: 멀티플렉스 비드 믹스는 50μL 부피로 각 비드 영역에 대해 2,500개의 구슬을 제공할 준비가 되어 있습니다. 반응의 수에 대한 멀티 플렉스 비드 믹스를 준비하는 방법에 대한 계산은 안젤로니 (2020)^6에의해 게시 된 블로그에 설명된다.

4. 샘플 희석

1. 1:100 혈청 시료 희석을 10μL의 990 μL에 인산염 완충식식살린(PBS)에 혼합하여 0.05% 트웬 20, 0.02% 나트륨 아지드, 소세럼 제모틴(BSA)의 1%를 함유한다.
2. PBS-TBN의 180 μL에 1:100 희석의 20 μL을 추가하여 다시 10배의 샘플을 희석시 희석시.
   참고: 혈청 샘플은 COVID-19 전염병 이전에 2019년에 수집된 표본에서 음의 세라, 그리고 SARS-CoV-2 PCR 양성 환자로부터 의양성 세라로 구성되며, 이는 낮고 높은 항체 티터를 나타냅니다. 양성 샘플은 증상 발병(DFSO)으로부터 ≈3에서 >60일 사이에 수집되었다. 모든 혈청 샘플과 IgG-박탈 된 음수 대조체 세라는 아래에 설명된 대로 1:1000으로 희석됩니다. 중화 분석의 경우, 세라는 아래 중화 프로토콜에 설명된 대로 1:500을 희석한다(섹션 6 및 8).

5. 단일 기자 세로지학적 분석 프로토콜

1. 96웰의 비결합 마이크로티터 플레이트의 각 할당된 웰에 50 μL의 멀티플렉스 비드 믹스를 추가합니다.
2. 파이펫 50 μL 1:1000 혈청 또는 PBS-TBN을 적절한 우물로; 우물에서 혈청의 최종 희석은 1:2000입니다.
3. 마이크로 플레이트 호일 씰로 플레이트를 덮고 37°C의 가열된 플레이트 셰이커에 600 rpm에서 흔들리면 15분 동안 배양합니다.
4. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
5. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
6. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
7. 아래에 설명된 바와 같이 반응 우물을 씻어주세요(첫 번째 시료 인큐베이션 워시).
   1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
   2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
   3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 플레이트 자석에 2분 동안 배치하여 구슬을 반응 혼합물에서 분리합니다.
   4. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
   5. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
8. 아래에 설명된 바와 같이 반응 우물을 씻어주세요(제2시 후 배양 세척).
   1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
   2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
   3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 플레이트 자석에 2분 동안 배치하여 구슬을 반응 혼합물에서 분리합니다.
   4. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
   5. 자석에서 접시를 제거합니다.
9. 항체를 0.62 μg/mL로 희석하여 SAPE와 비오틴 항인간 IgG를 1 μg/mL로 새롭게 혼합합니다. 각 웰에 100 μL을 추가합니다.
10. 마이크로 플레이트 호일 씰로 플레이트를 덮고 37°C의 가열된 플레이트 셰이커에 600 rpm에서 흔들리면 15분 동안 배양합니다.
11. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
12. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
13. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
14. 아래에 설명된 바와 같이 반응우물을 씻어주세요(제1 사후 검출 항체 인큐베이션 워시).
    1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
    2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
    3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 플레이트 자석에 2분 동안 배치하여 구슬을 반응 혼합물에서 분리합니다.
    4. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
    5. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
15. 아래에 설명된 바와 같이 반응우물을 씻어주세요(제2 검지 후 항체 인큐베이션 워시).
    1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
    2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
    3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
    4. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
    5. 자석에서 접시를 제거합니다.
16. 각 웰에 PBS-TBN 100 μL을 추가합니다.
17. 호일 씰로 덮고 37 °C에서 2 분 동안 흔들어주세요.
18. 플레이트 셰이커에서 접시를 제거합니다. 그런 다음 호일 씰을 제거하고 사용자 매뉴얼에 따라 유량 분석기에서 각 웰의 50 μL을 읽습니다. 간략한 설명은 아래에 있습니다.
    1. 화면 왼쪽 상단 모서리에 있는 드롭다운 메뉴를 선택하고 플레이트 구성으로 이동합니다.
    2. 실행 플레이트를 선택합니다.
    3. 플레이트 캐리어를 배출하려면 배출 아이콘을 선택합니다.
    4. 플레이트 를 플레이트 캐리어에 로드하고 플레이트 캐리어를 철회아이콘을 선택합니다.
    5. 플레이트를 실행하려면 실행 아이콘을 선택합니다.

6. 단일 기자 중화 분석 프로토콜

1. 위의 섹션 3에 설명된 대로 신선한 멀티플렉스 비드 믹스를 준비한다.
2. 다음과 같이 환자 및 제어 세라 1:500을 희석시.
   1. PBS-TBN의 990 μL에 혈청 10 μL을 혼합하여 혈청 1:100을 희석합니다.
   2. PBS-TBN의 160 μL에 1:100 혈청의 40 μL을 추가하여 혈청을 5배 더 희석시하십시오.
3. 96웰의 비결합 마이크로티터 플레이트의 각 할당된 웰에 50 μL의 멀티플렉스 비드 믹스를 추가합니다.
4. 각 웰에 2 μg/mL ACE2 희석25 μL을 추가합니다.
5. 마이크로 플레이트 호일 씰로 접시를 덮고 600 rpm에서 흔들어 2 분 동안 37 °C에서 가열 된 플레이트 셰이커에 배양하십시오.
6. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 호일 씰을 제거합니다.
7. 할당된 우물에 1:500 혈청 또는 PBS-TBN의 25 μL을 추가합니다.
8. 마이크로 플레이트 호일 씰로 플레이트를 덮고 37°C의 가열된 플레이트 셰이커에 600 rpm에서 흔들리면 15분 동안 배양합니다.
9. 분석 절차의 나머지 부분에 대 한, 단계를 수행 5.4 받는 방법 5.18.5 위에서 설명 한 대로.

7. 이중 기자 IgG와 IgM 세로지컬 분석으로 전환

1. 위의 섹션 2에 설명된 바와 같이 항원 결합 구슬을 준비한다.
   참고: 인간 IgM과 결합된 추가 비드 세트는 안티 IgM 검출 시약의 추가를 모니터링할 뿐만 아니라 RP2용 MFI 컬렉션을 모니터링하는 추가 AC 비드 세트(220)가 포함되어 있습니다. 모든 비드 주식은 아래에 설명된 대로 멀티플렉스 비드 믹스에 포함하기 위해 1 x 10⁶ 구슬/mL에 있습니다.
2. 위의 섹션 3에 설명된 대로 신선한 멀티플렉스 비드 믹스를 준비합니다.
3. 위의 섹션 4에 설명된 바와 같이 혈청 샘플및 IgG-박탈된 음수 대조군 세라 1:1000을 희석시.
4. 96웰의 비결합 마이크로티터 플레이트의 각 할당된 웰에 50 μL의 멀티플렉스 비드 믹스를 추가합니다.
5. 파이펫 50 μL 1:1000 혈청 또는 PBS-TBN이 적절한 우물에 들어있습니다. 우물에서 혈청의 마지막 희석은 1:2000입니다.
6. 마이크로 플레이트 호일 씰로 플레이트를 덮고 37°C의 가열된 플레이트 셰이커에 600 rpm에서 흔들리면 15분 동안 배양합니다.
7. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
8. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
9. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
10. 아래에 설명된 바와 같이 반응 우물을 씻어주세요(첫 번째 시료 인큐베이션 워시).
    1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
    2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
    3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 플레이트 자석에 2분 동안 배치하여 구슬을 반응 혼합물에서 분리합니다.
    4. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
    5. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
11. 7.10.1-7.10.5 단계에서 상술한 바와 같이 PBS-TBN(두 번째 시료 인큐베이션 워시)으로 반응 우물을 다시 씻어낸다.
12. 자석에서 접시를 제거합니다.
13. 시약의 필요한 조합과 신선한 검출 시약을 혼합하고 각 우물에 50 μL 또는 100 μL을 추가합니다.
    참고: 브릴리언트 바이올렛 421 기자 염료(BV; 405 nm에서 의외로 발췌 및 421 nm에서 배출)에 공주된 반인간 IgG를 포함하는 검출 시약 믹스는 사용 가능한 재고 시약의 양을 제한하기 때문에 50 μL/well에서 사용하였다. 다른 모든 검출 시약 믹스는 100 μL/웰에서 사용됩니다.
14. 마이크로 플레이트 호일 씰로 플레이트를 덮고 37°C의 가열된 플레이트 셰이커에 600 rpm에서 흔들리면 15분 동안 배양합니다.
15. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
16. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
17. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
18. PBS-TBN (검출 항체 인큐베이션 후 첫 번째 세척)와 함께 아래에 설명된 바와 같이 반응 우물을 세척한다.
    1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
    2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
    3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
    4. 자석에 접시를 유지하면서 호일 씰을 제거하고 조심스럽게 폐기물 용기 위에 접시를 반전시키고 우물에서 상수판을 부드럽게 쓸어 냅니다.
    5. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
19. 7.17.1-7.17.5 단계에서 전술한 바와 같이 PBS-TBN(검출 항체 인큐베이션 후 두 번째 세척)을 통해 반응우물을 다시 씻어낸다.
20. 자석에서 접시를 제거합니다.
21. 각 웰에 PBS-TBN 100 μL을 추가합니다.
22. 호일 씰로 덮고 37 °C에서 2 분 동안 흔들어주세요.
23. 플레이트 셰이커에서 접시를 제거합니다. 그런 다음 호일 씰을 제거하고 5.18.1-5.18-5 단계에서 상술한 바와 같이 유량 분석기에서 각각 50 μL을 읽습니다.

8. 이중 기자 중화 분석으로 전환

1. 위의 7.1 단계에서 설명된 대로 결합된 구슬을 사용합니다.
2. 7.2 단계에서 설명한 대로 신선한 멀티플렉스 비드 믹스를 준비한다.
3. 혈청 샘플과 IgG-박탈 된 네거티브 컨트롤 세라는 다음과 같이 1:500을 희석합니다.
   1. 10 μL의 혈청을 PBS-TBN의 990 μL에 혼합하여 1:100 희석을 준비합니다.
   2. PBS-TBN의 160 μL에 1:100 희석의 40 μL을 추가하여 1:100 샘플을 추가로 희석시 1:100 을 희석시.
4. 96웰의 비결합 마이크로티터 플레이트의 각 할당된 웰에 50 μL의 멀티플렉스 비드 믹스를 추가합니다.
5. 각 웰에 2 μg/mL ACE2 희석25 μL을 추가합니다.
6. 마이크로 플레이트 호일 씰로 접시를 덮고 600 rpm에서 흔들어 2 분 동안 37 °C에서 가열 된 플레이트 셰이커에 배양하십시오.
7. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 호일 씰을 제거합니다.
8. 할당된 우물에 1:500 혈청 또는 PBS-TBN의 25 μL을 추가합니다.
9. 호일 씰로 접시를 덮고 37°C에서 가열된 플레이트 셰이커에 15분 동안 600rpm에서 흔들어 줍니다.
10. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
11. 자석에 플레이트가 유지되면 호일 씰을 제거하고, 플레이트를 폐기물 용기 위로 조심스럽게 반전시키고, 수퍼플릿을 우물밖으로 부드럽게 쓸어냅니다.
12. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
13. 아래에 설명된 바와 같이 반응 우물을 씻어주세요(첫 번째 포스트 시료 인큐베이션 워시).
    1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
    2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
    3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
    4. 자석에 플레이트가 유지되면 호일 씰을 제거하고, 플레이트를 폐기물 용기 위로 조심스럽게 반전시키고, 수퍼플릿을 우물밖으로 부드럽게 쓸어냅니다.
    5. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
14. PBS-TBN(제2 시료 인큐베이션 워시)을 사용하여 반응 우물을 다시 씻어 내십시오.
15. 자석에서 접시를 제거합니다.
16. 시약의 필요한 조합과 신선한 검출 시약을 혼합하고 각 우물에 50 μL 또는 100 μL을 추가합니다.
    참고: BV 리포터 염료에 공주된 반인간 IgG를 포함하는 검출 시약 믹스는 사용 가능한 재고 시약의 양을 제한하기 때문에 50 μL/well에서 사용하였다(재료표참조). 다른 모든 검출 시약 믹스는 100 μL/웰에서 사용됩니다.
17. 마이크로 플레이트 호일 씰로 플레이트를 덮고 37°C의 가열된 플레이트 셰이커에 600 rpm에서 흔들리면 15분 동안 배양합니다.
18. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
19. 자석에 플레이트가 유지되면 호일 씰을 제거하고, 플레이트를 폐기물 용기 위로 조심스럽게 반전시키고, 수퍼플릿을 우물밖으로 부드럽게 쓸어냅니다.
20. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
21. 아래에 설명된 바와 같이 반응 우물을 씻어주세요(먼저 검출 항체 배큐베이션 후).
    1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
    2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
    3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
    4. 자석에 플레이트가 유지되면 호일 씰을 제거하고, 플레이트를 폐기물 용기 위로 조심스럽게 반전시키고, 수퍼플릿을 우물밖으로 부드럽게 쓸어냅니다.
    5. 자석에 접시를 들고 있는 동안 흡수성 용지에 접시를 블롯합니다.
22. PBS-TBN(검출 항체 인큐베이션 후 두 번째 세척)을 통해 반응 우물을 다시 씻어내고, 8.21.1-8.21.5 단계에서 상세한 것과 정확히 일치한다.
    1. 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 각 우물에 PBS-TBN 150 μL을 추가합니다.
    2. 신선한 호일 씰로 접시를 덮고 37 °C에서 600 rpm에서 2 분 동안 흔들어줍니다.
    3. 플레이트 셰이커에서 플레이트를 제거하고 반응 혼합물에서 구슬을 분리하기 위해 2 분 동안 자기 플레이트 분리기위에 놓습니다.
    4. 자석에 플레이트가 유지되면 호일 씰을 제거하고, 플레이트를 폐기물 용기 위로 조심스럽게 반전시키고, 수퍼플릿을 우물밖으로 부드럽게 쓸어냅니다.
    5. 자석에서 접시를 제거합니다.
23. 각 웰에 PBS-TBN 100 μL을 추가합니다.
24. 호일 씰로 덮고 37 °C에서 2 분 동안 흔들어주세요.
25. 플레이트 셰이커에서 접시를 제거합니다. 그런 다음 호일 씰을 제거하고 5.18.1-5.18-5 단계에서 상술한 바와 같이 유량 분석기에서 각각 50 μL을 읽습니다.

결과

단일 기자 세로지컬 분석의 최적화.
모든 SARS-CoV-2 항원을 위한 결합 전략은 카메론, 외, 2020¹ 및 2.1 단계에서 위에서 설명된다. 커플링 확인 전략은 위의 2.3 단계에서 설명됩니다. 효율적인 커플링의 경우, 중앙형광 강도(MFI) 값은 혈청/무항체 음성 제어 반응보다 현저히 높어야 하며 검출 시약의 양이 감소하는 MFI 신호 감소의 용량 반응을 보여줘야 한다. 약 1,000MFI 단위 이상의 MFI는 일반적으로 효율적인 단백질 커플링을 나타내며 사용되는 검출 시약의 농도 및 특이성에 의존한다. 이 방법을 사용하여, S, RBD 및 Nc 항원 커플링의 확인은 구슬의 두 제비(그림 2)에대한 테스트되었다. 모든 항원을 위한 MFI 신호는 배경 MFI보다 현저히 높았으며 검출 시약의 적정을 통해 투여 반응을 보였다. 데이터는 또한 결합된 구슬의 두 개의 다른 제비 사이 MFI 수준의 좋은 재현성을 보여주었습니다.

단일 리포터 분석의 최적화는 카메론, 등, 2020^1에설명된 대로 수행되었다. 각 항원들은 높은, 중간, 낮음 및 음의 샘플을 나타내는 여러 혈청 샘플의 상이한 희석과 다른 결합 농도에서 시험되었다. 또한, 분석이 IgG 티터를 측정하기 때문에, IgG-박탈된 혈청을 추가 음수 샘플로 사용되었다. 상이한 항원 커플링 수준을 가진 대표적인 샘플 희석 계열의 결과는 도 3에도시된다. 이 초기 희석 계열은 대표적인 항원 특이적 및 배경 MFI 수준의 잠재적 범위를 얻기 위해 검출 시약의 고정 농도로 테스트되었습니다. 이러한 데이터로부터, 추가 시료 희석 범위 및 항원 커플링 수준은 추가 샘플(도시되지 않은 데이터)을 통해 추가 적인 샘플로 결정되고 더 테스트하였다.

다음으로, 검출 시약의 농도는 상이한 혈청 희석제 및 항원 커플링 수준으로 사용하기 위해 최적화되었다. 6개의 양수 및 2개의 음수 샘플을 이용한 대표적인 데이터는 도 4에도시된다. 수백 개의 음수 사전 COVID-19 혈청 샘플로 추가 테스트를 거친 후, 최종 최적의 항원 커플링 수준 및 검출 리젠트 농도가 섹션 5에 설명된 바와 같이 최종 분석 프로토콜에 대해 선택되었다.

단일 리포터 중화 분석으로 전환
단일 리포터 의 혈청 분석체를 중화 분석으로 변환하여 혈청 샘플을 첨가하기 전에 비즈와 함께 ACE2(경쟁 시약로서)를 사용하여 인큐베이션 단계를 추가하여 달성하였다. ACE2 첨가물의 양을 적시시킴으로써, 도 5에도시된 바와 같이, S 및 RBD 항원에 대한 IgG 결합의 억제가 관찰되었다. 11 명의 환자 세라가 IgG의 다른 티터를 가지고 있었지만, 각각 ACE2 농도가 증가함에 따라 MFI 신호가 현저한 감소를 보였습니다. 예상대로 ACE2는 S와 RBD의 MFI 신호에만 영향을 미치지만 Nc 항원은 영향을 미치지 않습니다.

모든 샘플에 대해 0 μg/mL ACE2를 기준으로 백분율 잔류 MFI 신호가 도 6에도시된다. 대부분의 시료의 경우, S및 RBD에 대해 신호 손실 >30%가 관찰되었으며 ACE2 농도가 증가하였다. 예상대로 NC 신호에 ACE2의 영향은 없었다.

이중 기자 IgG와 IgM 세로지컬 분석으로 전환
이중 기자 IgG와 IgM 분석의 경우, 표준 단일 기자 분석 조건은 두 리포터 채널에 대해 상이한 항체 및 기자 조합을 테스트하는 데 사용되었습니다. RP1 채널은 PE와 같은 리포터 염료에 대한 "주황색" 형광을 감지한 이전 유량 분석 기기와 유사합니다. 두 번째 채널인 RP2는 421-441 nm 범위에서 배출 스펙트럼 피크가 있는 402 nm에서 흥분되는 염료의 "파란색" 형광을 감지하는 데 사용할 수 있는 바이올렛 여기 레이저를 사용합니다.

몇몇 다른 항인간 IgG 및 IgM 항체 조합은 섹션 6에 상세한 표준 2,000 배 견본 희석 및 잠복 조건을 가진 각종 농도에서 시험되었습니다. RP2 채널용 DyLight 405 리포터 염료(DL 405; 400 nm에서 의 흥분 및 420 nm에서 배출)에 접합된 안티 IgM의 초기 테스트는 DFSO가 5일에서 >60일까지 11개의 PCR 양성 샘플 세트를 사용하여 수행되었으며, IgG-박탈 된 스럼 샘플. 이 검출 시약은 도 7A,B, C에도시된 바와 같이 RP2 채널에서 높은 신호를 생성하지 않았다. 높은 IgM RP2 MFI를 가진 견본을 위해, 가장 높은 신호는 RBD와 Nc(그림 7B,C)에대해 보였다. IgM 티터는 일부 샘플에서 이 시점에서 상승해야 하지만, 관찰된 MFI 수준은 IgM 검출 시약으로 140MFI 장치를 초과하지 않았습니다. 더욱이, IgM에 대한 제어 비드는 동일한농도(도 7D)에서사용되는 PE 라벨이 부착된 안티 IgM RP1 리포터에 비해 반대로 IgM에 공주된 DL 405를 사용할 때 MFI에 대한 상당한 동적 범위가 부족했다.

IgM에 적합한 RP2 리포터 라벨 검출 시약을 사용할 수 없기 때문에 SASB를 사용한 원래 비오틴 안티 이그G가 RP2 채널에서 사용하기 위해 테스트되었습니다. SASB를 갖는 RP2 채널에서 IgG에 대한 신호는 SAPE와 동일한 동적 범위를 가지고 있지 않았지만 여전히 S, RBD 및 Nc(그림 8)에대한 IgG 티터를 측정하기에 적합한 범위를 가지고 있었습니다. 이러한 데이터는 아래에 설명된 바와 같이 서로 다른 RP1 IgM 및 RP2 IgG 검출 시약 조합을 테스트하도록 이끌었습니다.

이중 기자 중화 분석으로 전환
이중 기자 혈청 분석체는 혈청 샘플을 첨가하기 전에 ACE2 및 구슬을 사용하여 인큐베이션 단계를 추가하여 중화 분석으로 변환되었습니다. 16 μg/ml에서 시작하여 2배 희석 시리즈ACE2가 사용되었고, 위에서 설명한 바와 같이 11개의 샘플 세트와 제거된 세라로 테스트하였다. 또한, RP1 IgM 및 RP2 IgG 검출 항체 믹스의 3가지 조합이 11개의 샘플 세트와 제거된 혈청 제어세트에서 테스트되었다. 최적으로 결정된 최종 조합 및 시약 농도는 표 1에상세하다.

IgG 검출을 위해, 원래 단일 리포터 분석에 사용된 비오틴 항인간 IgG/SASB는 BV 리포터 염료에 공주된 또 다른 안티 IgG와 함께 테스트되었다. BV 컨쥬게이트는 RP2 MFI 신호가 높았지만 IgG 티터의 MFI 신호 강도는 ACE2 적정(그림9A,C, E)에걸쳐 다양합니다. 비오틴 항인간 IgG/SASB 조합은 BV 컨쥬게이트에 비해 ACE2 적정전반에 걸쳐 보다 일관된 MFI 신호 감소가 있었으며, MFI 수준이 낮았지만 용량 반응을 입증하였다. ACE2 농도에 걸친 BV 컨쥬게이트에 의한 신호 변동은 또한 비오틴 항인간 IgG/SASB조합(도 9B,D, F)에비해 IgG 티터의 범위에 걸쳐 ACE2에 의한 백분율 억제를 결정하는 데 방해하였다. DFSO 3 샘플과 같은 MFI 신호가 낮은 샘플은 이러한 시약의 성능을 평가하거나 IgG 중화 용량을 측정하기에 충분한 티터가 없습니다.

RP1 채널에서 IgM 티터를 결정하기 위해, PE-컨쥬게이드 안티 IgM은 다이라이트 549 기자 염료(DL 549; 562 nm에서 발아 및 576nm)에 공주된 반인간 IgM과 비교하였다. 이들 두 시약 중 PE 안티-IgM은 테스트된 샘플에 대해 DL 549 항인간 IgM에 의해 생성된 것보다 더 높은 MF를나타냈다(그림 9A,C, E). 이러한 시약의 첨가를 측정하는 IgM 대조구는 PE 안티 IgM의 경우 평균 MF≈17,000, DL 549 컨쥬게이트의 경우 2,723개의 서로 다른 평균 MFIs를 가졌다. 이러한 차이에도 불구하고, MFI에 대한 다양한 ACE2 농도의 영향은 DL 549 컨쥬게이트로 측정할 수 있었습니다. IGM 결합의 ACE2% 억제를 결정하기 위해 두 IgM 검출 시약(도9B,D, F)사이에는미미하지만 미미한 차이가 있었다.

조합	기자	최종 농도 인 웰 (μg/mL)
		RP1	RP2
1	PE 안티 이그M	2	-
	비오틴 이그	-	0.62
	SASB	-	4
2	다이라이트 549 반인간 IgM	1	-
	브릴리언트 바이올렛 421 안티 휴먼 IgG	-	1
3	다이라이트 549 반인간 IgM	1	-
	비오틴 이그	-	0.62
	SASB	-	4

표 1: RP1 및 RP2 리포터 염료 조합 테스트 목록. 여러 가지 다른 RP1 및 RP2 리포터 염료는 IgG 및 IgM 티터를 측정하기 위해 평가되었습니다. 위에 표시된 세 가지 조합은 서로 다른 RP1 검출 모드와 중화 분석의 최적화를 위해 테스트되었습니다. SASB를 이용한 RP2 조합의 경우 생체화 검출 항체 및 SASB에 대한 농도가 표시됩니다. *최종 농도는 반응의 최종 농도를 잘 나타냅니다.

그림 1: 주요 분석 프로토콜 단계를 강조 표시하는 순서도입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 항원 커플링 확인. 항원들은 100, 10 및 1 pmol/10⁶ 구슬에 결합되었다. S 및 RBD 항원의 경우 토끼 항-S 세라가 PE 안티래빗 IgG로 사용되고 검출되었다. Nc의 경우, 단백질 G 정제 토끼 폴리클론 안티-NC가 사용되었다. 10 pmol S(A),100 pmol RBD(B),및 100 pmol Nc(C)와결합 된 구슬에 대한 적정 곡선이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 다른 항원 커플링 수준으로 혈청 희석의 최적화. 높은, 중간, 낮음 및 음의 샘플을 나타내는 혈청 샘플은 상이한 pmol 항원/10⁶ 비드 커플링으로 테스트하였다. 4배의 혈청 적정은 5항에 기재된 분석 프로토콜을 사용하여 항원 결합 구슬의 멀티플렉스 혼합으로 시험되었다. S(A),RBD(B),NC(C)에대한 적정 곡선의 MFI 값이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 최적의 혈청 희석 및 검출 시약 농도의 결정. 네거티브 환자(2샘플)와 저양성(6개 샘플)을 포함한 8개의 혈청 샘플은 3가지 검출 시약 농도를 가진 추가 혈청 희석제에서 시험되었다. MFI 결과는S(A),RBD(B),NC(C)에대해 표시됩니다. 이들 및 기타 데이터(도시되지 않음)에 기초하여, 1:2,000의 샘플 희석 및 0.62 μg/mL의 비오틴 검출 항체 농도가 선택되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 단일 기자 중화 분석의 최적화. 중화 항체 검출 분석에 대한 단일 리포터 의 세로지학적 분석의 수정은 제6항에 설명된 바와 같이 ACE2를 가진 인큐베이션 단계를 경쟁사로 추가하여 수행되었다. 저음에서 고양성 티터 세라에 이르는 11개의 샘플 과 IgG 스트라이프 혈청 샘플은 표준 분석 조건을 사용하여 4 μg/mL에서 시작하여 ACE2의 2배 희석 계열로 테스트되었습니다. ACE2 농도의 이 범위에 걸쳐, MFI의 감소는 S(A)및 RBD(B)에대한 증가 ACE2와 함께 볼 수 있지만 NC(C)에대한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: ACE2로 신호의 백분율 억제. 11개의 샘플 세트에 대한 백분율 잔류 신호(도4에서)가 표시됩니다. 각 샘플에 대해, IgG 티터에 관계없이, 최고 ACE2 농도에서S(A)및 RBD(B)에 대해 최대 ≥30% MFI 신호를 달성하였다. Nc항원(C)의경우 ACE2의 양이 테스트된 신호의 현저한 억제는 없었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: RP2 IgM 검출 시약으로 DyLight 405 안티 IgM의 테스트. 11개의 샘플과 IgG-박탈된 세라 세트를 사용하여 DL 405-공주 방지 IgM을 RP2 검출 시약으로 테스트했습니다. S(A),RBD(B),NC(C)에대한 RP2 IgM MFI 신호가 표시됩니다. 임의의 시료를 가진 모든 항원에 대한 가장 높은 MFI 신호는 샘플 H(B)를가진 RBD를 위한 대략 140MFI 단위이었습니다. IgM 대조군 비드 세트의 신호조차도 전체 항체 티터 범위에 걸쳐 RP2 채널에서 1,000MFI 미만이었고 RP1채널(D)에서PE 안티-IgM 검출 항체로 관찰된 증가된 동적 범위를 나타내지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 비오틴 안티 IgG와 RP2 리포터로 SASB의 최적화. 11개의 샘플 과 IgG-박탈세라 세트를 표준 0.62 μg/mL 비오틴 안티 IgG로 SASB의 희석 계열을 테스트하는 데 사용되었습니다. S(A),RBD(B),NC(C)용RP2 채널에서 생성된 IgG MFIs가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9: RP1 IgM 및 RP1 IgG 검출 믹스의 세 가지 조합의 비교. 3개의 다른 검출 항체 혼량은 11개의 견본및 IgG 박탈된 세라에 시험되었습니다. 사용되는 조합 및 최종 농도는 표 1에설명되어 있습니다. 모든 샘플은 16 μg/mL에서 시작하여 2배 의 ACE2 희석으로 테스트되었습니다. 3일, 12일 및 30일의 DFSO 샘플에 대한 데이터가 표시됩니다. RP1 IgM(주황색) 및 RP2 IgG(파란색)에 대한 MFI 신호는 A(DFSO 3), C(DFSO 12), E(DFSO 30)에 표시됩니다. ACE2% 잔류 MFI는 B(DFSO 3), D(DFSO 12), F(DFSO 30)에 표시됩니다. ACE2 컨트롤 없음과 비교하여 >30% 감소하는 신호는 밝은 녹색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 연구는 SARS-CoV-2^1에의한 감염에 대한 IgG 반응을 질적으로 평가하는 멀티플렉스 형광 마이크로스피어 분석3Flex의 기능을 확장시켰다. COVID-19에 대한 많은 혈청 분석이 단일 항원검출을 감지하지만, 이 분석은 동시에 S, RBD 및 Nc 항원을 평가하고 내부 항체 동형 대조군^7을포함한다. 또한, ACE2는 SARS-CoV-2로 의 중화 항체 티터를 검출하기 위한 지표로서 사용된다.

다중 항원 세포는 감염되고 예방 접종된 사람 사이 면역 반응을 차별하기 위한 미래에 특히 유용할 수 있습니다. SARS-CoV-2를 사용하면 S 및 RBD 항체만 평가하면 과거 감염 또는 예방 접종 항체 반응 때문인지 여부를 분별하는 것은 불가능합니다. 현재 사용 중인 백신 중 어느 것도 Nc 항원을 표적으로 하지 않으므로 S/RBD 및 Nc 항원을 평가하여 과거 바이러스 감염(Nc-및 S/RBD 양성)을 백신 접종 반응(S/RBD 양성만)과 구별할 수 있습니다. Nc-네거티브).

현재 연구에서는, 3Flex 서론및 중화 분석(섹션 5 및 6)이 새로운 이중 리포터 흐름 분석 기기(섹션 7 및 8)로 옮겨졌다. 비드 기반 멀티플렉스 분석용 전형적인 면역분석 프로토콜은 샘플 배양, 검출 항체/리포터 인큐베이션 및 결과^분석(8)에대한 유사한 단계에 따라 표준 ELISA 프로토콜과 유사하다. 이전 연구는 또한 표준 ELISA 에세이가 구드 기반 멀티플렉싱 플랫폼^9로전송될 수 있는 방법을 입증했습니다.

분석 프로토콜은 시험 샘플 및제어(도 4 및 도 5)에대해 얻은 결과에 의해 나타난 바와 같이 전작 단일 리포터 기기에서 새로운 이중 리포터 시스템으로 원활하게 전송될 수 있다. 세로지학적 분석에서, 모든 양성 혈청 샘플은 더 높은 시료 희석과 더 낮은 검출 항체 농도 모두에 대응하는 신호의 특징적인 투여 반응 감소를 입증한 반면, 음의 샘플에 대한 신호는 배경 수준에 머물렀다. 마찬가지로, 중화 분석의 경우, S와 RBD에 대한 신호 감소, 하지만 Nc, ACE2 경쟁자의 농도 증가에 대응하는 반면, IgG 박탈 혈청은 ACE2의 첨가에 의해 훨씬 덜 영향을 받았다. 혈청 시료를 첨가하기 전에 2분 동안 ACE2로 구슬을 사전 배양하여(섹션 6 과 8에 설명된 바와 같이), 또한 구슬을 ACE2 및 혈청과 동시에 결합하는 것과 비교하여 결과에 거의 차이가 없는 결과를 생성하였다(데이터는 도시되지 않음). 그러나, 구슬 플러스 ACE2 사전 배양 단계로 얻은 결과가 더 일관되었기 때문에 중화 분석 프로토콜(섹션 6 및 8)에 채택된 최종 절차였다.

이중 기자 시스템은 두 번째 형광 기자 채널을 통합하기 때문에 두 가지 아사약이 Isotyping assays로 변환되어 IgG와 IgM 응답을 동시에 측정했습니다. 유량 분석기의 이중 리포터 기능을 사용하면 각 샘플에 대한 멀티플렉스의 각 분석물의 각 분석체에 대한 두 개의 리포터 검출 시약으로부터 형광 신호의 수집을 허용하여 분석에서 샘플당 생성된 데이터를 효과적으로 두 배로 늘릴 수 있습니다. 이중 기자 분석 프로토콜의 개발 및 최적화를 위해, 여러 시판 되는 리포터 염료 및 검출 항체는 새로운 RP2채널(도 7 및 도 8)에대해 평가되어 사용 가능한 최선의 옵션을 결정하였다. DL 405 리포터 염료와 결합된 항-IgM 항체는 RP2 채널(도7)에서잘 수행되지 않았기 때문에 SASB를 가진 비오틴 안티-IgG는 이후 RP2 채널(도8)에서검출을 평가하였다. RP1 및 RP2 검출 시약의 3개의 조합은 이중 리포터 중화분석(표 1 및 도 9)에서비교하여 IgG 및 IgM 중화 항체의 동시 검출을 위한 최상의 성능 조합을 결정하였다. PE-anti IgM을 이용한 RP1 채널과 DL 549 안티-IgM을 이용한 RP2 채널 간의 신호 강도에는 상당한 차이가 있었지만, ACE2에 의한 퍼센트 결합 억제측정에는 큰 차이가 없었다.

현재 방법과이 연구에 몇 가지 제한이 인정됩니다. 먼저, 시험 및 방법 개발 및 최적화에 사용되는 샘플은 8-11 샘플 세트로 제한되었다. 확장된 연구에서 더 많은 샘플을 테스트하여 방법이 완전히 최적화되었는지 확인합니다. 둘째, 제한된 수의 기자 형광과 기자 쌍이 테스트되었습니다. 가능한 모든 조합에서 사용 가능한 모든 리포터를 추가로 테스트하면 이 방법으로 성공적으로 사용할 수 있는 시약을 결정합니다. 바이오틴에 공주된 안티-IgG 항체는 BV 421 리포터에게 공주된 안티-IgG 항체와 달랐다. 따라서 BV 421 항-IgG에 대한 신호 강도의 가변성이 존재하지만, 항체의 특이성 및 리포터 염료와 관련이 없을 수 있다. 다른 사용 가능한 BV 421-공주 항체를 테스트하면 RP2 채널에서 잘 수행될 다른 항체를 식별할 수 있다. 향후 연구는 또한 RP1 및 RP2에서 검출을 위해 BV 421 항인간 IgG와 PE 안티-IgM의 조합을 평가할 것입니다. 마지막으로, 기기의 이중 리포터 능력에도 불구하고, 분석은 반응당 2개의 등형(2개의 매개변수)으로 제한됩니다. 추가 동종형을 측정하거나 전체 isotyping이 원하는 경우 동일한 두 리포터 채널을 사용하는 추가 반응을 별도의 우물에서 실행해야 합니다.

비드 기반 멀티플렉싱 기술을 통해 일상적인 실험실 워크플로우^3,4,10에쉽게 구현할 수 있는 빠르고 유연한 분석 설계를 수행할 수 있습니다. 이 연구는 SARS-CoV-2에 대한 이전에 설명된 3Flex 세로지학적 및 중화 분석을 단일 리포터로 IgG를 측정하기 위한 유량 분석 시스템으로 옮기거나, 약간의 수정으로 두 명의 기자를 사용하여 IgG 및 IgM 응답을 모두 측정하는 용이함을 입증했습니다. 듀얼 리포터 옵션은 샘플 당 두 배의 데이터를 제공 할 수 있기 때문에 단일 리포터 플랫폼에 비해 명확한 장점이 있습니다. 적절한 리포터 염료 및 검출 항체를 통해 이중 리포터 유량 분석 기기에서 이소타이핑 분석분석을 쉽게 개발하고 수행할 수 있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ACE2 (human) (rec.)	AdipoGen Life Sciences	AG-40B-0192-3050
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-065-098
Bovine Serum Albumin	MilliporeSigma	A7888	Sigma-Aldrich
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator	Various
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom 폴리스티렌 NBS 마이크로플레이트	Corning	3650
Corning 96-well 마이크로플레이트 알루미늄 밀봉 테이프, 비멸균	Corning	6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ   단편 특이적	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ 특이적	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-506-129	단종되었지만 여러 공급업체에서 구할 수 있음
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate	ThermoFisher Scientific	62-4317-82
Fisherbrand 인큐베이팅 마이크로플레이트 셰이커	ThermoFisher Scientific	02-217-757	Fisher Scientific
염소 안티-래빗 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, PE	ThermoFisher Scientific	P-2771MP
Luminex 마그네틱 플레이트 분리기	Luminex Corporation	CN-0269-01
MagPlex 비드	Luminex Corporation	MC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 염소 안티-휴먼 IgM Fc5μ 특이적	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-116-129
Phosphate Buffered Saline	MilliporeSigma	P3813	Sigma-Aldrich
SARS Nucleocapsid Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56683	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Nucleocapsid Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56049	비접합, 토끼, 다클론성, 단백질 A 정제
SARS 스파이크 단백질 항체	Novos Biologicals	NB100-56047	비접합, 토끼, 다클론성, 단백질 G 정제
SARS 스파이크 단백질 항체	Novos Biologicals	NB100-56048	비접합, 토끼, 다클론성, 단백질 G 정제
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 항체, 토끼 MAb	SinoBiological	40150-R007
아지드화나트륨	밀리포어시그마	S2002	시그마-알드리치
스트렙타비딘, R-피코에리트린 접합체(SAPE)	ThermoFisher Scientific	S21388	프리미엄급
튜브 리볼버/로테이터	ThermoFisher Scientific	88881001
TWEEN 20	MilliporeSigma	P9416	시그마-알드리치
xMAP 항체 Couplng Kit	루미넥스 코퍼레이션	40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SE	루미넥스 코퍼레이션	INTELLIFLEX-DRSE-RUO