설명된 프로토콜은 HiBiT 수용체 결합 도메인 단백질 복합체를 생성하고 SARS-CoV-2 항체의 빠르고 민감한 검출을 위한 그것의 응용을 생성하기 위한 절차를 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
COVID-19 전염병의 출현은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 역학적 영향을 결정하기 위해 더 나은 혈청 학적 검출 방법의 필요성을 증가시켰습니다. SARS-CoV-2 감염의 증가 수는 더 나은 항체 탐지 소의를 위한 필요를 제기합니다. 현재 항체 검출 방법은 속도에 대한 감도를 손상시키거나 민감하지만 시간이 많이 걸립니다. SARS-CoV-2 중화 항체의 큰 비율은 SARS-CoV-2의 1차 면역원체 구획 중 하나인 수용체 결합 도메인(RBD)을 표적으로 한다. 우리는 최근에 SARS-CoV-2 항체를 검출하기 위하여 고과민한 생물 발광 태그 RBD (NanoLuc HiBiT-RBD)를 설계하고 개발했습니다. 다음 텍스트는 HiBiT-RBD 복합체를 생성하는 절차와 이 도구를 사용하여 RBD 표적화 항체의 존재를 평가하는 빠른 분석방법을 설명합니다. HiBiT-RBD 단백질 생성물의 내구성과 1시간 이내에 완료할 수 있는 실험 절차가 짧기 때문에, 이 프로토콜은 환자 혈청 시료에서 SARS-CoV-2 항체를 검출하는 보다 효율적인 대안으로 간주될 수 있다.
서론
새로운 코로나바이러스, SARS-CoV21의 최근 출현은 20212년 3월 30일 현재 2,800,000명 이상의 사망자와 1억 2,800만 건의 감염을 일으켰습니다. SARS-CoV-2 임상 치료에 대한 신뢰할 수 있고 잘 확립된 치료 절차의 부족으로 인해, 효과적이고 강력한 치료 또는 백신3을 개발하기 위해 더 많은 바이러스 전달및 더 중요한 것은 많은 노력을 하고있다. 현재까지 세계보건기구(WHO4)가 보고한 임상시험에서 50명 이상의 COVID-19 백신 후보가 있습니다. SARS-CoV-2에 대하여 항체의 검출은 COVID-195의 복구한 환자에서 뿐만 아니라 백신의 행정에 유머 반응의 장기적인 안정성을 결정하는 것이 가장 중요합니다. 일부 연구는 SARS-CoV-2 환자가 1 년 5,6,7,8,9 후에 RBD 결합 항체의 대....
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프로토콜
참고: 아래에 설명된 프로토콜은 프로토콜 코드 20200371-01H에 따라 모든 윤리 지침을 준수합니다.
1. HiBiT-RBD 바이오 리포터의 생산 및 평가
- HiBiT-RBD 바이오 리포터의 충분한 수량 생산
- 세포 배양 준비
- 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린/연쇄상 구균을 함유한 DMEM(DMEM)을 완성하십시오. 그런 다음, 37 °C 수조에서 미디어를 따뜻하게.
- 생물학적 안전 캐비닛(BSC)을 켜고 캐비닛 표면을 살균하기 위해 70% v/v 에탄올을 사용한다.
- 세포줄을 배양합니다.
- -80°C 또는 액체 질소로부터 세포줄을 꺼내 37°C 수조에서 해동하십시오.
참고: 적절한 세포주 배양에서 유지 하기 쉽고, 높은 형질 효율을 가지고 있으며, 외인 성 단백질 생산에 적합 합니다. 인간 배아 신장, HEK293 세포는 이 프로토콜을 위해 사용되었다. - 해동된 세포를 완전한 배지의 최소 10mL와 혼합하고, 셀 현탁액을 10cm 페트리 접시에 피펫하고, 접시에 세포를 균일하게 분배하기 위해 플레이트를 소용돌이시다. 37°C, 5% CO2 및 85-95% 습도의 세포 배양....
- -80°C 또는 액체 질소로부터 세포줄을 꺼내 37°C 수조에서 해동하십시오.
- 세포 배양 준비
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결과
HiBit-RBD 함유 세포 용해 및 전월체로부터의 신호(도 2)가 기록되어 적절한 단백질 공급원을 평가하였다. HiBiT-RBD와 LgBit는 별도로 컨트롤로 사용되었으며, 두 부분이 결합되었을 때 데이터가 강한 신호에 비해 낮은 배경을 보였습니다. 따라서, LgBiT와의 HiBiT-RBD 상호 작용은 기질 소화 및 생물 발광 활성을 위한 활성 효소를 생성하기 위해 필요하다(도 1).
단백질 G의 첨가는 항체 강수량에 도움이 될 것입니다 (도 3). 분석체는 시급SARS-CoV-2 중화 항체로부터의 신호를 대조군 IgG와 비교하는 데 사용되었다. 특정 항체 신호는 견고했고, 대조체 항체는 발광 배경 수준에 가까웠다(도 4A). 재조합 감쇠 된 종양용용성 성세포 구내염.......
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토론
SARS-CoV-2에 감염된 사람들의 증가와 글로벌 예방 접종을 위한 지속적인 노력은 대규모 혈청 조사에서 사용될 수 있는 민감하고 빠른 혈청학 시험을 필요로 합니다. 최근 연구에 따르면 나노루시피파아제 계 바이오리포터를 분할하여 이러한 소사를 개발할 수 있습니다. 최근에는 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 개발하여 빠르고 신뢰할 수 있는 방식으로 환자 혈청에서 SARS-CoV-2 특이적 항체를 검출하는 데 사용할 수 있는 테스트를 설계했습니다(도 4C).
이 분석서에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 시스템의 효율성은 RBD 단백질 발현에 따라 달라지므로 단백질 수준은 서부 블로팅에 의해 검증되어야 합니다. 더욱이, RBD에 대한 상용 항체, 및 음의 대조군 항체와 같은 양성 대조군을 사용해야 한다. Nanoluciferase 단백질의 추가는 생물 발광 검출을 위한 긍정적인 통제로 이용될 것을 추천합니다. 단백질 제품에는 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 샤오홍 허, 리카르도 마리우스, 줄리아 페트리크, 브래들리 오스틴, 크리스티안 타네즈 데 수자의 기술 적 도움을 주셔서 감사합니다. 그래픽 디자인에 대한 미나 가레마니에게도 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 참가하고 그들의 혈액 견본을 기증한 모든 개별에게 감사하고 싶습니다. DWC는 uOttawa 학부 및 의학과에 의해 부분적으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5x 패시브 용해 버퍼 | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex 휴대용 마그네틱 세척기 | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgtgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgtgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgcgattgattgattattgactagttattaatgt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaacaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtgtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatgcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 중화 항체, 마우스 Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| 트립신-EDTA | 써모 피셔 사이언티픽 | 2520056 | 0.25% |
참고문헌
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer. , Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021).
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F.
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