Method Article

생체멤브레인 포스 프로브 분광법에 의한 분자 스프링 상수 분석

DOI:

10.3791/62490

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체멤브레인 힘 프로브(BFP)는 시투 동적 힘 분광법(DFS) 기술이다. BFP는 살아있는 세포에 분자 상호 작용의 봄 상수를 측정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 BFP에 의해 검출된 분자 결합에 대한 스프링 상수 분석을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생체멤브레인 힘 프로브(BFP)는 최근 단일 분자 결합 운동학을 측정하고, 리간드 수용체 상호 작용의 기계적 특성을 평가하고, 단백질 동적 형성 변화를 시각화하고, 보다 흥미롭게도 해명 수용체 매개 세포 메카노센싱 메커니즘을 측정할 수 있는 토종 세포 표면 또는 시투 동적 힘 분광법(DFS) 나노툴로 부상했습니다. 최근에는 BFP가 분자 결합의 봄 상수를 측정하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 분자 스프링 상수 DFS 분석을 수행하기 위한 단계별 절차를 설명합니다. 특히 두 개의 BFP 작동 모드, 즉 비드 셀 및 비드 비드 모드에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 DFS 원시 데이터로부터 분자 결합 및 세포의 스프링 상수를 도출하는 데 중점을 둡니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

살아있는 세포 DFS 기술로, BFP는 인간 적혈구 (RBC)를 엔지니어; 그림 1) 0.1-3 pN/nm1,2,3의호환 스프링 상수 범위의 초감도 및 튜닝 가능한 힘 트랜스듀서로. 리간드 수용체 상호 작용을 조사하기 위해 BFP는 DFS 측정을 ~1 pN(10-12 N), ~3nm(10-9m), ~0.5ms(10-3s)로, 유효및 측두해상도 4,5에서가능하게 한다. 실험 구성은 프로브와 대상이라는 두 개의 반대 마이크로파이프로 구성됩니다. 프로브 마이크로피펫은 RBC를 흡인하고 비드는 비오틴 스트렙타비딘 상호 작용을 통해 정점에 붙어 있습니다. 비드는 관심의 리간드로 코팅된다(그림 1A). 대상 마이크로피펫은 비드셀(도1B)과비드비드(도1C)모드에 대응하는 관심 수용체를 베어링하는 셀 또는 비드(dad)를흡인한다.

BFP 시공, 조립 및 DFS 실험 프로토콜은 이전에1,6을상세히 기술하였다. 간단히, BFP 터치 주기는 5 단계로 구성되어 있습니다 : 접근, 임프, 접촉, 철회 및 해리(그림 1D). 수평 RBC 정점 위치는 ΔxRBC로표시됩니다. 처음에, 미스트레스(제로포스) RBC 변형 ΔxRBC는 0(표1)이다. 대상은 프로브 비드(그림 1D)에서충돌하고 철회하는 압조 번역기에 의해 구동됩니다. RBC 프로브는 먼저 음수 RBC 변형 ΔxRBC < 0으로 대상에 의해 압축된다. 본드 이벤트에서, 철회 단계는 압축에서 인장 상으로 전환되며, 양성 RBC 변형 ΔxRBC > 0(도2C 및 D). Hooke의 법칙에 따르면, BFP 베어링 힘은 F = kRBC × ΔxRBC로측정할 수있으며, 여기서 kRBC(표 1)는BFP의 RBC 스프링 상수이다. 본드 파열 및 원터치 사이클이 완료되면 프로브 비드는 ΔxRBC = 0(도1D)으로제로 포스 위치로 돌아갑니다.

kRBC를결정하기 위해, 우리는 RBC와 프로브 비드(도1A)사이의프로브 마이크로피펫 내부 오리피스(Rp),RBC(R0)및 원형 접촉영역(Rc)의반을 측정하고 기록한다. 그런 다음 kRBC는 에반의 모델(Eq. 1)7,8에 따라 BP(도S1A)8,9를작동시키는 가상 계측기(VI)역할을 하는 LabVIEW 프로그램을 이용하여 계산된다.

유체 역학에서 kRBC에 대한 정적 평형 방정식, 변수 및 로그 항을 보여줍니다. (Eq. 1)

BFP가 확립되고 DFS 원시 데이터가 얻어지므로, 이에 따라 리간드 수용체 쌍 또는 세포의 스프링 상수를 분석하는 방법을 제시한다. DFS 원시 데이터는 글리코처단백질 Thy-1 및 K562 세포 베어링 인테그린 α5 β1(thy-1-α5β1)의상호작용에 관한 것입니다. 도 3A 및 3B)10 및 피브리노겐 및 비드 코팅 인테그린 αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; 도 3C) 11,12는 각각 비드 셀 및 비드-비드 분석 모드를 시연하는 데 사용되어 왔다.

BFP 실험 준비
BFP 실험 준비 및 계측에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 프로토콜3을참조하십시오. 간단히 말해서, 인간 RBC는 탄소/중탄산염 완충제에서 비오틴-PEG3500-NHS를 사용하여 바이오티니징되었습니다. 관심있는 단백질은 인산염 완충제에서 MAL-PEG3500-NHS를 사용하여 보로실리케이트 유리 구슬에 공동으로 결합되었습니다. 생체작 RBC에 부착하기 위해, 프로브 비드는 또한 MAL-SA를 사용하여 스트렙타비딘(SA)으로 코팅된다. 재료 및 표 2의 테이블을 참조하십시오.

BFP(도1, 왼쪽)를조립하기 위해, '도우미'라고 불리는 세 번째 마이크로피펫은 프로브 비드를 전달하고 RBC의 정점1,3에접착제를 붙이는 데 사용됩니다. SA 코팅 프로브 비드와 바이오티니저드 RBC 사이의 공유 상호 작용은 리간드 수용체 의 결합보다 훨씬 강하다. 따라서, 해리시아트 단계는 RBC로부터 프로브 비드의 분리보다는 리간드 수용체 결합 파열로 해석될 수 있다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 분석 가능한 DFS 이벤트를 획득

  1. BFP 제어 및 파라미터설정(그림 S1A)에대한 소프트웨어(예: LabVIEW VI)에서 실험을 시작합니다.
  2. BFP모니터(도S1B)용소프트웨어에서 반복프로브 비드 표적 비드/셀 터치를 관찰한다.
  3. DFS 접착 이벤트의 89%≥ 89%가 단일 채권12,13,14에의해 중재되도록 하는 장애력 및 접촉 시간을 조정하여 처음 50터치 내에서 ≤ 접착주파수를 테스트하고달성한다.
    참고: 각 비드 셀/비드 쌍에 대해 200번의 반복적인 터치 사이클을 수행합니다. 게시 가능한 데이터 품질을 얻으려면 일반적으로 n ≥ 3 비드 비드 또는 비드 셀 쌍을 수행합니다.
    1. 데이터를 Force 대 Time 의 형태로 각 쌍의 끝까지 사용자 지시 폴더에 저장하여 BFP 제어 및 매개 변수 설정에 대한 소프트웨어의 메시지가 표시됩니다.
  4. BFP 획득플랫폼(도 S1C)을사용하여 도 2A에서예시된 바와 같이 본드 이벤트의 포스 대 시간 원시 데이터를 수집합니다.
    1. BFP 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다. 노란색 폴더 아이콘을 클릭하고 두 번 클릭하여 해당 원시 데이터 파일을 선택합니다.
  5. 프로그램을 실행한 다음 위쪽 및 아래 쪽 버튼을 클릭하여 이벤트 간에 전환합니다. 이상치 제외기준(그림 S2)을사용하여 잘못된 이벤트를 선별합니다. 내보내기 데이터 형식을 Force 대 시간 형식으로 선택하고 내보내기 플롯 데이터 단추를 클릭합니다.

2. 포스 대 시간 곡선을 포스 대 변위 곡선으로 변환

  1. 리트랙트 단계에 해당하는 데이터 세그먼트를 스프링 상수 분석과 관련된 스프레드시트(그림2A, 정사각형 윤곽)로내보냅니다.
  2. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 포스 대 시간 곡선을 플롯합니다. 포스 대 변위 곡선을 얻으려면 시간값(그림 2A,x-축)을 압조 이동 속도(예: 4,000 nm/s)로 시간 값을 배합하여 총 변위 값(Δx tot)으로변환합니다.
  3. 획득한 각 변위 값에서 가장 작은 변위 값을 빼서 첫 번째 데이터 점을 0으로 설정합니다. 이 수평 변환은 Retract 단계의 상승 하는 경사 또는 후속 스프링 상수 계산에 영향을 주지 않습니다.
  4. 특히, BFP는 RBC, ΔxRBC(표 1),분자 결합, Δxmol(표 1), 및 표적 셀, Δ x셀(표 1), Eq.2의 Δxtot(표 1)합계 변형이 있는 직렬 스프링 시스템으로 간주됩니다.
    정적 평형 방정식 Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, 수학 공식. (Eq. 2)
  5. 도 2B에도시된 바와 같이포스(F)대 변위(Δ xtot)곡선을 플롯한다.

3. 비드 셀 모드의 봄 Cnstant 분석

  1. 포스 대 변위 곡선에서는 각각 압축 상과 인장 상을 나타낼 수 있는 두 개의 뚜렷한 슬롭을 식별할 수 있습니다. 각 데이터그룹(도 2B)에회귀 선을 맞춥시면, 더 큰 선형 맞춤 경사가 압축 상에서 총 스프링 상수를 나타내는 경우(도2B, 빨간색), k1(표 1)으로표시됨); 그리고 더 작은 선형 맞춤 경사는 텐슬리상(도 2B,파란색)에서 총 스프링 상수를 나타내며( 도 2B, 파란색),k2(표 1)로기음부된다.
  2. 단계 당 계열로 연결된 스프링의 경우 2.2 설명, 총 스프링 상수,k토트(표 1)의상호계를 RBC, kRBC(표 1), 분자 결합, k몰(표 1),및 표적 셀,K셀(표 1)의합으로 표현한다. 비드 셀 모드의 압축 단계 동안 분자 결합이 늘어나지 않으므로 k몰을 고려하지 않습니다. 이 시나리오에서 K 토트의 상호(1/k1)가표현됩니다.
    생물학에서 세포 동역학을 나타내는 방정식; 운동 상수 다이어그램: k1, kRBC, kcell. (Eq. 3).
    예제 데이터에서 kRBC는 미리 결정됩니다(기본적으로 0.25 pN/nm). k셀은 획득된 k1 및 k RBC(도 3B)를가진 Eq. 3로부터 유래될 수 있다.
  3. 인장 단계 동안, 리간드 수용체 쌍 사이에 접착력이 형성된다. 이 시나리오에서 K토트의 상호를 표현 (1/k2)
    동역학 연구에 사용되는 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell을 보여주는 직렬 저항 방정식. (Eq. 4)
    여기서 k2 (표 1)는인장 상시 총 스프링 상수를 나타낸다.
  4. 1/k2에서 1/k1을 빼는 k몰을 파생시킵니다(Eq. 3 대 Eq. 4를 비교).

4. 비드 비드 모드의 봄 상수 분석

  1. 회귀 선을 압축 상 데이터에 맞게 k 1을 얻습니다(도 2B, 빨간색과유사). 참고로, 비드-비드 모드에서, 대상 셀은 관심 수용체로 코팅된 유리 비드로 대체된다(도1C). 비드 변형은 무시할 수 있기 때문에,1/k세포 용어는 Eq. 3 및 Eq. 4에서 그에 따라 제거될 수 있다. 압축 상(1/k1)의상호 K토트는 다음과 같이 표현될 수 있다.
    관계를 보여주는 방정식: 1/k1 = 1/kRBC; 생화학 분석에서 운동 속도 상수의 핵심입니다. (Eq. 5)
  2. 회귀 선을 인장 상 데이터에 맞추어 k2(도 2B, 파란색과유사)를 얻습니다. 인장 상(1/k2)의 상호 k토트는 다음과 같이 표현될 수 있다.
    반응 속도 방정식, 역속도 상수 다이어그램; 동역학 분석을 위한 k2, kRBC, kmol 항. (Eq. 6)
  3. 1/k2에서 1/k1을 빼는 k몰을 파생시킵니다(Eq. 5 대 Eq. 6을 비교).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품에서, 우리는 BFP 스프링 상수 분석의 프로토콜을 입증했다. 비드 세포 분석 모드의 경우, 프로브 비드상에 코팅된 글리코시드 단백질 Thy-1과 표적 K562 세포(Thy-1-integrin α5β1)에발현된 α5 β1 사이의 분자 결합의 k몰을 분석했다. 그림 3A) 10. k셀은 또한 비드 셀 모드(K562 셀)로부터 유래된다; 그림 3B). 비드 비드 모드의 경우, fibrinogen과 integrin αIIbβ3 (FGN-integrin αIIbβ3사이에 형성된 분자 결합; 도 3C) <...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

요약하자면, 우리는 DFS 원시 데이터를 전처리하고 BFP 비드 비드 및 비드 셀 분석 모드에서 분자 스프링 상수를 도출하기 위한 상세한 데이터 분석 프로토콜을 제공했습니다. 분자 및 세포 스프링 상수를 결정하는 데 필요한 생체 역학 모델 및 방정식이 제시됩니다. 상이한 통합이 연구되고 있기는 하지만, 비드-비드 모드와 비드셀 모드에 의해 측정된 k몰은 상당한 범위 차이를 가지고 있다(도3A 대 도 3C). 참고, 비드 비드 모드와 함께, 수용체는 유리 비드에 공유 연결됩니다. 대조적으로, 비드 셀 모드와 함께, 표면 수용체는 측정 된 k몰에가장 가능성이 영향을 미치는 기본 플라즈마 멤브레인 과 사이토 스켈레톤에 의해 적응된다.

데이터 품질 관리는 재현성을 보장하는 데 매우 중요합니다. 이를 위해 포스 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 현재 연구 결과에 관하여 보고하는 경쟁 관심사가 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

도움이 되는 토론을 위한 기요메 트로아데크, 하드웨어 컨설팅을 위한 지하오 왕, 시드니 제조 허브, 그레그 수안닝, 사이먼 링거에게 실험실 스타트업을 지원해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 호주 연구 위원회 디스커버리 프로젝트 (DP2000101970 - L.A.J.), NSW 심장 혈관 용량 구축 프로그램 (초기 중간 경력 연구원 그랜트 - L.A.J.), 시드니 연구 가속기 상 (SOAR - L.A.J.), 라마시오에 의해 지원되었다 티 재단 건강 투자 보조금 (2020HIG76 - L.A.J.), 국립 보건 및 의학 연구 위원회 아이디어 보조금 (APP2003904 - L.A.J.), 엔지니어링 시작 기금 및 주요 장비 계획의 시드니 학부 (L.A.J.). 라이닝 아놀드 주 호주 연구 위원회 DECRA 동료입니다 (DE190100609).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS)Uct, Specialties, llc4420-74-0유리 구슬 기능화
Anhy. 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907인산염 완충액 준비
BFP 데이터 수집 VILabVIEWBFP 제어 및 파라미터 설정
BFP 데이터 분석 VILabVIEWBFP 원시 데이터 분석
Biotin-PEG3500-NHS,JenKemA5026-1RBC 비오틴화
붕규산 유리 구슬Distrilab Particle Technology, 네덜란드9002유리 구슬 기능화
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA0336리간드 기능화
카메라 VILabVIEWBFP 모니터링
D-glucoseSigma-AldrichG7021Tyrode ' s 완충액 제제
HepesSigma-AldrichH3375Tyrode ' s 완충액 제제
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1유리 구슬 기능화
염화칼륨(KCl)Sigma-AldrichP9541Tyrode' s 완충액 제제
중탄산나트륨(NaHCO3)Sigma-AldrichS5761탄산염/중탄산염 완충액 제제; 티로드' s 완충액 제제
탄산나트륨(Na2CO3)Sigma-AldrichS2127탄산염/중탄산염 완충액 준비
물 염화나트륨(NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode' s 완충액 제제
인산나트륨 일염기성 일수화물 (NaH2PO4• H2O)Sigma-AldrichS9638인산염 완충액 제
제 Streptavidin-MaleimideSigma-AldrichS9415유리 구슬 기능화
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References

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