방법 논문

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

DOI:

10.3791/62492

⸱

2021년 7월 10일

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

이 논문에서

요약

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여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

초록

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Micropatterning은 자연적인 세포 대 세포 변이에서 발생하는 합병증을 우회하면서 세포 구획의 형태와 기능 사이의 연결을 연구하는 데 사용되는 세포 생물학 커뮤니티에서 확립 된 기술입니다. 세포 모양을 표준화하기 위해 세포는 3D 금형에 국한되거나 접착제 섬을 통해 접착제 형상을 제어합니다. 그러나 포토리소그래피와 딥 UV 에칭을 기반으로 하는 기존의 마이크로패턴 기술은 클린룸이나 특수 장비에 크게 의존합니다. 여기서 우리는 도일 외에서 변형된 적외선 레이저 보조 마이크로패터닝 기술(microphotopatterning)을 제시하여 시판되는 이미징 시스템으로 편리하게 설정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Nikon A1R MP+ 이미징 시스템을 사용하여 폴리 비닐 알코올 코팅 커버립의 사전 설정 영역을 축산하는 적외선(IR) 레이저를 통해 미크론 정밀도로 마이크로패턴을 생성합니다. 우리는 하드웨어 자동 초점이 장착되지 않은 시스템에서 고효율과 정확도로 자동화 된 패턴 제작을 가능하게하기 위해 사용자 정의 스크립트를 사용합니다. 우리는 이 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포가 독점적으로 부착하고 원하는 모양을 취하는 정의된 패턴을 초래한다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 셀 형상의 표준화로 인해 많은 수의 세포로부터의 데이터를 평균화할 수 있다. 고해상도 이미징 및 정량 분석과 결합된 이 프로토콜과 함께 생성된 패턴은 상대적으로 높은 처리량 스크린에 사용하여 형태와 기능 간의 연결을 중재하는 분자 플레이어를 식별할 수 있습니다.

서론

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세포 형상은 조직 형태발생1,세포 이동2,세포 증식3및 유전자 발현4와같은 근본적인 생물학적 과정의 주요 결정자이다. 세포 형상의 변화는 혈장 막과 세포 세포 및 세포 매트릭스 유착의 기하학과 같은 외장 적 인자를 변형시키는 세포 골격의 동적 재배열 사이의 복잡한 균형에 의해 구동된다5. 예를 들어, 중간엽 세포를 마이그레이션하는 것은 플라즈마 멤브레인을 앞으로 밀어 내고 넓은 라멜리포디아6을생성하는 최첨단 액틴 네트워크를 중합하고, actomyosin 수축은 세포의 좁은 후행 가장자리를 후퇴시켜 현재 위치7,8에서세포를 분리한다. 이러한 특수 시토셀레탈 구조를 초래하는 신호 이벤트를 방해하여 모양과 극성을 분산시키고 세포 이동9을느리게 합니다. 또한, 위화 중에 상피 시트굽힘은 세포와 이웃이 쐐기 모양10이되는 원인이 되는 actomyosin 기반 ....

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프로토콜

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1. 커버 슬립 전처리

  1. 워터맨 스토어, 1998년 25에설명 된 대로 삐걱 거리는 깨끗한 커버립을 준비합니다.
  2. 1% (3-aminopropyl) 트리메톡시실레인 (APTMS) 용액을 준비하고 부드러운 동요와 함께 10 분 동안 용액의 커버립을 배양. 커버립이 솔루션에서 자유롭게 이동해야 합니다.
  3. 워시 커버립은 dH2O로 각각 5분 씩 두 번 커버합니다.
  4. 0.5% 글루타랄데히드(GA) 용액을 준비하고 셰이커에서 30분 동안 용액의 커버립을 배양합니다. 25개의 커버립의 경우 50mL의 글루타랄데히드 용액을 사용하십시오. 커버립이 솔루션에서 자유롭게 이동해야 합니다.
  5. 워시 커버립은 dH2O로 각각 10분 씩 세 번 커버합니다.
  6. 맞춤형 커버슬립 스피너를 사용하여 30s의 드라이 커버립을 회전시합니다. 커버슬립 스피너에 대한 자세한 설명이26일 게시되었으며 온라인(https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/)에서 확인할 수 있습니다. 활성화된 커버립은 칸막이가 있는 상자에 +4°C에서 최대 1개월 동안 ....

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결과

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마이크로패터닝을 통해 얻은 실험 데이터의 품질은 패턴의 품질에 크게 좌우됩니다. 위의 방법으로 생성 된 패턴의 품질을 결정하기 위해 먼저 반사 현미경 검사를 사용하여 커버 슬립의 사진 압착 영역의 모양과 크기를 평가했습니다. 우리는 각 개별 패턴이 절제 마스크와 매우 유사하게 보였고 선명한 보더와 균일하게 빛을 반사하는 표면을 표시한 것으로나타났습니다(그림 2B). 원하는 사이토스켈레톤 아키텍처에 따라 다양한 모양과 크기를 인쇄할 수 있지만, 우리의 목적에 가장 적합한 석궁 모양을 사용했습니다. 원자력 현미경 검사법(AFM)은 이러한 패턴이 높이약 140nm이고전체(도 2F)에걸쳐 최소한의 토폴로지 변화로 매끄러운 표면을 가지고 있음을 밝혔다. 낮은 레이저 전력 및 잘못된 초점 평면과 같은 최적이 아닌 패터닝 설정은 고르지 않은 토폴로지(그림2C)를사용하여 어둡고 부분적.......

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토론

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상기 결과는 기술된 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포 형상 및 세포골격계 건축의 조작을 가능하게 하는 다양한 형상의 재현가능한 부착 패턴을 제공한다는 것을 보여준다. 마이크로포토패싱이 시작되기 전과 이후에 수많은 마이크로패턴 방법이 개발되었지만, 이 방법은 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, 일반적으로 엔지니어링 부서 내에서만 발견되는 특수 장비와 클린룸이 필요하지 않습니다. 사실, 다광현미경이 생물학 부서에서 더 흔한 광경이 되고 있기 때문에, 마이크로포토패터닝은 다광현미경의 적용을 확장하고 사용자의 잠재적인 풀에 추가합니다. 또한 패턴은 긴 리소그래피 프로세스를 수반하는 새 마스터 웨이퍼를 제작하는 대신 필요에 따라 변경하고 즉시 인쇄할 수 있습니다.

기존의 microphotopatterning 프로토콜에 비해, 우리의 프로토콜의 한 가지 개선은 커버 슬립 준비 중에 몇 가지 시간이 많이 걸리는 경화 단계를 제거하는 것입.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.

감사의 글

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이 작품은 S.P.에 Connaught 기금 새로운 조사상에 의해 지원되었다, 혁신을위한 캐나다 재단, NSERC 디스커버리 보조금 프로그램 (보조금 RGPIN-2015-05114 및 RGPIN-2020-05881), 맨체스터 대학과 토론토 대학 공동 연구 기금, 토론토 XSeed 프로그램 대학. C.T.는 NSERC USRA 펠로우십의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(3-Aminopropyl)trimethoxysilaneAldrich281778
10 cm 세포 배양 접시VWR10062-880폴리스테렌, TC 처리, 통풍
25X Apo LWD 물 담그는 목표NikonMRD77225
3.5 cm 세포 배양 접시VWR10861-586폴리스테렌, TC 처리, 통풍
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)Thermo622481mg/mL 디하이드로클로라이드 용액
소 세린 알부민BioShopALB005
Dulbecco's Phosphate-BufferedSaline Wisent311-425-CL
에탄올아민시그마-알드리치E9508
피브로넥틴시그마-알드리치FC0101mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin 항체BD610077마우스
피지ImageJ버전 1.53c
형광 팔로이딘인비트로젠A12380568nm
유리 커버슬립VWR16004-30222 × 22 mm
글루타르알데히드전자 현미경 과학1622025% 수용액
염산칼레돈6025-1-2937% 수용액
IR 레이저코히런트카멜레온 비전
미니멀 에센셜 매체 &알파;Gibco12561-056
마운팅 미디엄시그마F4680
마우스 2차 항체세포 신호 기술4408S염소, 488nm
다광자 현미경NikonA1R MP+
Myosin 경쇄 항체세포 신호 기술3672S토끼
NIS 요소Nikon버전 5.21.03
질산Caledon7525-1-2970% 수용액
PhotoshopAdobe버전 21.2.1
Pluronic F-127SigmaP2443분말
폴리(비닐 알콜)Aldrich341584MW 89000-98000, 98% 가수분해
토끼 2차 항체세포 신호 전달 기술4412S염소, 488nm
셰이커VWR10127-876아날로그 로커로도 알려진
수소화붕소나트륨알드리치452882분말
수산화나트륨시그마-알드리치S8045
인산나트륨 이염기성시그마S5136분말
인산나트륨 일염기성시그마S5011분말
스파이더아나콘다4.1.4
0.53mM EDTA를 함유한TrypsinWisent325-042-CL
0.05% 수용액

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
  2. Keren, K., et al. Mechanism of shape deter....

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