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방법 논문

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

2.9K 조회수

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DOI:

10.3791/62497

⸱

2021년 9월 25일

 ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.

초록

2000년 현재, 에드먼튼 프로토콜을 사용하여 췌장 이식의 성공은 여전히 몇 가지 장애물에 직면했습니다. 이들은 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수 및 면역 억제제의 장기 사용을 포함합니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) islet 같은 세포 생성의 대체 소스로 잠재적인 후보로 간주 되었습니다. 우리의 이전 보고서는 성공적으로 인슐린 생산 세포 (CFC)에 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 유도 프로토콜의 설립을 설명했다. 그러나 유도 효율은 크게 다양했습니다. 이 논문에서는 hDPSC 유래 IpC(hDPSC-IpC)를 전달하기 위한 통합(마이크로 환경 및 유전 조작) 및 비통합(microenvironmental 조작) 유도 프로토콜을 통한 hDPSCs 췌장 유도 효율의 비교를 시연합니다. 결과는 다중 복용량 포도당 도전에 3 차원 식민지 구조, 수율, 췌장 mRNA 마커 및 기능성 속성의 관점에서 유도 접근 둘 다에 대한 뚜렷한 유도 효율을 건의합니다. 이러한 사실 인정은 임상적으로 적용 가능한 IpC 및 췌장 계보 생산 플랫폼의 미래 설립을 지원할 것입니다.

서론

당뇨병은 지속적인 글로벌 관심사입니다. 국제 당뇨병 연맹(IDF) 보고서에 따르면 당뇨병의 전 세계 보급률은 2000년 1억 5,100만 명에서 2015년 4억 1,500만 명으로 증가할 것으로추정했다. 최신 역학 기지를 둔 연구 결과는 추정된 세계적인 당뇨병 보급이 2017년에 4억 5천1백만에서 2045년1년에693,000,000로 증가할 것이라는 점을 예측했습니다. 에드먼튼 프로토콜을 이용한 췌장적 이식의 성공은 2000년에 처음 입증되었으며, 내인성 인슐린 생산을 유지하고 I형 당뇨병 환자3에서노모글리세믹 상태를 안정화시키는 것으로 나타났다. 그러나 Edmonton 프로토콜의 적용은 여전히 병목 현상에 직면해 있습니다. 타입-I 당뇨병을 가진 각 환자는 적어도 2-4 islet 기증자를 필요로 하기 때문에 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수는 주요 문제점입니다. 더욱이, 면역억제제의 장기간 사용은 생명을 위협하는부작용4,5를유발할 수 있다. 이를 해결하기 위해 지난 10년간 당뇨병에 대....

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프로토콜

이 작품은 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 출라롱콘 대학 치과 학부인 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 인간 DPSC (hDPSC)는 사랑니 문제로 인해 노모와 어금니 모두에서 추출 된 인간의 치과 펄프 조직에서 분리되었다. 승인된 프로토콜(HREC-DCU 2018/054)에 따라 환자로부터 통보된 동의를 얻었다.

1. 통합 유도 프로토콜

  1. PDX1을 운반하는 렌티바이러스 벡터의 준비
    1. 바이러스 성 포장을 위해 인간 배아 신장 (HEK) 293FT 세포를 사용하십시오. 배양 및 DMEM의 변형 된 독수리 매체 (DMEM)에서 이러한 세포를 유지 하여 10% 태아 소 혈청 (FBS), 1 % L-글루타민, 1 % 항생제 - 항진성으로 보충.
    2. PDX1-렌즈바이러스벡터를 각각 10μg의 공동 배분하여 각각 포장 및 봉투 플라스미드와 표적 유전자 플라스미드의 20 μg을 헤K293FT 세포로 결합하여 칼슘 인산염 트랜스퍼션 시스템(예를 들어, psPAX2, pMD2)을 생성한다. G, 및 인간 pWPT-PDX111. 감염 시 세포가 80%-90% 컨실수 있는지 확인합....

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결과

이 문서에서는 유도 프로토콜의 결과를 비교했습니다. 두 유도 프로토콜의 다이어그램은 그림 2A,C에 설명되어있습니다. 두 프로토콜 모두에서, 평가는 가벼운 현미경으로 수행되었고, 이미지는 ImageJ로 분석되었다. hDPSC는 유도 프로토콜 모두에서 유도 첫날부터 식민지와 같은 구조를 형성할 수 있었습니다. 식민지의 형태는 둥글고 조밀했으며, 모든 식민지는 유도 기간 동안 배양 용기에 떠있었다(그림 2B,D). 두 프로토콜의 총 식민지 수도 결정되었다; 그 결과 통합 유도 프로토콜의 경우 전체 콜로니 수가 비통합 유도프로토콜(도 2E)에비해 약간 높았다는 것을 보여주었다. 그러나, 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 더욱이, 두 유도 프로토콜 모두에서 콜로니 크기 분포도 평가하였다(도

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토론

MsC에서 더 높은 IpC 생산을 달성하는 것은 당뇨병 치료에 필수적인 역할을합니다. 통합 프로토콜의 중요한 단계는 변환 및 변환된 세포의 품질에 사용되는 세포의 품질에 의존합니다. 성공적인 트랜스퍼션을 위해 확인해야 하는 몇몇 세포 요구 사항은 세포 건강, 세포 은행 관리 및 세포가 미상 활성 상태에 있다는 것을 보장하고 있습니다. 또한, 트랜스듀스 된 세포의 생존가능성을 모니터링하는 것도 중요한 역할을 한다. 덜 성공적인 트랜스듀션은 자극된 세포의 열악한생존력(12)에기인한다. 비통합 프로토콜의 경우, 형태학적 외관과 부동 식민지는 췌장 분화9의성숙과 관련이 있기 때문에 달성되어야 한다.

통합 유도 프로토콜에 대한 기술의 수정 및 문제 해결 측면에서, 건강하고 양질의 세포는 3-5 및 70%-80% 인플루엔자에 있는 세포를 사용하여 얻을 수 있으며, 유도된 세포의 품질은 다음 단계로 이동하기.......

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

SK, WR, QDL은 수의학 줄기세포 및 생명공학 연구단위인 라타다피섹톰포트 엔다우먼트 펀드, 출라롱콘대학교의 지원을 받았습니다. TO와 PP는2세기 프로젝트로 출라롱콘 학술 발전에 의해 지원되었다. CS는 수의학 학부의 보조금을 지원하는 연구에 의해 지원되었다, 출라롱콘 학술 발전 2세기 프로젝트, 수의학 줄기 세포 및 생명 공학 연구 단위, Ratchadaphiseksomphot 엔다우먼트 기금, 출라롱콘 대학, 정부 연구 기금.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Cell Culture
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific Corporation, 미국15240062
Corning® 60mm TC 처리 배양 접시Corning®
둘베코' ThermoFisher Scientific Corporation12800017
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Corporation10270106
GlutaMAX™Thermo Fisher Scientific Corporation35050061
인산염 완충 식염수(PBS) 분말, pH 7.4Sigma-AldrichP3813-10PAK가 포함된 PBS 용액 1L를 준비하는 데 1팩이 사용됩니다
.Thermo Fisher Scientific Corporation25200072
Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation
아미콘® Ultra-15 원심 필터Merck Millipore, 미국UFC910024
Human pWPT-PDX1 플라스미드Addgene12256Didier Trono의 선물; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256
Millex-HV 주사기 필터 유닛, 0.45  &마이크로; mMerck MilliporeSLHV033RB
pMD2.G 플라스미드Addgene12259Didier Trono의 선물; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259
폴리브레네 감염 / 트랜스펙션 시약Merck MilliporeTR-1003-G
psPAX2 plasmidAddgene12260Didier Trono의 선물; http://n2t.net/addgene:12260; RRID:
Addgene_12260Three-step Induction Protocol
Activin A 재조합 인간 단백질Merck MilliporeGF300
베타-메르캅토에탄올Thermo Fisher Scientific Corporation21985-023
소 혈청 알부민(BSA, Cohn fraction V, 지방산 무료)Sigma-AldrichA6003
글루카곤 유사 펩타이드(GLP)-1Sigma-AldrichG3265
인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS)Invitrogen41400-045
니코틴아미드시그마-알드리치N0636
비필수 아미노산(NEAA)Thermo Fisher Scientific Corporation11140-050
비처리 세포 배양 접시, 60mmEppendorf30701011
부티르산나트륨시그마-알드리치B5887
타우린시그마-알드리치T0625
430166 멸균 DDI 트립신-EDTA(0.25%)

참고문헌

  1. Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Danaei, G., et al.

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재인쇄 및 허가

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