이 프로토콜은 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 배혈구를 방출할 수 있는 배혈구를 생성할 수 있는 배혈구-발광식 CD34+ 조혈선 및 체외 분화 및 성숙을 얻는 데 관련된 모든 단계를 자세히 설명합니다. 이 절차는 거대 karyopoiesis를 통제하는 세포 및 분자 기계장치의 심층 분석에 유용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
자궁 내 의 팽창 및 발판을 연장하고 혈소판을 방출 할 수있는 거대 karyocytes로 인간의 조혈 선조의 분화는 혈소판 생물 발생의 메커니즘의 심층 연구를 할 수 있습니다. 사용 가능한 배양 프로토콜은 주로 골수 또는 코드 혈액에서 파생 된 조혈 선조에 기초하여 윤리적, 기술적, 경제적 우려를 제기합니다. 말초 혈액에서 CD34 세포를 얻기 위한 이미 유효한 프로토콜이 있는 경우에, 이 원고는 혈액 센터에서 쉽게 유효한 백혈구 필터에서 CD34+ 세포를 얻기 위한 간단하고 최적화된 프로토콜을 제안합니다. 이 세포는 8개의 혈액 기증에 대응하는 수혈 제품의 준비에 사용된 백혈구 필터에서 격리됩니다. 이러한 필터는 폐기해야 합니다. 이러한 필터에서 CD34+ 세포로 확인된 조혈 선조를 수집하는 상세한 절차가 설명되어 있습니다. 그들의 현상 진화를 토론하는 동안 proplatelet을 확장하는 성숙한 megakaryocytes를 얻는 방법 또한 상세합니다. 마지막으로, 프로토콜은 형태학적으로 그리고 기능적으로 네이티브 와 유사한 혈소판을 효율적으로 방출하기 위해 보정된 파이펫팅 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 기본 메커니즘을 해부하고 생체 내 혈소판 수율에 접근하는 과정의 다양한 단계에서 작용하는 약리학적 화합물을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.
서론
혈액 혈소판은 메가카요포이시스(MKP)로 알려진 상수 및 미세 조정 된 생산 공정에서 유래한 특수 대형 폴리플로이드 세포, 메가 카요사이클 (MK)에서 비롯됩니다. 이 과정의 정점에는 골수 환경(사이토카인, 전사 인자, 조혈 성 틈새)과 접촉하여 거대 핵증식 경로로 커밋할 수 있는 조혈선(HP)으로 증식하고 분화할 수 있는 조혈 줄기세포가있습니다. MKP의 주요 사이토카인인 다양한 사이토카인 및 특히 혈전포이에틴(TPO)의 영향하에서; MK는 다음 성숙의 두 가지 주요 단계를 겪습니다: 내막과 경계 막의 개발 (DMS). 이 완전히 성숙한 MK는 세포질 확장을 방출할 수 있는 부비동성 혈관에 가깝게 나타나며, 혈류하에서 방출되고 이후에 기능혈소판2로리모델링될 프로플라소판이 된다. 1994년3월 TPO의 복제는 HP 분화 및 MK 성숙을 허용하는 체외 배양 기술의 개발을 가속화함으로써 MKP 연구에 활력을 불어넣습니다.
혈소판 수(증가 또는 감소) 및 기능4,5의 관점에서 혈액 혈소판에 영향을 미치는 많은 병리들이
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프로토콜
제어 인간 샘플은 연구가 수행 된 수혈 센터에 의해 모집 서면 통보 동의를 준 volonteer 혈액 기증자로부터 얻어졌다 (Etablissement 프랑수아 뒤 상 - 그랜드 에스트). 모든 절차는 프랑스 고등 교육 연구부에 의해 등록및 승인되었으며 AC_2015_2371 번호에 따라 등록되었습니다.기부자는 연구 목적으로 샘플을 사용하기 위해 CODHECO 번호 AC- 2008 - 562 동의 서에 승인을 받았습니다. 헬싱키 선언에 따라 인간 연구가 수행되었다.
1. LRF에서 CD34+ 셀(HP)의 추출 및 선택
-
시약준비(LRF 1개)
- 여과 된 용출 버퍼 25 mL 준비 : 21.25 mL 의 인산 완충식 살린 (PBS), 산 성산 - 점막 - 덱스트로스 (ACD) 및 1.25 mL의 변형 된 태아 보빈 혈청 (FBS). 0.22 μm을 걸기하고 37 °C에서 놓습니다.
- 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 2mM로 PBS 500mL를 준비한다.
- 2개의 50mL 튜브에 25mL의 밀도 그라데이션 배지(DGM) (1.077 g/mL)를 폐기하십시오.
- LRF 백 플러싱 양식
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결과
LRF에서 CD34+ 셀 추출 및 선택
여기서, Peytour외. 9로부터유래된 방법은 백혈구 제거 후 혈액 은행에서 사용할 수 있는 버려진 LRFs로부터 CD34+ 세포의 추출 및 선택을 설명한다. 백플러시 절차에 따라, 보통 1.03 x 109 ± 2.45 x 108 세포/LRF(Mean±SEM; n =155)는 94.88 ± 0.10%의 생존율로 회복된다(그림2A i). CD34 양성 선택 후, 평균 615.54 x 103 ± 12.28 세포/LRF가 얻어진다(n =155)(도 2A ii). 셀 수가 300,000 미만인 경우 절차가 올바르게 수행되지 않았으며 중지해야 한다는 결론을 내릴 수 있어야 합니.......
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토론
이 프로토콜은 혈액 유래 HP로부터 프로플라판을 방출하고 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 MK를 생산하는 방법을 설명합니다. HP는 혈액 은행의 부산물인 LRF로부터 수득되며, 세포 혈액 제품에서 백혈구를 오염시키는 것을 제거하고 불리한 반응을 피하는 데 사용됩니다. 이 방법은 비교적 간단하지만 몇 가지 점은 특별한주의를 기울일 자격이 있습니다.
밀도 그라데이션 배지(Step 1.3.1)에 대한 세포 현탁액의 침착은 혼합물(적색 함량)을 피하기 위해 부드럽게 수행되어야 한다. 이 단계가 신중하게 수행되지 않으면 이 시점에서 프로토콜을 중지해야 합니다. 마찬가지로, 또한 1.3.1 단계에서 브레이크는 분수를 혼합하지 않도록 오프 모드에 있어야합니다. 그렇지 않은 경우 HP 선택을 중단해야 합니다. 프로토콜에 표시된 바와 같이 섹션 1.4에서는 PBMC 수집 후 프로시저를 중단할 수 있습니다. 이 경우, 세포는 4°C에서 하룻밤 사이에 교반하에 유지될 수 있다. 그런 다음 .......
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공개 사항
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감사의 글
이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR- 17-CE14-0001-1에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| 원심분리기 | Heraeus | Megafuge 1.OR | 또는 동등한 재료 |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | 또는 동등한 재료 |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | 또는 동등한 재료 |
| leuconostoc spp 의 Dextran; | Sigma | 31392-50g | 또는 동등한 재료 |
| DMSO Hybri-max | 시그마 | D2650 | |
| EDTA 0.5 m | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | 또는 이와 동등한 재료 |
| 여과 장치 Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| 유세포 분석기 | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | 또는 동등한 재료 |
| 층류 후드 | Holten | NA | 아카이브 제품 |
| LS Columms | 밀테니 바이오텍 | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| 펜 스트렙 글루타민 (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | 또는 동등한 재료 |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| 사전 분리 필터(30µ m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | 스템셀 기술 | #09650 | |
| 스테리컵 듀라포어 0,22&마이크로; m PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| 주사기 30 mL | Terumo | SS * 30ESE1 | 또는 동등한 재료 |
| 주사기 필터 Millex 0,22 µ M PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| 튜브 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | 또는 동등한 재료 |
| 튜브 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | 또는 동급 재료 |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | 또는 동급 재료 |
참고문헌
- Deutsch, V. R., Tomer, A. Megakaryocyte development and platelet production. British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).
- Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Natu....
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재인쇄 및 허가
