방법 논문

애플 펄프에서 플루오-4/AM으로 세포질 Ca2+ 염색

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DOI:

10.3791/62526

⸱

2021년 11월 6일

 ,  ,  , 
1College of Horticulture, Qingdao Agricultural University

이 논문에서

요약

사과 펄프 세포의 분리된 전형세포는 세포질 Ca2+ 농도를 검출하기 위해 칼슘 형광 시약으로 적재되었다.

초록

사이토솔릭 Ca2+는 식물 개발에 중요한 역할을 합니다. 칼슘 이미징은 세포질에서 Ca2+의 동적 변화를 감지하는 가장 다양한 방법입니다. 이 연구에서는 효소 가수분해에 의해 펄프 세포의 생존 가능한 전도를 얻었습니다. 격리된 프토프러스트들은 37°C에서 30분 동안 소분자 형광 시약(Fluo-4/AM)으로 배양되었다. 형광 프로브는 성공적으로 염색 된 세포색 Ca2 + 그러나 vacuoles에 축적되지 않았습니다. La3+,Ca2+ 채널 차단제, 세포질 형광 강도 감소. 이러한 결과는 Fluo-4/AM이 과일 육체에서 세포색 Ca2+의 변화를 감지하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다. 요약하자면, 우리는 과일의 살 세포로부터 프톱서를 효과적으로 분리하고 펄프 세포의 세포질에 소분자 칼슘 형광 시약을 적재하여 Ca2+를 검출하는 방법을 제시한다.

서론

Ca2+ 식물 신호 변환 및 신진 대사 에 중요 한 역할을1,2. 또한, 저장5,6동안 경도, 당도 및 생리장애에 대한 감수성을 포함한 과일 품질 특성3,4를조절한다. 세포질 Ca2+ 신호 변환에 중요 한 역할을 하 고 식물 성장 및 개발을 조절7. 세포칼슘 항상성의 교란은 사과8,배9의갈색 반점 질환,토마토(10)의배부패에 쓰라린 구덩이를 유도할 수 있으며, 과일 품질에 영향을 미치고 심각한 경제적 손실을 유발할 수있다 3,11. 칼슘 이미징은 충분한 공간 적 및 시간적 해상도를 가지며 살아있는 세포12,13에서Ca2+ 역학을 관찰하는 중요한 방법입니다.

현재, 살아있는 세포에서 세포내 칼슘 이미징을 위한 두 가지 주요 방법이 있다: 하나는 화학적 소분자 형광프로브(14)를채택하고, 다른 하나는 유전자 인코딩 센서(GECI)15,16이다. 과일 나무에 안정적인 형질 전환 시스템을 확립하고 더 긴 과일 발달의 어려움을 감안할 때, GECIS는 과일 Ca2 + 형광 화상 진찰에 적합하지 않습니다.

플루오-4/AM과 같은 소분자 형광 프로브는 특별한 장점이 있습니다: 그들의 AM 에스테르 형태(세포 투과성 아세톡시메틸 에스테르 유도체)는 형질, 급속및 비 세포독성17을만드는 형질이 없는 살아있는 세포에 쉽게 대량으로 적재될 수 있다. 플루오-4/AM은 피루스 피리폴리아18과 페투니아,19의 꽃가루 튜브에 성공적으로 적재될 수 있을 뿐만 아니라 가드셀(20)과 아라비도시스(21)의루트 모발에 탑재될 수 있다.

현재, 펄프세포(22)의칼슘 형광 염색에 대한 보고는 거의 없다. 중요한 미네랄 요소로서 칼슘은 사과와 같은 나무 과일의 성장과 품질 관리에 중요한 역할을 합니다. 사과 나무는 전 세계적으로 중요한 경제 종으로 인식되고, 사과는 건강한 음식으로 간주됩니다23. 이 연구에서는 효소 가수분해를 통해 사과 과일 펄프에서 실행 가능한 전도를 얻은 다음 소분자 형광 시약을 세포질에 로드하여 Ca2+를검출했습니다.

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프로토콜

1. 프토플라스트 추출

  1. 기본 용액 준비: 20 mM CaCl2,5 mM 2-(N-morpholino)에탄술포닉산, 0.4 M D-소르비톨.
    참고: 기본 용액의 pH는 0.1M Tris 버퍼로 5.8로 조정되고 0.22 μm 수용성 필터를 통해 여과하고 4°C에 저장하였다.
  2. 효소 용액 준비: 0.3%(w/v) Macerozyme R-10 및 0.5%(w/v) 셀룰라아제 R-10을 기본 솔루션과 함께 혼합합니다.
  3. 1.5mL 원심분리기 튜브에 0.5mL의 효소 용액을 추가합니다. 건강하고 잘 익은 사과를 선택하십시오. 그런 다음 펄프를 10 x 5 x 1mm3 크기(그림 1A-1C)로슬라이스합니다.
  4. 사과 과일 펄프 조각을 효소 용액을 함유한 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣은 다음튜브(그림 1D)를닫습니다.
  5. 1 h에 대 한 28°C에서 튜브를 배양 하 고 어둠 속에서 셰이커에서 70 rpm/min에서 흔들.
  6. 펄프 조각을 씻으시면 됩니다. 모든 효소 솔루션을 흡인한 다음 기본 솔루션의 0.5mL를 추가합니다.
  7. 실온에서 2 분 동안 300 x g의 원심 분리기.
  8. 프토플라스트 서스펜션을 얻으려면 원심분리관의 바닥에서 용액을 흡인한다(도1E).

2. 소분자 칼슘 이온 형광 염색

  1. 플루오-4/AM 로딩 솔루션을 1:1:2비율로 2mM 플루오-4/AM, 20% F-127, 10배 인산완충식(PBS:80m MM Na2HPO4,1.36M NaCI, 20mM KH2PO4,26mM KCI)으로 준비한다.
  2. 플루오-4/AM 로딩 용제 1μL을 1.5mL 원심분리기 튜브에 존재하는 프토플라스트 서스펜션의 99 μL에 추가합니다. 형광염의 최종 농도가 5 μM인지 확인하십시오.
  3. La3+ 처리: 프토플라스트 서스펜션의 98 μL, 10mM La3+ 1 μL, 플루오-4/AM 로딩 솔루션 1μL로 100 μM La3+용액을 준비합니다. 용액을 섞고 튜브를 닫습니다.
  4. 어둠 속에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
  5. 상온에서 2 분 동안 300 x g에서 원심 분리로 프토플라스트를 씻으시면 됩니다. 용액의 70 μL을 흡인하고 기본 용액의 70 μL을 추가합니다.
  6. 37°C에서 37°C의 프로토프스트 서스펜션을 30분 동안 배양하여 완전히 스테스테리프를 제거합니다.
  7. 프토플라스트 서스펜션의 15 μL을 흡인하고 슬라이드에 떨어뜨립니다.
  8. 형광 현미경(보충 도서 S1)에서관찰하십시오.
    참고: 3.45 μm 픽셀 해상도의 3.2 MP(2048 x 1536) CMOS 센서와 같은 고감도컬러 카메라를 사용합니다.
  9. 이미징(20x)을 위해 GFP 채널을 선택합니다. 밝기를 0.5로 설정합니다.
    참고: 조명은 통합 된 하드 코팅 필터 세트와 조절 강도 LED 라이트 큐브입니다. 플루오-4/AM의 흥분 파장은 490 nm입니다.

3. 확률 성생존 분석

  1. 플루오레세인 디아세테이트(FDA) 재고 용액 준비: 최종 농도가 1 mg/mL가 될 때까지 아세톤에 FDA를 용해하십시오.
  2. 주식 용액 의 1 μL 및 아세톤의 99 μL로 FDA 작업 솔루션을 준비하십시오.
  3. 99 μL의 프토플라스트 서스펜션에 FDA 작동 솔루션 1μL을 추가합니다. 위아래로 파이프팅하여 용액을 섞은 다음 튜브를 닫습니다.
    참고: FDA의 최종 농도는 100 μg/L입니다.
  4. 어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 얼룩.
  5. 슬라이드를 준비하고 형광 현미경으로 관찰하십시오.
  6. 이미징을 위한 GFP 채널을 선택합니다(그림1F).

4. 이미지 분석

  1. 이미지 분석 및 스프레드시트 소프트웨어(예: 이미지 프로 플러스 및 Excel 2010)를 사용하여 획득한 이미지를 분석합니다.
  2. 형광강도(보충 도서 S2)를계산하기 위해 프톱서스트에서 두 개의 수직 직경을 선택합니다. 다른 치료하에서 모든 프토플라스트의 형광 강도를 측정하여 측정했습니다. 최종 처리를 위해 사진 편집 소프트웨어를 사용합니다.

5. 통계 분석

  1. 통계소프트웨어(보충 도S3)를사용하여 통계 분석을 수행합니다. 데이터는 평균 ± SD에 표시됩니다. 학생의 t-시험은실험 그룹 간의 차이점을 분석하는 데 사용되었습니다.

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결과

상술한 프로토콜에 따라, 우리는 펄프(도1)로부터실행 가능한 프톱라스트를 얻기 위해 효소 방법을 사용했다. 일부 프톱라스에는 바쿨올레가 있었고, 다른 프로토프라스는 그렇지 않았다. Protoplasts는 Ca2+ 형광 표시등이 그(것)들에 로드되지 않았을 때 형광을 전시하지 않았습니다. 플루오-4/AM이 프토플라스트에 적재되었을 때, 세포질은 바쿨올이 아닌 형광이되었다(그림 2). 이 결과는 Fluo-4/AM이 세포질에서 Ca2+ 를 성공적으로 염색하고 구획화가 관찰되지 않았다는 것을24로나타냈습니다. 프토플라스트는 FDA로 5분 동안 염색되었고 세포질 형광을 보였습니다. 이것은 고온 (37 °C)이 확률 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냈다.

La3+,Ca...

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토론

이 연구에서는, 생존 성 전도는 효소 가수 분해에 의해 얻어졌다. 이 방법은 신선한 사과를 필요로합니다. 본 프로토콜은 연구 연구에 사용하기 위해 과일 펄프에서 많은 수의 프토플라스트를 신속하게 격리할 수 있게 합니다. 이 방법의 적용가능성은 '후지'에 만전을 기하지 않습니다. '두난'과 '꿀 크리스프'의 사과 펄프의 프톱스트도 동일한프로토콜(보충 도면 S4)을통해 추출할 수 있다. enzymolysis 후 프로토프스트 용액은 세포 파편을 포함, 이는 이전 방법에 비해 다소 향상되었다. 필수 세포 재료로서, 사과 펄프 프롬프는 세포 단백질 발현 기술, 단세포 염기서열 분석 및 기타 연구에 사용될 수 있다.

식물세포(30)에서화학형 성소 시약 염색에 관한 많은 방법이 있다. 예를 들어, 플루오-3/AM은 저온(4°C)으로 적재되어 루트 팁셀(31)을입력하였다. 플루오...

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공개 사항

저자는 이 문서의 내용과 이해상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 사업은 산동성 농업다양성개선사업(2019LZGC007)과 산동현대농업산업기술시스템(SDAIT-06-05)의 과일나무 혁신팀이 지원했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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10× 인산염 완충 식염SolarbioP1022PBS (인산염 완충 용액)는 인산염 완충 용액으로 비교적 안정적인 이온 환경과 pH 완충 용량을 제공 할 수 있습니다. 분자 클로닝 및 세포 배양을 위해 생물학에서 자주 사용되는 완충 염 용액입니다. pH는 7.4입니다.
2- (N- 모르 폴리노) 에탄 술폰산SolarbioM8010생물학적 완충제
CaCl 2 < / sub>· 2H2OSolarbioC8370염화칼슘 이수화물은 대부분 과립 형태의 흰색 또는 회색 화학 물질입니다.
셀룰라아제 R-10Yakult HonshaMX7352식물 세포벽을 저하시킵니다.
D-소르비톨SolarbioS8090보습 특성이 우수하고 건조를 방지하며 설탕, 소금 등이 결정화되는 것을 방지합니다.
F-127Thermo Fisher ScientificP6867Pluronic F-127은 비이온성 계면활성제 폴리올(분자량 약 12500 Daltons)로, 생리학적 매체에서 수불용성 염료 및 기타 물질의 용해를 촉진하는 데 도움이
FDAThermo Fisher ScientificF1303FDA는 형광을 활성화하는 데 필요한 효소 활성과 형광 제품의 세포 내 유지에 필요한 세포막 무결성을 모두 측정하는 생존 프로브 역할을 할 수 있는 세포 투과성 에스테라제 기질입니다. 
Fluo-4/AMThermo Fisher ScientificF14201녹색 형광 칼슘 지시약 Fluo-4/AM은 칼슘 지시약 Fluo-3/AM의 개선된 버전입니다. Fluo-4/AM은 더 빠르게 로드되고 동일한 농도에서 더 밝습니다. 488nm 아르곤 이온 레이저로 잘 여기할 수 있습니다.
형광 현미경Thermo FisherEVOS Auto 2형광 이미지를 관찰하십시오.
Macerozyme R-10Yakult HonshaMX7351식물 조직을 분해하여 단일 세포를 분리합니다.
트리스SolarbioT8060생화학 및 분자 생물학 실험에서 완충액 제조에 널리 사용됩니다.
수 되는 것으로 밝혀졌습니다.

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