애플 펄프에서 플루오-4/AM으로 세포질 Ca2+ 염색

요약

사과 펄프 세포의 분리된 전형세포는 세포질 Ca²⁺ 농도를 검출하기 위해 칼슘 형광 시약으로 적재되었다.

초록

사이토솔릭 Ca^2+는 식물 개발에 중요한 역할을 합니다. 칼슘 이미징은 세포질에서 Ca^2+의 동적 변화를 감지하는 가장 다양한 방법입니다. 이 연구에서는 효소 가수분해에 의해 펄프 세포의 생존 가능한 전도를 얻었습니다. 격리된 프토프러스트들은 37°C에서 30분 동안 소분자 형광 시약(Fluo-4/AM)으로 배양되었다. 형광 프로브는 성공적으로 염색 된 세포색 Ca^{2 +} 그러나 vacuoles에 축적되지 않았습니다. La^3+,Ca²⁺ 채널 차단제, 세포질 형광 강도 감소. 이러한 결과는 Fluo-4/AM이 과일 육체에서 세포색 Ca^2+의 변화를 감지하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다. 요약하자면, 우리는 과일의 살 세포로부터 프톱서를 효과적으로 분리하고 펄프 세포의 세포질에 소분자 칼슘 형광 시약을 적재하여 Ca^2+를 검출하는 방법을 제시한다.

서론

Ca²⁺ 식물 신호 변환 및 신진 대사 에 중요 한 역할을^1,2. 또한, 저장^5,6동안 경도, 당도 및 생리장애에 대한 감수성을 포함한 과일 품질 특성^3,4를조절한다. 세포질 Ca²⁺ 신호 변환에 중요 한 역할을 하 고 식물 성장 및 개발을 조절^7. 세포칼슘 항상성의 교란은 사과^8,배^9의갈색 반점 질환,^{토마토(10)의}배부패에 쓰라린 구덩이를 유도할 수 있으며, 과일 품질에 영향을 미치고 심각한 경제적 손실을 유발할 수^{있다 3,11.} 칼슘 이미징은 충분한 공간 적 및 시간적 해상도를 가지며 살아있는 세포^12,<....

프로토콜

1. 프토플라스트 추출

1. 기본 용액 준비: 20 mM CaCl_2,5 mM 2-(N-morpholino)에탄술포닉산, 0.4 M D-소르비톨.
   참고: 기본 용액의 pH는 0.1M Tris 버퍼로 5.8로 조정되고 0.22 μm 수용성 필터를 통해 여과하고 4°C에 저장하였다.
2. 효소 용액 준비: 0.3%(w/v) Macerozyme R-10 및 0.5%(w/v) 셀룰라아제 R-10을 기본 솔루션과 함께 혼합합니다.
3. 1.5mL 원심분리기 튜브에 0.5mL의 효소 용액을 추가합니다. 건강하고 잘 익은 사과를 선택하십시오. 그런 다음 펄프를 10 x 5 x 1mm³ 크기(그림 1A-1C)로슬라이스합니다.
4. 사과 과일 펄프 조각을 효소 용액을 함유한 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣은 다음튜브(그림 1D)를닫습니다.
5. 1 h에 대 한 28°C에서 튜브를 배양 하 고 어둠 속에서 셰이커에서 70 rpm/min에서 흔들.
6. 펄프 조각을 씻으시면 됩니다. 모든 효소 솔루션을 흡인한 다음 기본 솔루션의 ....

결과

상술한 프로토콜에 따라, 우리는 펄프(도1)로부터실행 가능한 프톱라스트를 얻기 위해 효소 방법을 사용했다. 일부 프톱라스에는 바쿨올레가 있었고, 다른 프로토프라스는 그렇지 않았다. Protoplasts는 Ca²⁺ 형광 표시등이 그(것)들에 로드되지 않았을 때 형광을 전시하지 않았습니다. 플루오-4/AM이 프토플라스트에 적재되었을 때, 세포질은 바쿨올이 아닌 형광이되었다(그림 2). 이 결과는 Fluo-4/AM이 세포질에서 Ca²⁺ 를 성공적으로 염색하고 구획화가 관찰되지 않았다는 것을^24로나타냈습니다. 프토플라스트는 FDA로 5분 동안 염색되었고 세포질 형광을 보였습니다. 이것은 고온 (37 °C)이 확률 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냈다.

La^3+,Ca^.......

토론

이 연구에서는, 생존 성 전도는 효소 가수 분해에 의해 얻어졌다. 이 방법은 신선한 사과를 필요로합니다. 본 프로토콜은 연구 연구에 사용하기 위해 과일 펄프에서 많은 수의 프토플라스트를 신속하게 격리할 수 있게 합니다. 이 방법의 적용가능성은 '후지'에 만전을 기하지 않습니다. '두난'과 '꿀 크리스프'의 사과 펄프의 프톱스트도 동일한프로토콜(보충 도면 S4)을통해 추출할 수 있다. enzymolysis 후 프로토프스트 용액은 세포 파편을 포함, 이는 이전 방법에 비해 다소 향상되었다. 필수 세포 재료로서, 사과 펄프 프롬프는 세포 단백질 발현 기술, 단세포 염기서열 분석 및 기타 연구에 사용될 수 있다.

식물^{세포(30)에서}화학형 성소 시약 염색에 관한 많은 방법이 있다. 예를 들어, 플루오-3/AM은 저온(4°C)으로 적재되어 루트 팁^셀(31)을입력하였다. 플루오.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10× 인산염 완충 식염	Solarbio	P1022	PBS (인산염 완충 용액)는 인산염 완충 용액으로 비교적 안정적인 이온 환경과 pH 완충 용량을 제공 할 수 있습니다. 분자 클로닝 및 세포 배양을 위해 생물학에서 자주 사용되는 완충 염 용액입니다. pH는 7.4입니다.
2- (N- 모르 폴리노) 에탄 술폰산	Solarbio	M8010	생물학적 완충제
CaCl 2 < / sub>· 2H2O	Solarbio	C8370	염화칼슘 이수화물은 대부분 과립 형태의 흰색 또는 회색 화학 물질입니다.
셀룰라아제 R-10	Yakult Honsha	MX7352	식물 세포벽을 저하시킵니다.
D-소르비톨	Solarbio	S8090	보습 특성이 우수하고 건조를 방지하며 설탕, 소금 등이 결정화되는 것을 방지합니다.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127은 비이온성 계면활성제 폴리올(분자량 약 12500 Daltons)로, 생리학적 매체에서 수불용성 염료 및 기타 물질의 용해를 촉진하는 데 도움이
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA는 형광을 활성화하는 데 필요한 효소 활성과 형광 제품의 세포 내 유지에 필요한 세포막 무결성을 모두 측정하는 생존 프로브 역할을 할 수 있는 세포 투과성 에스테라제 기질입니다.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	녹색 형광 칼슘 지시약 Fluo-4/AM은 칼슘 지시약 Fluo-3/AM의 개선된 버전입니다. Fluo-4/AM은 더 빠르게 로드되고 동일한 농도에서 더 밝습니다. 488nm 아르곤 이온 레이저로 잘 여기할 수 있습니다.
형광 현미경	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	형광 이미지를 관찰하십시오.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	식물 조직을 분해하여 단일 세포를 분리합니다.
트리스	Solarbio	T8060	생화학 및 분자 생물학 실험에서 완충액 제조에 널리 사용됩니다.

수 되는 것으로 밝혀졌습니다.