방법 논문

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

DOI:

10.3791/62532

⸱

2021년 4월 20일

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1Department of Genetics and Genomics, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

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신경 수지상 형태는 종종 기능의 근간을 이수합니다. 실제로, 뉴런의 발달에 영향을 미치는 많은 질병 프로세스는 형태학적 표현형으로 나타납니다. 이 프로토콜은 그대로 수지상 식소및 연관된 척추를 분석하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다.

초록

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뇌 활동, 신경 사이 전달 된 전기 화학 신호, 신경 네트워크의 연결 패턴에 의해 결정, 그리고 이러한 뉴런 내에서 프로세스 및 하위 구조의 형태에서. 따라서 뇌 기능에 대해 알려진 많은 것들이 뇌에서 뉴런이 조직되고 연결되는 방법에 대한 추가 통찰력을 허용하는 이미징 기술의 발전과 함께 발생했습니다. 조직 정리의 개선은 두꺼운 뇌 조각의 고해상도 이미징을 허용, 형태 학적 재건을 용이하게하고 신경 하위 구조의 분석, 수지상 식소 및 척추와 같은. 이미지 처리 소프트웨어의 발전은 대규모 이미징 데이터 집합을 신속하게 분석하는 방법을 제공합니다. 이 작품은 CLARITY 조직 클리어링, 공초점 현미경 검사및 이미지 분석을 사용하여 고해상도로 표지된 신경 조직의 두꺼운 조각을 처리, 시각화 및 분석하는 비교적 빠른 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 건강한 두뇌를 특징짓는 연결 패턴 및 신경 형태학및 병들인 두뇌 상태에서 생기는 이 특성에 있는 변경을 이해하기 위한 노력을 촉진할 것입니다.

서론

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복잡한 3차원 생물학적 구조의 공간 조직, 연결 패턴 및 형태에 대해 이해하는 것은 특정 세포 및 조직의 기능을 파기하는 데 필수적입니다. 이것은 신경 과학에서 특히 사실이다, 있는 엄청난 노력은 중추 신경계의 고해상도 신경 해부학지도를 구축하는 데 전념하고있다1,2. 이러한 지도를 구성하는 뉴런의 면밀한 검사는 다양한 형태학을 산출하며, 이러한 다양한 뉴런 세트의 기능을 반영하는 연결 및위치3,4. 더욱이, 세포외 구조, 특히 수지상 척추에 대한 조사는 시냅스의 성숙도를 알릴 수 있어 발달 과정 및 신경질환 상태를 반영하여5,6,7. 따라서 이미징 해상도와 처리량을 개선하는 접근 방식은 모든 척도에서 뇌 기능을 더 잘 이해하는 데 필수적입니다.

최근 발전은 뉴런의 인구를 표시하고 조작하기위한 분자 및 유전 도구 키트를 확장했다. 뉴런에 이러한 마커를 도입하는 새로운 방....

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프로토콜

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다음 프로토콜은 베일러 의과 대학에 대한 모든 동물 관리 지침을 따릅니다.

1. 해부 및 조직 준비

  1. 이소플루란 (또는 다른 IUCAC 승인 수단에 의해) 젖은 수건으로 닫힌 용기에 마우스를 배치하여 이소플루란의 과다 복용으로 마우스를 안락사.
  2. 10mL의 얼음 차가운 PBS를 가진 25 G 바늘을 사용하여 동물을 트랜스카디로 사용하고, 그 다음으로 4% PFA의 10mL가 그 뒤를 따릅니다.
  3. 관심의 뇌 영역 (또는 조직)을 해부.
  4. 해부된 조직을 4°C에서 하룻밤 사이에 4% PFA로 넣습니다. 적절한 고정은 이 프로토콜의 핵심입니다. 이 단계를 건너뛰거나 단축하지 마십시오.
  5. 4% PFA에서 최소 12시간 동안 고정한 후, 4°C에서 24시간 동안 4%의 아크릴아미드 하이드로겔 혼합물로 조직을 이송한다.
    참고: 하이드로겔을 해동할 때 중합되지 않았는지 확인하면 하이드로겔이 너무 따뜻해지면 발생할 수 있습니다. 얼음에 녹동하여 조기 중합을 방지합니다.

2. 조직 청산

  1. -90 kPa 진공상태에서 37°C에서 3시간 동안 진공 인큐베이터에 뇌 조직(여전히 하이드로겔에 잠긴)을 놓....

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결과

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이미지 수집 후, 대표적인 세포 형태는 임베디드 통계를 사용하여 분석 소프트웨어 내에서 스크립트를 분류했다. 수집된데이터(도 6A)는뉴런 2가 척추밀도가 높은 더 큰 수지상 구조를 갖는다는 것을 반영한다. 전체적으로, 데이터는 뉴런 2가 뉴런 1에 비해 더 복잡한 수지상 구조를 가지고 있음을 시사한다. 이러한 결과를 입증하기 위해, 표준 Sholl 분석이 수행되었으며, 이는 뉴런 2가 소마로부터 50-100 μm에서 Sholl 교차의 증가수에 의해 표시된 바와 같이 뉴런 1보다 더 수지상적으로 복잡하다는 것을 확인하였다(도6B). 마지막으로, 두 개의 이미지 뉴런의 수지상 척추는 전반적인 모양과 크기에 따라 네 가지 주요 범주로 분류되었다. 더 많은 filopodia 같은 모양을 전시 하는 척추는 가능성이 더 미숙한 척추 하위 유형. 버섯 등뼈라고 불리는 정의된 머리를 가진 척추는 더 발달되고 성숙한 시냅스

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토론

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현대 조직 청산 기술의 출현 전에, 신경 형태를 공부하는 것은 시간 집약적인 단면, 화상 진찰 및 인접한 아주 얇은 단면도의 재건으로 이루어져 있습니다. 공초점 화상 진찰과 함께 전기 전구 클리어링을 사용하면 완전한 신경 형태에 대한 방해받지 않는 시각을 제공합니다. 그대로 수지상 나무에서 가장 작은 시냅스 부톤까지, 신경 형태에 이미징과 정량화하는 것은 그 어느 때보다 도드라졌습니다.

지워진 뇌 조직의 준비는 간단하며 특수 장비의 한 조각만 필요합니다. 이 프로토콜을 사용하여 지워지고 이미지화된 조직은 지루한 얇은 단면, 처리 및 장착의 필요성을 대체하여 실험에서 이미지 수집에 이르는 시간을 크게 줄입니다. 또한, 단면없이 이미지 된 조직은 손상또는 필요한 포스트 혹 후 이미지 재구성의 소스가 없기 때문에 원래 구조에 더 충실하게 남아 있습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 가스와 같은 소규모 서브미크론 피처와 함께 수지상 나무와 같은 대규모 기능의 동시 이미징을 허용함으로써 시.......

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공개 사항

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저자는 이 시점에서 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 이러한 실험에 사용되는 AAV 및 렌즈 바이러스를 생산하기위한 1 월과 댄 던컨 신경 학 연구소의 바이러스 코어 NRDDC에 감사드립니다. 또한, 우리는 마우스 축산 및 사용되는 마우스의 일반적인 유지 보수에 대한 비교 의학에 대한 베일러 대학 의학 센터에 감사드립니다. 20PRE35040011, 황동: 베일러 연구 옹호자들의 지원에 감사드립니다(PJH). 마지막으로, 로고X-선명도 전기전도 조직 정리 시스템을 실험실에 제공한 로고스에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 코니컬 튜브Thermo Scientific339650
25 G x 1" 니들BD305127
30% 아크릴아미드(No-Bis)National DiagnosticsEC-810
50 mL 코니컬 튜브Thermo Scientific339653
전기영동 조직 클리어링 솔루션로고C13001
HistodenzSigmaD2158-100G
하이드로겔 솔루션 키트로고C1310X
ImarisOxford InstrumentsN/A
파라포름알데히드 16%EMS15710
PBS, 1x, 500 mL, 6병/케이스fisherMT21040CV
VA-044Wako925-41020
X-CLARITY 중합 시스템로고C20001
X-CLARITY 조직 세척 시스템 II로고C30001

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
  2. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions o....

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