우리는 PKH 염료로 대식세포 유래 작은 세포외 소포를 라벨과 시험관 내 및 척수에서 그들의 upup을 관찰하는 프로토콜을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
작은 세포 외 소포 (sEV)는 모든 세포에 의해 분비되고 체액에 존재하는 50-150 nm 소포입니다. sEV는 RNA, 단백질 및 지질과 같은 생체 분자를 기증자에서 수용세포로 이송하여 세포 간의 주요 신호 중재자를 만듭니다. 중추 신경계 (CNS)에서 sEV는 신경 면역 상호 작용을 포함하여 세포 간 신호를 중재 할 수 있습니다. sEV 기능은 생체외 및 생체 내 모두 받는 사람 세포에서 표지된 sEV의 섭취량을 추적하여 연구할 수 있다. 이 논문은 PKH 멤브레인 염료를 사용하여 RAW 264.7 대식세포의 조건부 매체로부터 sEV의 라벨링을 설명합니다. 그것은 신경-2a 세포와 시험관내1 차 성상세포에 의해 여러 시간 지점에서 표지된 sEV의 다른 농도의 uptakes를 보여줍니다. 또한 마우스 척수 뉴런, 성상세포 및 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화된 미세glia에서 내trathecally를 전달한 sEV의 섭취도 표시됩니다. 대표적인 결과는 척수로 성공적인 sEV 납품을 확인하는 것을 도울 수 있는 다른 세포에 의하여 sEV의 uptake에 있는 시간 의존적인 변이를 보여줍니다.
서론
작은 세포 외 소포 (sEV)는 나노 크기, 50-150 nm의 크기 범위와 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 다중 vesicular 바디 (MVBs)에서 유래하고 플라즈마 막과 MVB의 융합에 세포에서 풀어 놓입니다. sEV는 miRNAs, mRNA, 단백질 및 생리활성 지질을 포함하고, 이 분자는 세포 간 세포 통신의 형태로 세포 사이 옮겨질 것입니다. sEV는 다양한 내막 경로에 의해 수신자 세포에 의해 내부화될 수 있으며, 수신자 세포에 의한 sEV의 이러한 포획은 EV와 표적 세포1모두에 대한 표면 분자의 인식에 의해 중재된다.
sEV는 수용체 세포의 분자 및 현상 변화를 유발할 수 있는 능력, 치료제로서의 유용성, 화물 분자 또는 약리학제의 운반선으로서의 잠재력으로 인해 관심을 얻고 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, sEV의 화상 진찰 및 추적은 특히 생체 내 연구 및 임상 설정에 도전적일 수 있습니다. 따라서 생체 내 및 생체 내 및 생체 내 추적을 지원하기 위해 라벨 및 이미지 sEV를 표시하고 이미지 sEV를개발하는 많은 방법이 개발되었다.
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프로토콜
참고: 모든 절차는 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 NIH 가이드를 준수하여 수행되었으며 드렉셀 대학 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 시간 임신 한 CD-1 마우스는 성상체 배양에 사용되었고, 모든 댐은 함침 후 15 일 수신되었다. 12주 된 C57BL/6 마우스는 생체 내 섭취 실험에 사용되었다.
1. RAW 264.7 대식세포로부터 의 대체 분리
- 배양 RAW 264.7 세포는 DMEM 엑소좀 고갈된 배지에서 75cm2 플라스크로 24-48h에 대해 10% 엑소좀 고갈된 태아소 혈청(FBS)과 1%의 페니실린-연쇄절제술(pen-strep)을 함유하고 있다.
- 4°C에서 10분 동안 300ml의 조건부 배지 및 원심분리기를 300× g에서 수집합니다.
- 4°C에서 20분 동안 2,000g× g에서 상피 및 원심분리기를 수집합니다.
- 상체를 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 12,000g에서 35분 동안 ×.
- 상체를 수집하고 0.22 μm 주사기 필터를 통해 필터링합니다.
- 4°C에서 11....
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결과
원심분리를 통해 RAW 264.7 컨디셔닝 된 매체로부터 sEV를 분리한 후, NTA는 정제된 세프의 농도 및 크기 분포를 결정하는 데 사용되었다. RAW 264.7 유래 sEV의 평균 평균 크기는 140nm이고 피크 입자 크기는 121.8nm였으며, 빛 산란 측정에서 대부분의 검출 가능한 입자가 50-150 nm(그림1A)에서엑소좀 또는 sEV의 크기 범위 내에 떨어졌는 것을 확인하였다. 세포 외 소포 2018 (MISEV2018)23의연구를위한 최소한의 정보에서 제안 된 바와 같이, 우리는 뚜렷한 EV 인구에서 존재하거나 제외되어야하는 단백질 세트를 분석했습니다. sEV, 세포 용해 및 엑소 고갈 된 매체의 서양 블로팅은 sEV 유래 단백질 샘플에 sEV 마커 단백질 Alix, CD81 및 GAPDH가 포함되어 있음을 입증했습니다. 세포 리자테 분획은 sEV에 없는 내과성 망상 상주 단백질, calnexin으로 풍부하게 되었다. .......
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토론
이 프로토콜에서, 우리는 PKH 염료와 sEV의 라벨링과 척수에 그들의 섭취량의 시각화를 보여주었습니다. PKH 리포필릭 형광염은 세포측정 및형광 현미경검사3,5,6,12,24,25를유동하여 세포 라벨링에 널리 사용된다. 상대적으로 긴 반감기 와 낮은 세포 독성으로 인해, PKH 염료는 생체 내 및 체외 세포 추적 연구26,27의넓은 범위에 사용될 수 있다. 우수한 막 보존 및 생화학적 안정성이 유리하지만, sEV로 정제된 지단백질 오염물질을 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH NINDS R01NS102836및 펜실베니아 보건부 유니버설 연구 강화(CURE)의 보조금에 의해 지원되었으며, 시나 K. 아지트에게 수여되었습니다. 우리는 원고의 비판적 독서에 대한 박사 브래들리 내쉬 에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Amicon Ultra 0.5 mL 원심 필터 | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix 항체 | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin 항체 | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 항체 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling 기술 | 2118 | 1:1000 |
| 항 아교 섬유 산성 단백질 항체 | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 IHC |
| Anti-IBA1 항체 | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A 항체 | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | VWR | 0332 | |
| 세포 여과기, 40 μ m | VWR | 15-1040-1 | |
| 원심분리기 튜브 | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| 커버슬립, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| 커버슬립, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µ g/mL |
| DC 단백질 분석 | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| 당나귀 안티 토끼 IgG H& L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| 당나귀 안티 토끼 IgG H & L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| 이중 젖빛 현미경 슬라이드, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS 칼슘 및 마그네슘 없음 | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| 엑소좀 고갈 소 태아 혈청 | Gibco | A27208-01 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M 이미징 시스템 | ProteinSimple | ||
| FV3000 컨포칼 현미경 | 올림푸스 | ||
| 염소 안티 마우스 IgG H& L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| 염소 안티 마우스 IgG H& L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| 염소 안티 마우스 IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| 차단 버퍼, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS 샘플 버퍼 | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 시스템 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 소프트웨어 | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a 세포주 | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 19210 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | 시그마-알드리치 | MINI26-1KT | |
| PKH67 | 시그마-알드리치 | MINI67-1KT | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 세포주 | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA 버퍼 | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| 염화나트륨 | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | 접착 슬라이드 |
| T-75 플라스크 | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 디지털 전송 전자 현미경 | FEI Company | ||
| TEM Grids | 전자 현미경 과학 | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine 단백질 젤, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | 해리 효소 |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 초원심분리기 튜브 | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
참고문헌
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in viv....
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