이 프로토콜은 유기형 절편 배양(OTSC)의 준비에 대해 설명합니다. 이 기술은 온전한 다세포 조직의 체외 배양을 용이하게 합니다. OTSC는 다세포 환경에서 약물에 대한 각각의 반응을 테스트하는 데 즉시 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
원발성 췌장암 및 전이에 대한 현실적인 전임상 모델은 생체 외 에서 치료 반응을 테스트하고 개인화된 환자 치료를 촉진하기 위해 시급히 필요합니다. 그러나 현재 사용되는 모델(예: 환자 유래 세포주 및 이종이식)에서 종양 특이적 미세환경이 없기 때문에 제한된 예측 통찰력만 얻을 수 있습니다. 유기형 절편 배양(OTSC)은 온전한 다세포 조직으로 구성되며, 공간적으로 분해된 약물 반응 검사에 신속하게 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 췌장암의 생존 가능한 종양 절편과 그 전이의 생성 및 배양에 대해 설명합니다. 간단히 말해서, 조직은 저용융 아가로스에서 주조되고 차가운 등장성 완충액에 저장됩니다. 다음으로, 300μm 두께의 조직 절편을 진동체로 생성합니다. 준비 후, 슬라이스는 세포 배양 인서트와 적절한 배양 배지를 사용하여 공기-액체 계면에서 배양합니다. 배양 중에 세포 분화 및 생존력의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 또한 이 기술을 통해 생존 가능한 인간 종양 조직 체외(ex vivo )에 치료를 적용하고 전사체 및 단백질체 프로파일링과 같은 후속 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다.
OTSC는 개별 치료 반응을 체외(ex vivo )로 테스트하고 종양의 개별 절편의 각 반응과 관련된 개별 전사체 및 단백질체 프로필을 식별할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다. OTSC는 원발성 췌장암 및 전이의 치료를 개인화하기 위한 치료 전략을 식별하기 위해 추가로 탐색될 수 있습니다.
서론
췌관 선암(PDAC) 및 각각의 전이에 대한 기존 전임상 모델은 환자의 치료에 대한 반응을 예측하지 못하며, 이는 약물 개발 및 예측 바이오마커 식별에 큰 단점이 된다1. 환자 유래 오가노이드 및 환자 유래 이종이식과 같은 모델이 유망하지만 그 사용은 여전히 제한적입니다2. 이러한 in vitro 모델의 주요 한계는 비인간 면역 저하 종에서 종양 미세환경과 이종 이식이 부족하다는 것입니다. 특히 PDAC와 그 전이에서 종양 미세환경은 종양 생물학에서 중요한 기능을 하기 때문에 지난 몇 년 동안 상당한 관심을 받았습니다. 그것은 (myo-) fibroblast, 췌장 성상 세포, 면역 세포, 혈관, 세포 외 기질, 사이토 카인 및 성장 인자와 같은 세포 및 무세포 구성 요소로 구성됩니다3. 이러한 미세환경은 비기능적인 종양 성분은 아니지만, 종양의 진행과 전이를 유도하고 방사선 및 화학요법 내성에 실질적으로 기여하는 것으로 보인다4. PDAC 미세환경은 약물 전달을 기계적으로 손상시킬 뿐만 아니라 면역 및 약물 제거 활성을 가지고 있습니다 5,6,7
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프로토콜
조직 표본은 뤼벡 대학(University of Lübeck)의 지역 윤리 위원회(# 16-281)의 승인을 받아 수집 및 처리되었습니다.
1. 신선한 조직 수집 및 취급
알림: 고정되지 않은 모든 인체 조직 표본은 혈액 매개 병원체의 감염 위험을 방지하기 위해 주의해서 취급해야 합니다. 모든 환자는 조직 처리 전에 HIV, HBV 및 HCV에 대해 음성 판정을 받아야 합니다. 보호 코트를 착용하고 장갑으로 인체 조직 표본을 다루십시오.
- 수술 직후 최소 0.4 x 0.4cm 크기의 신선하고 고정되지 않은 비고정 PDAC 조직 표본을 수집하고 조직 보관 용액에 넣어 실험실로 운반합니다.
- 가능하면 새 조직을 즉시 처리하십시오.
- 또는 4 °C의 젖은 얼음 위에 티슈 보관 용액에 조직을 밤새 보관하십시오. 그러나 조직 보관은 생존력을 손상시킬 수 있으므로 일반적으로 피해야 합니다.
2. 준비
- 저융점 아가로스 제제
- 예열된 링거 용액 100mL에 아가로스 8g을 용해시켜 저융점 아가로스 8mL(100%)를 준비하고 필요할 때까지 4°C에서 보관합니다. ....
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결과
그림 1은 신선하고 동결되지 않은 종양 조직에서 OTSC를 배양하는 워크플로우에 대한 개요를 제공합니다. 원발성 PDAC 및 전이의 검체는 외과적 절제 후 직접 채취하여 조직 저장 용액에서 4°C의 젖은 얼음 위에서 밤새 보관했습니다. 검체를 처리하고, 프로토콜에 설명된 대로 절편을 배양했습니다. 각 OTSC의 거시적 형태는 재배 중에 크게 변하지 않았습니다. 그러나, OTSC의 표면적의 크기는 6일 동안 배양하는 동안 그림 2A 에 예시적으로 나타난 바와 같이 시간이 지남에 따라 감소하였다. OTSC의 전반적인 생존력은 0일, 2/3일, 6일에 레사주린 생존도 분석으로 평가되었습니다(그림 2B). 레사주린 생존도 분석은 살아있는 세포에서 비형광 청색 레사주린이 적색 형광 레소루핀으로 감소하는 것을 기반으로 OTSC의 일반적인 대사 활성을 측정합니다
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토론
새로운 종양 샘플의 OTSC는 상피내 종양에 대한 근접한 근사치입니다. 그들은 정의된 조직 의존적 기간 동안 배양 동안 기준 형태, 증식 활동 및 미세환경을 유지합니다 11,12,13. 이 기술을 사용하면 생존 가능한 인간 종양 조직에 대한 치료를 ex vivo 및 전사체 프로파일링과 같은 후속 다운스트림 분석에 즉시 적용할 수 있습니다. OTSC의 특별한 장점은 MALDI 이미징과 같은 공간적으로 분해된 다운스트림 분석을 온전한 다세포 종양 조직에 적용할 수 있다는 것입니다.
여기에서는 PDAC 및 그 전이의 OTSC의 생성, 배양 및 조직 병리학적 평가를 위한 방법을 설명합니다. 이 기술의 핵심 쟁점은 냉동 절차 없이 신선한 조직을 절단하고 공기-액체 계면에서 배양하는 것입니다........
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공개 사항
저자들은 잠재적인 이해 상충을 공개하지 않았습니다.
감사의 글
R. Braun은 Lübeck Clinician Scientist School (DFG #413535489)과 University of Lübeck의 Junior Funding Program의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 고급 DMEM/F-12 매체 | Gibco | 12634028 | |
| Agarose Low Melt | Roth | 6351.2 | 8% in Ringer 용액 |
| 항체 희석제, 배경 환원 | Dako | S3022 | |
| AquaTex | Merck | 108562 | |
| Bioethanol (99%, 변성) | CHEMSolute | 2,21,19,010 | |
| 구연산 일수화물 | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 세포 신호 기술 | 9664 | 1:400 희석 |
| Derby Extra Double Edge Safety Razor Blade | Derby Tokai | ||
| Embedding cassettes | Roth | H579.1 | |
| Eosin Y-solution 0,5% 수성 | Merck | 10,98,44,100 | |
| Eukitt 빠른 경화 장착 매체 | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| 포름 알데히드 용액 4,5 %, 완충 | B & uuml; fa Chemikalien | B211101000 | |
| Hem 명반 용액 산 acc. Mayer | Roth | T865 | |
| Human EGF | Milteniy Biotec | 130-097-794 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich (Merck) | H0888 | |
| 과산화수소 30% | Merck | 1,08,59,71,000 | |
| 인슐린 인간 | Sigma Aldrich (Merck) | 12643 | |
| 액체 DAB+ 기판 발색량 시스템 | Dako | K3468 | |
| MACS 조직 저장 솔루션 | Milteniy Biotech | 130-100-008 | |
| 메탄올 | Merck | 10.600.092.500 | |
| 현미경 슬라이드 Superfrost Plus | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| 밀리셀 세포 배양 인서트, 30mm, 친수성 PTFE, 0.4 &마이크로; m | Millipore (Merck) | PICM0RG50 | |
| 단클론 마우스 반 인간 사이토케라틴 7 (클론 OV-TL 12/30) | Dako | M7018 | 1:200 희석 |
| 단클론 마우스 Anti-human Ki67 클론 MIB-1 | Dako | M7240 | 1:200 희석 |
| 단클론 마우스 Anti-vimentin (클론 V9) | Dako | M0725 | 1:200 희석 |
| 네거티브 컨트롤 마우스 IgG2a | Dako | X0943 | 1:200 희석 |
| 네거티브 컨트롤 마우스 IgG1 | Dako | X093101-2 | 1:200 희석 |
| 파라핀 (용융 온도 56°C;- 58°C) | Merck | 10,73,37,100 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10.000 U/ml) | Gibco | 15140122 | |
| PBS pH 7,4 (1x) 유세포 분석 등급 | Gibco | A12860301 | |
| Resazurin 나트륨 염; PBS | Sigma Aldrich | R7017 | 1:250 희석 |
| 링거 용액 | Fresenius Kabi | 2610813 | |
| RPMI-1640 배지 10 mg/ml | Sigma Aldrich (Merck) | R8758 | |
| 조직 배양 테스트플레이트 6 | TPP | 92006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
| VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit | Vector Laboratories | PK-6200 | |
| Xylene (extra pure) | J.T.Baker | 8,11,85,000 | |
| Equipment | |||
| ClarioStar 마이크로플레이트 리더 | BMG Labtech | ||
| 파라핀 임베딩 센터 E61110 | Leica | ||
| 로터리 마이크로톰 Microm HM355S | Thermo Scientific | ||
| 단면 전달 시스템 Microm STS | Thermo Scientific | ||
| VT 1200S Vibratom | Leica |
참고문헌
- Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).
- Tiriac, H., et al.
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