진공 보조 흡착제 추출을 통해 인간 관련 샘플에서 활발히 생산된 미생물 휘발성 유기 화합물 포획

휘발성 유기 화합물 (VOCs)은 모든 유기체에서 방출되기 때문에 박테리아 검출 및 식별에 큰 약속을 가지고 있으며, 다른 미생물은 고유 한 VOC 서명을 가지고 있습니다. 휘발성 분자는 만성 폐쇄성 폐 질환¹, 소변³의 결핵², 인공호흡기 관련 폐렴⁴를 포함한 다양한 호흡기 감염을 검출하기 위한 비침습적 측정으로서 활용되었으며, 낭포성 섬유증(CF)을 가진 피험자를 건강한 대조군 피험자(^5,6)와 구별하는 것 이외에 활용되었다. 휘발성 서명은 심지어 CF에서 특정 병원체 감염을 구별하기 위해 사용되었다 (스타필로코커스 아우레우스 ⁷, 슈도모나스 aeruginosa ^8,9, 및 S. 아우레우스 대 P. aeruginosa¹⁰). 그러나, 이러한 생물학적 샘플의 복잡성으로 인해, 특정 VOC의 공급원을 정확히 찾아내는 것은 종종 어렵다.

다수의 감염 미생물로부터 휘발성 프로파일을 분리하기 위한 하나의 전략은 모노- 및 공동-배양¹¹ 둘 다에서 미생물의 헤드스페이스 분석을 수행하는 것이다. 헤드스페이스 분석은 샘플 자체에 포함된 분석물이 아닌 샘플 위의 "헤드스페이스"로 방출되는 분석물을 검사합니다. 미생물 대사 산물은 종종 복잡한 임상 샘플에서 미생물 대사 산물의 기원을 결정하는 데 어려움이 있기 때문에 단일 배양에서 특성화되었습니다. 박테리아 모노 배양물로부터의 휘발성 물질을 프로파일링함으로써, 미생물이 시험관내에서 생성하는 휘발성 물질의 유형은 그의 휘발성 레퍼토리의 기준선을 나타낼 수 있다. 박테리아 배양물을 결합, 예를 들어, 공동 배양물을 생성하고, 생성된 휘발성 분자를 프로파일링하는 것은 박테리아(¹²) 사이의 상호작용 또는 교차-공급을 나타낼 수 있다.

휘발성 분자의 미생물 기원을 확인하기 위한 또 다른 전략은 안정한 동위원소로 표지되는 영양 공급원을 제공하는 것이다. 안정한 동위원소는 자연적으로 발생하며, 중성자의 수가 다른 원자의 비방사성 형태이다. 1930년대 초부터 동물⁽13)의 활성 대사를 추적하기 위해 활용되어 온 전략에서, 미생물은 라벨이 붙은 영양원을 떼어내고 안정적인 동위원소를 대사 경로에 통합한다. 보다 최근에, 중수 형태의 안정한 동위원소 (_D2O)가 임상 CF 객담 샘플¹⁴에서 대사적으로 활성인 S. 아우레우스를 확인하기 위해 사용되었다. 또 다른 예에서, ^13C표지된 글루코스는 P. aeruginosa와 Rothia mucilaginosa¹²의 CF 임상 단리물 사이의 대사산물의 교차 공급을 입증하는데 사용되었다.

질량 분광법 기술의 발전과 함께, 휘발성 신호를 검출하는 방법은 질적 관찰에서 더 정량적 측정으로 옮겨갔습니다. 가스 크로마토그래피 질량 분광법 (GC-MS)을 사용함으로써 생물학적 샘플의 처리는 대부분의 실험실 또는 임상 환경에서 도달 할 수있게되었습니다. 휘발성 분자를 조사하기 위한 많은 방법들이 오염을 검출하기 위해 식품, 박테리아 배양물, 및 다른 생물학적 샘플, 및 공기 및 물과 같은 샘플을 프로파일링하는데 사용되어 왔다. 그러나, 높은 처리량을 갖는 휘발성 샘플링의 몇몇 일반적인 방법은 용매를 필요로 하며, 진공 추출에 의해 제공되는 이점으로 수행되지 않는다. 또한 분석 15,16,17,18,19에 더 많은 부피 또는 양(^0.5mL 초과)의 샘플링된 물질이 필요한 경우가 많지만^, 이는 기판에 따라 다르며 각 샘플 유형 및 방법에 대한 최적화가 필요합니다.

여기서, GC-MS 상에서 열 탈착에 이어 진공 보조 흡착제 추출(VASE)을 사용하여 박테리아 모노 및 공동 배양물의 휘발성 프로파일을 조사하고 인간 분변, 타액, 하수 및 객담 샘플로부터 안정한 동위원소 프로빙을 갖는 활발하게 생성된 휘발성 물질을 확인했다(도 1). 제한된 샘플 수량으로, VOCs는 가래의 최소 15 μL에서 추출되었다. 인간 샘플을 이용한 동위원소 프로빙 실험은 미생물 군집의 성장을 육성하기 위해 ^13C글루코스와 같은 안정한 동위원소 공급원 및 배지를 첨가하는 것이 필요했습니다. 휘발성 물질의 활성 생산은 GC-MS에 의해 더 무거운 분자로 확인되었다. 정적 진공 하에서 휘발성 분자를 추출하면 감도가 증가한 휘발성 분자를 검출할 수 있었습니다^20,21,22.

1. 헤드스페이스 흡착펜(HSP) 및 샘플 분석 고려 사항

참고: 흡착제 Tenax TA를 함유하는 HSP는 광범위한 휘발성 물질을 포획하기 위해 선택되었다. Tenax는 다른 흡착제에 비해 물에 대한 친화력이 낮기 때문에 수분이 높은 샘플에서 더 많은 VOC를 포획 할 수 있습니다. Tenax는 또한 불순물 수준이 낮으며 재사용을 위해 컨디셔닝 될 수 있습니다. 흡착제 선택은 또한 GC-MS에 설치된 컬럼을 고려하여 이루어졌다( 물질의 표 참조).

1. 샘플 추출에 사용된 것과 동일한 조건으로 배지 및/또는 샘플 블랭크를 추출하여 음성 대조군을 생성합니다.
2. 추출된 샘플을 분석하기 전에 GC-MS에서 빈 HSP(이전에 깨끗하고 상당한 배경이 없는 것으로 확인됨)를 분석합니다. 샘플 유형 사이에서 블랭크를 실행한다(예를 들어, 박테리아 모노 컬쳐의 세 번의 반복실험, 블랭크, 박테리아 공동 배양의 세 번의 반복실험, 블랭크 등).
3. 샘플 추출 및 분석 전에 향기로운 개인 위생 용품의 사용 또는 냄새 나는 음식의 소비를 제한하십시오. 이상적으로는 알코올이나 다른 휘발성 클리너로 세척되지 않은 생물 안전 후드에서 샘플을 적어도 30 분 동안 준비하십시오. 시료 준비 전에 30-60분 동안 생물안전 후드의 공기 흐름을 켭니다.
4. 샘플을 얼음 위에 보관하여 시료 준비 중 휘발성 방출을 제한하십시오.

2. 모노 및 공동 문화 준비

1. 생물안전 후드에서, A. baumannii, S. aureus 및 P. aeruginosa 의 배양물을 Todd Hewitt 성장 배지에 접종한다. 200 rpm 교반으로 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
2. 하룻밤 배양 후, 생물안전 후드에서 배양 처리를 수행한다. 각 배양물을 500 nm에서 광학 밀도 0.05로 희석한다.
3. 200 μL의 대조군 배지, 모노- 또는 공동배양물을 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣고 동배양하고, 24시간 동안 37°C 배양기에 넣는다. 48-h 인큐베이션을 위한 두 번째 플레이트를 준비한다.
4. 잠복기가 끝나면 섹션 4에서 추출을위한 샘플을 준비하십시오. 액체 배양물을 마이크로원심분리 튜브로 피펫하고 -80°C에서 보관한다.
   참고: 이 시점에서 샘플은 -80°C에서 보관하여 필요한 경우 나중에 추출할 수 있습니다.

3. 생물학적 샘플 준비에서 안정적인 동위원소 프로빙

참고 : 대변과 타액 샘플은 캘리포니아 어바인 기관 검토위원회 (HS # 2017-3867)의 승인을 받아 익명의 기증자로부터 기증되었습니다. 하수는 캘리포니아 주 샌디에고에서 나왔습니다. 가래 샘플은 낭포성 섬유증을 앓고있는 피험자로부터 미시간 의과 대학 기관 검토 위원회 (HUM00037056)에 의해 승인 된 더 큰 연구의 일환으로 수집되었습니다.

1. 생물 안전 후드에서 모든 생물학적 샘플 준비를 수행하십시오.
   1. 분변 샘플을 준비하려면 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 100mg의 대변에 탈이온수 1mL를 넣고 3 분 동안 와류하십시오. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오.
      1. 15 μL의 분변과 물의 혼합물에, 485 μL의 뇌 심장 주입 (BHI) 배지를 20 mM 13 C 글루코스, 또는 ³⁰% 중수소 (_D2O)가있는 BHI를 첨가한다. 샘플의 최종 부피가 500 μL인지 확인하십시오. 기술적 인 삼중으로 샘플을 준비하십시오.
   2. 하수 샘플을 준비하려면 20 mM ¹³C 글루코스가 있는 BHI 500 μL에 하수 500 μL를 첨가하거나 총 부피 1 mL의 BHI를 30%_D2O로 첨가하십시오. 샘플을 세 배로 준비하십시오. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오.
   3. 타액 샘플을 준비하려면 50 μL의 타액에 20 mM ¹³C 글루코스 또는 30_{% D2O}가 있는 BHI를 500 μL의 BHI에 첨가하여 총 부피 550 μL의 시료를 삼중으로 준비한다. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오.
   4. 배양 전과 후에 샘플에 존재하는 휘발성 물질을 비교하기 위해 객담 샘플을 준비하려면 15 μL의 가래로 첫 번째 추출을 수행하십시오. 샘플을 세 배로 준비하십시오. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오. 샘플 추출을 위해 섹션 4로 진행하고, 200 rpm 교반으로 37°C에서 18시간 동안 추출한다.
   5. 배양되지 않은 객담 샘플의 첫 번째 추출이 완료된 후 바이알을 가래로 저장하십시오. 20 mM ¹³C 글루코스와 함께 500 μL의 BHI를 3.5.1의 가래가 있는 바이알에 첨가한다. 사용하지 않을 때는 얼음 위에 올려 놓으십시오.
2. 샘플 추출을 위해 섹션 4로 진행하십시오.

4. 시료 추출

1. 빈 휘발성 유기 분석(VOA) 바이알(20 mL)을 차가운 플레이트 위에 놓고 차가운 플레이트를 생물안전 후드의 얼음 위에 놓습니다.
2. 5600 흡착펜 추출 유닛(SPEU)을 켜고, 각 방법에 따라 원하는 온도로 조정한다.
   참고: 37°C에서 안정적인 동위원소 프로빙 실험을 위해 설정점에 도달하는 데 최대 15분이 걸릴 수 있습니다. 70°C에서의 모노- 및 공동-배양 실험의 경우, 설정점에 도달하는 데는 최대 60분이 소요될 수 있다.
3. 배지 또는 샘플 제어를 위한 HSP를 포함하여 준비된 샘플 수와 동일한 깨끗한 HSP를 수집합니다.
4. 필요에 따라 샘플, 반복실험 및 HSP ID에 따라 20mL VOA 바이알에 라벨을 부착합니다. 얼음 위에서 바이알 외부에 결로가 형성되는 경우 물에 저항하는 마커를 사용하십시오.
5. 생물 안전 후드 내부에서 바이알의 흰색 캡을 풀고 샘플을 바이알에 신속하게 피펫하고 검은 색 캡, 뚜껑 라이너 및 HSP를 조립하십시오.
   참고: 샘플은 HSP와 접촉해서는 안되며 샘플 부피는 샘플 유형에 따라 다릅니다.
6. 샘플 및 HSP가 들어있는 바이알을 다시 차가운 플레이트 위에 놓습니다.
7. 각 샘플에 대해 4.5단계와 4.6단계를 반복합니다. 시료 온난화를 방지하고 조기 휘발성 방출을 방지하기 위해 한 번에 이러한 단계를 수행하는 대신 시료 당 이러한 단계를 수행하십시오.
8. 모든 샘플이 유리 바이알에서 준비되면 벤치의 생물 안전 후드 외부에서 다음 단계를 수행하십시오. 진공 펌프를 켜고 바이알을 진공 하에 30mmHg까지 놓고 진공 소스를 제거하십시오.
   참고: 바이알은 진공 적용이 완료된 후 차가운 트레이에 있을 필요가 없습니다.
9. 압력 게이지를 사용하여 모든 샘플을 진공 하에 놓은 후 압력을 다시 확인하십시오. 바이알에 누출이 있는 경우 뚜껑이 단단히 조여져 있고 HSP 및 뚜껑 라이너의 흰색 O 링이 제대로 제자리에 있는지 확인하십시오.
   참고: 씰이 손상되면 진공 상태의 바이알에 비해 휘발성 감지가 감소할 수 있습니다.
10. 바이알을 200 rpm에서 교반하면서 최적화된 시간과 온도를 위해 SPEU에 넣으세요. 추출물을 70°C에서 1시간 동안 배양하였다. 분변, 하수, 타액 및 객담 샘플을 사용하여 37°C에서 18시간 동안 안정한 동위원소 프로빙 실험을 추출한다.
11. 추출 기간이 완료된 후 사용하기 위해 차가운 플레이트를 -80°C에 두십시오.
12. 추출이 완료되면 샘플을 차가운 접시에 15 분 동안 올려 HSP 및 바이알 헤드 스페이스에서 수증기를 추출하십시오.
13. HSP를 슬리브로 옮깁니다.
    참고 : HSP에서 더 휘발성이 높은 화합물을 잃기 전에 실온에서 최대 ~ 1 주 동안 실험을 일시 중지 할 수 있습니다.

5. 가스 크로마토그래피에서 샘플 분석 - 질량 분광계 (GC-MS)

1. 다음 GC-MS( 재료 표 참조) 설정을 사용합니다: 5분 홀드가 있는 35°C, 170°C까지 10°C/min 램프, 20:1 분할 비율과 38분의 총 런타임으로 230°C까지 15°C/분 램프.
2. 탈착 방법을 다음과 같이 설정한다: 2분, 70°C 예열; 2분 260°C 탈착; 34분, 260°C 베이크아웃; 및 2분, 70°C 포스트 베이크.
3. 샘플 시퀀스를 설정하고 계측에 따라 실행을 시작합니다.
   1. Entech 소프트웨어에서 시퀀스를 설정하려면 프로그램을 엽니다. 계측기 드롭다운 메뉴 오른쪽에 있는 옵션에서 5800을 선택하| 시퀀스.
   2. GC-MS 소프트웨어와 유사한 Entech 소프트웨어의 시퀀스 테이블을 관찰하십시오. 현재 date_vial 번호에 따라 샘플 ID 열 의 이름을 지정합니다. 이름은 GC-MS 시퀀스 테이블의 이름과 유사하며 5800 Method 는 온도 램프 속도, 유지 시간 등을 결정합니다 (5.2 단계에서 생성 된 방법을 선택하는 메뉴를 엽니 다).
   3. 트레이 및 위치 열은 샘플 준비 레일(SPR)이 HSP를 픽업하기 위해 이동할 위치를 결정합니다.
      1. 바로 왼쪽에 각각 30 개의 반점이있는 두 개의 쟁반을 관찰하고 각각 다섯 개의 반점이있는 여섯 개의 기둥으로 배치하십시오. 가장 왼쪽이고 사용자(앞)에 가장 가까운 트레이 위치는 위치 1이고, 가장 오른쪽, 가장 멀리 떨어져 있는 트레이 위치는 위치 30입니다.
      2. 이러한 트레이는 HSP A 또는 B이며, 여기서 HSP B는 SPR(가장 안쪽 트레이)에 더 가까운 트레이이고 HSP B 바로 뒤에는 HSP 블랭크가 있습니다. 추출된 샘플을 트레이에 넣고 그에 따라 시퀀스에서 스폿을 선택합니다.
   4. 시퀀스 테이블을 저장하고 왼쪽에서 실행 을 선택한 다음 빈 HSP가 탈착기에 있는 경우 제거기에서 공백으로 시작 (노란색 레이블로 표시된 HSP로 표시됨)을 선택합니다.
4. HSP는 시퀀스의 각 샘플에 대해 SPR에 의해 처리됩니다. SPR을 예열하면 화면 상단에 공백이 소거버에 있는지 확인하는 메시지가 나타납니다. 건너뛰 기를 클릭하여 펜이 있는지 확인합니다. SPR이 모든 샘플을 자동으로 실행하도록 허용하면 GC-MS 측의 시퀀스가 자동으로 데이터를 별도의 파일에 기록합니다.

6. 데이터 분석

1. GC-MS 소프트웨어의 품질 필터 데이터 (재료 표).
   1. 크로마토그램의 각 피크를 검토하고 NIST(National Institute of Standards & Technology) 라이브러리(또는 사용 가능한 다른 라이브러리)와 일치하는 피크에 주석을 달습니다.
   2. 주석이 달린 크로마토그램 피크를 처리 방법에 추가합니다. 75% 이상의 확률을 갖는 화합물을 포함하도록 피크를 선택하는 기준을 설정하고, 화합물의 각 식별 이온의 정렬이 피크의 중심 내에 있는지 확인하십시오.
      1. 처리 방법에 피크를 추가하려면 | 보정을 선택합니다. 컴파운드 | 편집 이름 | 외부 표준 컴파운드 아래에 화합물을 삽입하십시오. 화합물의 이름, 체류 시간, 양자 신호 대상 이온을 추가하십시오. 세 개의 가장 큰 봉우리를 추가하십시오. 저장하려면 확인을 선택 합| 방법 | 저장.
   3. 공정 방법이 설정되면 정량화 |로 진행하십시오. | 계산 및 보기 QEdit 양자 결과.
   4. 각 화합물을 검사하여 피크가 예상 보존 시간과 일치하고 배경 소음보다 높은지 확인합니다.
   5. QEdit이 완료되면 종료를 선택합| 예, QEdits를 저장하고 주 크로마토그램으로 돌아갑니다. 왼쪽에서 파일을 열어 영역 통합을 내보냅니다. | 정량 선택 보고서를 생성합니다.
   6. DExSI에서 사용할 파일을 내보내려면 파일 |를 선택합니다. 데이터를 AIA 형식 |로 내보내기 새 디렉터리를 만들고 파일의 위치를 선택하거나 기존 디렉터리 사용을 선택합니다.
   7. 새 창이 열리고 내보낼 파일을 선택하는 것을 관찰하십시오. 파일을 창의 오른쪽으로 이동하고 프로세스를 클릭하십시오. 변환되는 파일 수에 따라 몇 초에서 몇 분 정도 기다리십시오.
2. DExSI 소프트웨어(https://github.com/DExSI/DExSI)에 대한 지침에 따라 DExSI의 동위원소 풍부도를 수정하고 즐겨찾는 소프트웨어 또는 프로그램(예: R)으로 분석을 수행합니다. 수치를 생성하는 데 사용되는 스크립트는 https://github.com/joannlp/ VOC_SIP에 있습니다.

S. aureus, P. aeruginosa, A. baumannii의 모노 및 공동 문화
모노 및 공동 배양은 박테리아 종 S. aureus, P. aeruginosa, 및 A. baumannii로 구성되었다. 이들은 인간의 상처와 만성 감염에서 발견되는 일반적인 기회 주의적 병원체입니다. 모노- 및 공동-배양물에 존재하는 휘발성 분자를 확인하기 위해, 200 rpm 교반으로 70°C에서 짧은 1-h 추출을 수행하였다. 24- 및 48-h 시점에서의 모노- 및 공동 배양물로부터, 43개의 주석이 달린 휘발성 분자가 검출되었고(도 2), 그 중 알데히드, 케톤, 알코올, 황산 화합물, 탄화수소, 카르복실산 또는 에스테르, 및 방향족제였다. 특정 시점에서 특정 모노 또는 공동 배양물에서만 검출 된 소수의 휘발성 분자가있었습니다. 예를 들어, 아세토인 및 3-히드록시-2-부타논 아세테이트는 48-h 시점에서 S. 아우레우스 배양물에서만 검출되었다(도 2).

휘발성 1-프로판올 2-메틸은 48 h에서 P. aeruginosa와 A. baumannii 공동 배양물에서만 검출되었다 (도 2). 에틸 아세테이트는 48 h에서 S. 아우레우스 또는 P. aeruginosa와 함께 A. baumannii 공동 배양물에 존재하였다 (도 2). 대사산물인 헵탄, 2,3-디메틸펜탄 및 2-메틸펜탄은 24 h에서 A. baumannii 배양물에서만 검출되었다(도 2). 아세트알데히드 및 에탄올은 24-h 시점에서의 A. baumannii 및 S. aureus 공동 배양에서 48 h 및 어느 균주 단독 배양에 비해 더 높은 상대적 풍부도를 가졌다 (도 2). 휘발성 물질 중 일부는 24 또는 48-h 시점에서 배양물에서 더 풍부했다. 아세트산, 부탄산 및 프로파노산을 포함한 단쇄 지방산은 48 h에서 배양물에서 상대적으로 풍부했지만 24-h 배양물에서는 검출되지 않았다 (그림 2). 헥산은 48 h에 비해 24 h에서 TH 대조군에서 더 풍부하였다 (도 2).

분변, 하수 및 타액 샘플의 안정적인 동위원소 라벨링
생물학적 샘플로부터 휘발성 분자의 활성 생산을 확인하기 위해, 표지된 영양 공급원, 13C글루코스 또는D2O, 및 미생물 군집의 성장을 지원하기 위해 배지를 첨가하였다. 하나의 독특한 샘플이 분변, 하수오, 및 타액 샘플의 상이한 샘플 유형 각각으로부터 삼중으로 분석되었다. 중수소와의 혼입에 비해 완전히 표지된 휘발성 분자 내로의 13C의 혼입이 더 많았다(도 3A-D). 13C를2-부타논, 3-히드록시에 혼입시키고; 2,3-부탄디온; 아세트산; 및 모든 분변, 하수 및 타액 샘플에 대한 페놀이다(도 3A).

다른 표지된 휘발성 물질은 둘 또는 하나의 샘플 유형 중 하나에서 검출되었다. 예를 들어, 아세톤, 부탄산 및 프로파노산은 타액 및 하수구에서 표지된 것으로 검출되었다(도 3B). 표지된 휘발성 물질, 디메틸 트리설파이드 및 디술피드 디메틸을 분변 및 타액 샘플 둘 다에서 농축시켰다 (도 3C). 휘발성, 1-프로판올, 2-부타논, 벤조페논, 에탄올 및 메틸티올아세테이트는 하수오에서만 농축되었다(도 3D). 표지된 휘발성, 2,3-펜탄도인은 타액이 풍부하였다(도 3D). 중수소는 휘발성 물질 내로 혼입되었고, 아세트산; 벤즈알데히드, 4-메틸; 디메틸트리설파이드; 타액 또는 하수 샘플에서 나온 페놀 (그림 3E). 동위원소 농축 휘발성 물질 이외에, 혼입된 안정한 동위원소를 함유하지 않은 휘발성 물질이 검출되었다. 예를 들어, 피라진, 2,5-디메틸피라진을 제외한 피라진 화합물은 분변, 하수 및 타액 샘플에서 검출되었으나 13C로 완전히 농축되지는 않았다(보충도 S1).

가래 샘플의 안정적인 동위원소 라벨링
낭포성 섬유증을 앓고 있는 일곱 명의 인간 피험자로부터 가래 샘플로 활발히 생산된 휘발성 물질을 확인하기 위해 안정한 동위원소 표지 전략이 구현되었다. 샘플 내의 휘발성 물질을 안정한 동위원소 표지로 배양된 샘플로부터 나온 것들과 비교하였다. 각 샘플의 각 휘발성 성분은 두 번 분석되었다: 13C글루코스 및 배지로 안정한 동위원소 프로빙 전과 후에. 피험자로부터 수집된 샘플은 세 가지 상이한 시점 또는 임상 상태에 걸쳐 있었다: 기준선, 악화, 및 치료23. 배양된 객담 샘플에서 표지된 바와 같이 검출된 휘발물질은 배양되지 않은 객담 샘플로부터의 표지되지 않은 휘발성 물질과 비교하여 상이한 상대적 풍부도를 가졌다. 객담을 이용한 안정한 동위원소 프로빙 실험에서의 배양 조건은 특정 미생물의 성장을 선호할 수 있으며, 배양되지 않은 객담 샘플과 비교하여 휘발성 물질의 상대적 풍부도의 차이를 초래할 수 있다.

예를 들어, 아세트산, 디메틸트리설파이드, 아세톤 및 프로판올, 2-메틸은 배양되지 않은 객담 샘플에 비해 배양된 객담 샘플에서 더 풍부하였다(도 4). 배경 실내 공기 중에 가변량으로 존재할 수 있는 13C 표지된 에탄올을 검출하는 것은 에탄올이 13C글루코스로부터 미생물 대사에 의해 활발하게 생성되었다는 증거를 제공한다. 변동의 양은 순열 다변량 분산 분석 (PERMANOVA)에 의해 평가된 바와 같이 피험자에 의해 설명되었고, 또한 2개의 상이한 휘발성 데이터세트에 대해 상이하였다 (표 1 및 보충 그림 S2). 13C표지된 배양 객담의 경우, 변이의 51%가 피험자에 의해 설명되었고, 한편 변이의 33%는 배양되지 않은 객담 샘플에서 휘발성 물질로부터 피험자에 의해 설명되었다(표 1). 일곱 명의 피험자로부터의 16S rRNA 앰플리콘 시퀀싱에 의해 결정된 마이크로바이옴 군집 조성은 각 피험자에게 고유하였고 (보충도 S3), 개별 시그니처는 또한 검출된 배양된 가래 휘발성 분자 둘 다에 반영되었다.

배양된 객담에서, 13개의 탄소로 완전히 표지된 23개의 휘발성 물질이 검출되었다. 가래 샘플로부터 검출된 동위원소-풍부한(활성) 휘발성 물질은 피험자마다 상이하였다. 일곱 피험자 모두로부터의 객담 샘플에서 검출된 동위원소 농축을 갖는 휘발성 물질은 2,3-부탄디온이었고; 아세트산; 아세톤; 디메틸트리설파이드; 디설파이드, 디메틸; 및 피라진, 2,5-디메틸(그림 5). 이러한 휘발성 물질이 모든 피험자에서 검출되었지만, 각 피험자에 대한 동위원소 농축은 다양했다. 피험자 7로부터의 샘플은 다른 여섯 명의 피험자에 비해 디술피드 디메틸의 동위원소 농축이 더 높았다(도 5B). 아세톤은 피험자 4 및 6에서 더 높았다(도 5). 일부 휘발성 물질은 특정 피험자에서만 13C로 농축되었다. 예를 들어, 1-부탄올, 3-메틸 및 2-메틸프로판산은 피험자 2로부터의 샘플의 서브세트에서만 농축되었다(도 5). 동위원소 농축 휘발성 물질 이외에, 동일한 배양된 객담으로부터 표지되지 않은 것으로 휘발성 물질도 검출되었다 (보충 도 S4). 휘발성 물질 2-피페리디논; 벤즈알데히드, 4-메틸; 벤조티아졸; 부탄산, 3-메틸; 육각형; 헥산; 이소프로필 알코올; 페놀; 프로파노산, 2-메틸; 및 피롤로 1,2-아피라진-1,4-디온, 헥사하이드로가래 샘플에서 검출되었으나, 동위원소 농축은 아니었다(보충 도 S4).

그림 1: 프로토콜 회로도. 생물학적 샘플을 유리 바이알에 넣고 뚜껑 라이너 및 헤드스페이스 소르벤트 펜으로 조립합니다. 약 30mmHg의 압력에 도달 할 때까지 진공이 바이알에 적용됩니다. 진공 소스가 제거되고 바이알은 흡착제 펜 추출 유닛에 배치되어 열, 교반 및 시간의 도움으로 정적 추출이 수행됩니다. 추출 후, 바이알을 차가운 금속 블록 위에 올려 놓고 헤드 스페이스와 HSP에서 물을 제거합니다. HSP는 GC-MS에서 열 탈착을 통해 수집되고 실행됩니다. 데이터는 ChemStation, DExSI 및 R. 약어로 분석됩니다 : HSP = 헤드 스페이스 흡착제 펜; GC-MS = 가스 크로마토그래피 - 질량 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 모노 및 공동 문화의 히트맵. VOC는 24시간 및 48시간 시점에서 모노 및 공동 배양물에서 검출되었다. 공동 문화는 각 균주를 나타내는 문자의 조합입니다. 모든 샘플을 200 rpm 교반으로 70°C에서 1시간 동안 추출하였다. 히트맵 강도 값은 대사산물에 의해 정규화된 열 Z-점수입니다. Z-점수는 값의 평균으로부터의 값의 차이에 의해 계산되었고, 값의 표준 편차로 나눴다. 덴드로그램은 R의 pheatmap 함수에서 cluster_cols 옵션으로 생성되었습니다. 덴드로그램은 함께 클러스터링되는 대사산물이 샘플에서 더 유사한 Z-스코어를 갖는 계층적 클러스터링을 나타낸다. 약어: A = A. 바우마니; P = P. aeruginosa; S = S. 아우레우스; TH = 토드 휴잇 미디어 (제어). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 13C를 분변, 타액 및 하수 샘플에서 휘발성 분자 질량으로 동시 인큐베이션 및 추출하는 동안 18시간 동안 퍼센트 전환. % 변환은 완전히 표지된 화합물 (M+N)의 질량을 취하여 그것을 (M+N) + 표지되지 않은 휘발성 질량 (M)의 질량으로 나눔으로써 완전히 표지된 화합물에 대해 계산되었고, 여기서 N은 각 휘발성 분자에서 표지될 수 있는 가능한 탄소의 최대 수( A-D에서) 또는 수소( E에서)이다. 화합물은 휘발성의 모든 탄소가 13C로 대체될 때 완전히 표지되는 것으로 간주된다. 데이터가 누락된 경우 휘발성이 감지되지 않았습니다. 예를 들어, (D)에서, 1-프로판올은 분변 또는 타액 샘플에서 검출되지 않았다. 샘플당 반복실험 횟수 = 3. (A) 모든 샘플 유형(대변, 타액 및 하수)에서 검출된 13개의 C 표지된 휘발성 물질. (B) 13개의C 라벨이 붙은 휘발성 물질은 타액 및 하수 샘플에서만 검출된다. (c) 대변 및 타액 샘플에서 검출된 13C표지된 휘발성 물질. (d) 13C표지된 휘발성 물질이 세 가지 상이한 샘플 유형 중 하나에서 검출되었다. (e) 중수소-표지된 휘발성 분자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 배양된 객담으로부터의 13C표지된 휘발성 물질 및 배양되지 않은 객담으로부터 검출된 휘발성 분자의 히트맵. 표지된 휘발성 물질은 미생물 성장을 배양하고 활성 휘발성 생산을 포획하기 위해 추출 단계 동안 13C글루코스 및 뇌 심장 주입 배지를 가래에 첨가한 안정한 동위원소 프로빙 실험으로부터 유래한다. 표지되지 않은 휘발성 분자는 객담 샘플로부터 직접 검출되었다. 히트맵 강도는 그림 2의 캡션에 설명된 Z-점수입니다. 그러나, Z-점수는 배양된 객담 및 미배양된 객담 실험에 대해 각 실험 내에서 계산되었다. 덴드로그램은 도 2에 기재된 바와 같이 생성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 동시 인큐베이션 및 추출의 18 h 동안 낭포성 섬유증을 앓고 있는 7명의 피험자로부터의 객담 샘플에서 휘발성 분자 질량으로의 13C의 퍼센트 전환. % 변환은 도 3의 캡션에 설명된 대로 계산되었다. 샘플에서 검출되지 않은 휘발성 물질은 데이터의 부재로 표시됩니다. N = 1-3. (A) 13C표지된 휘발성 물질은 대부분의 객담 샘플에서 더 높은 퍼센트 전환율로 검출되었다. (B) 대부분의 객담 샘플에서 더 낮은 퍼센트 전환율로 검출된 13C표지된 휘발성 물질. (C) 13C표지된 휘발성 물질은 소수의 객담 샘플에서 더 낮은 퍼센트 전환율로 검출되었다. 약어: B = 기준선; E = 악화; T = 치료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 객담 샘플의 분산(PERMANOVA)의 순열 다변량 분석. PERMANOVA는 R의 비건 패키지로부터의 아도니스 함수를 사용하여 생성되었다.

보충 그림 S1: 분변, 타액 및 하수 샘플에 걸쳐 라벨링된 (M+N(최대)) 및 표지되지 않은(M+0) 휘발성 물질의 상대적 풍부도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: 안정한 동위원소 프로빙 및 배양되지 않은 가래를 갖는 배양된 객담의 비메트릭 다차원 스케일링. (a) 13C글루코스 및 배지로 배양된 객담의 NMDS를 k=3 차원으로 생성하였다. 응력 값은 0.07이었다. (b) 배양되지 않은 객담의 NMDS를 k=3 차원으로 생성하였다. 응력 값은 0.13이었다. 약어: NMDS = 비메트릭 다차원 크기 조정; B = 기준선; E = 악화; T = 치료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도표 S3: 낭포성 섬유증을 가진 피험자로부터의 객담 샘플의 미생물 군집 조성. 더 큰 연구의 일환으로 16S rRNA 앰플리콘 시퀀싱에 의해 평가되었으며, Carmody et al. 202019에서 발견 된 접근법에 대한 추가 정보. 낭포성 섬유증이있는 피험자로부터. 각 누적 막대는 다른 시점입니다. 약어: B = 기준선, E = 악화, T = 치료. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S4: 낭포성 섬유증을 앓고 있는 일곱 명의 피험자로부터의 객담 샘플에 걸친 라벨링된(M+N(최대)) 및 표지되지 않은(M+0) 휘발성 물질의 상대적 풍부도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

V. L. V와 S. J.B. D.는 Entech Instruments Inc.의 전직 직원이었으며 K. W.는 Entech의 University Program의 회원입니다. J. P., J. K., C. I. R.은 선언할 이해상충이 없다.