Method Article

진공 보조 흡착제 추출을 통해 인간 관련 샘플에서 활발히 생산된 미생물 휘발성 유기 화합물 포획

DOI:

10.3791/62547

⸱

June 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California Irvine, 3Entech Instruments Inc.

In This Article

Summary

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이 프로토콜은 진공 보조 흡착제 추출 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 휘발성 유기 화합물을 추출하는 방법, Entech 샘플 준비 레일을 사용한 질량 분광법과 결합 된 가스 크로마토그래피 및 데이터 분석을 설명합니다. 또한 생물학적 샘플 및 안정한 동위원소 프로빙의 배양을 기술한다.

Abstract

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생물학적 샘플로부터의 휘발성 유기 화합물(VOC)은 기원을 알 수 없다. VOCs는 숙주의 미생물 군집 내에서 숙주 또는 상이한 유기체로부터 기원할 수 있다. 미생물 VOCs의 기원을 분리하기 위해, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 aeruginosa , 및 Acinetobacter baumannii의 박테리아 모노 및 공동 배양의 휘발성 헤드 스페이스 분석, 및 배설물, 타액, 하수 및 객담의 생물학적 샘플에서 안정한 동위원소 프로빙을 수행하였다. 모노- 및 공동-배양물을 사용하여 개별 박테리아 종으로부터의 휘발성 생산을 확인하거나 생물학적 샘플로부터 미생물의 활성 대사를 확인하기 위해 안정한 동위원소 프로빙과 조합하였다.

진공-보조 흡착제 추출(VASE)을 사용하여 VOCs를 추출하였다. VASE는 반휘발성 및 휘발성 화합물에 대한 사용하기 쉽고 상용화되고 무용제 헤드스페이스 추출 방법입니다. 추출 중에 사용되는 용매의 부족과 거의 진공 조건은 tert-butylation 및 고상 미세 추출과 같은 다른 추출 옵션과 비교할 때 상대적으로 쉽고 빠른 방법을 개발할 수있게합니다. 여기에 설명된 워크플로는 모노 및 공동 문화권의 특정 휘발성 서명을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 인간 관련 생물학적 샘플의 안정한 동위원소 프로빙의 분석은 일반적으로 또는 고유하게 생산되는 VOC를 확인했다. 이 백서는 살아있는 미생물 배양물의 안정적인 동위원소 조사와 함께 ASE의 일반적인 워크 플로우 및 실험 고려 사항을 제시합니다.

Introduction

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휘발성 유기 화합물 (VOCs)은 모든 유기체에서 방출되기 때문에 박테리아 검출 및 식별에 큰 약속을 가지고 있으며, 다른 미생물은 고유 한 VOC 서명을 가지고 있습니다. 휘발성 분자는 만성 폐쇄성 폐 질환1, 소변3의 결핵2, 인공호흡기 관련 폐렴4를 포함한 다양한 호흡기 감염을 검출하기 위한 비침습적 측정으로서 활용되었으며, 낭포성 섬유증(CF)을 가진 피험자를 건강한 대조군 피험자(5,6)와 구별하는 것 이외에 활용되었다. 휘발성 서명은 심지어 CF에서 특정 병원체 감염을 구별하기 위해 사용되었다 (스타필로코커스 아우레우스 7, 슈도모나스 aeruginosa 8,9, 및 S. 아우레우스 대 P. aeruginosa10). 그러나, 이러한 생물학적 샘플의 복잡성....

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Protocol

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1. 헤드스페이스 흡착펜(HSP) 및 샘플 분석 고려 사항

참고: 흡착제 Tenax TA를 함유하는 HSP는 광범위한 휘발성 물질을 포획하기 위해 선택되었다. Tenax는 다른 흡착제에 비해 물에 대한 친화력이 낮기 때문에 수분이 높은 샘플에서 더 많은 VOC를 포획 할 수 있습니다. Tenax는 또한 불순물 수준이 낮으며 재사용을 위해 컨디셔닝 될 수 있습니다. 흡착제 선택은 또한 GC-MS에 설치된 컬럼을 고려하여 이루어졌다( 물질의 표 참조).

  1. 샘플 추출에 사용된 것과 동일한 조건으로 배지 및/또는 샘플 블랭크를 추출하여 음성 대조군을 생성합니다.
  2. 추출된 샘플을 분석하기 전에 GC-MS에서 빈 HSP(이전에 깨끗하고 상당한 배경이 없는 것으로 확인됨)를 분석합니다. 샘플 유형 사이에서 블랭크를 실행한다(예를 들어, 박테리아 모노 컬쳐의 세 번의 반복실험, 블랭크, 박테리아 공동 배양의 세 번의 반복실험, 블랭크 등).
  3. 샘플 추출 및 분석 전에 향기로운 개인 위생 용품의 사용 또는 냄새 나는 음식의 소비를 제한하십시오. 이상적으로는 알코올이나 다른 휘발성 클리너로 세척되지 않은 생물 안전 후드에서 샘플을 적어도 30 분 동안 준비하십시오. ....

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Results

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S. aureus, P. aeruginosa, A. baumannii의 모노 및 공동 문화
모노 및 공동 배양은 박테리아 종 S. aureus, P. aeruginosa, 및 A. baumannii로 구성되었다. 이들은 인간의 상처와 만성 감염에서 발견되는 일반적인 기회 주의적 병원체입니다. 모노- 및 공동-배양물에 존재하는 휘발성 분자를 확인하기 위해, 200 rpm 교반으로 70°C에서 짧은 1-h 추출을 수행하였다. 24- 및 48-h 시점에서의 모노- 및 공동 배양물로부터, 43개의 주석이 달린 휘발성 분자가 검출되었고(도 2), 그 중 알데히드, 케톤, 알코올, 황산 화합물, 탄화수소, 카르복실산 또는.......

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Discussion

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시험관내 배양 및 인간 관련 샘플에서의 휘발성 생산을 확인하기 위해, P. aeruginosa, S. aureus 및 A. baumanii의 모노- 및 공동 배양물의 휘발성 분석 및 상이한 생물학적 샘플의 안정한 동위원소 프로빙을 수행하였다. 모노- 및 공동-배양물에 대한 분석에서, 휘발성 물질은 70°C에서 1시간 동안 짧은 추출을 수행하여 검출되었다. 모노 및 공동 배양의 휘발성 분석은 개별 종에 의해 그리고 다른 종과의 상호 작용 중에 생성 된 화합물의 조사를 허용했습니다. 다른 문화 유형과 시간대에 걸쳐 상대적 풍부함의 차이가있었습니다. 안정한 동위원소 프로빙 실험에서, 생물학적 샘플은 낭포성 섬유증을 앓고 있는 피험자로부터의 건강한 피험자로부터의 대변과 타액, 하수 및 가래를 포함하였다. 안정한 동위원소 프로파일링은 37°C에서 18시간 동안 추출함으로써 활발하게 생성된 휘발성 분자의 동정을 가능하게 하였다. 더 낮은 온도로 긴 추출 시간은 생물학적 샘플에 존재하는 미.......

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Disclosures

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V. L. V와 S. J.B. D.는 Entech Instruments Inc.의 전직 직원이었으며 K. W.는 Entech의 University Program의 회원입니다. J. P., J. K., C. I. R.은 선언할 이해상충이 없다.

Acknowledgements

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이 원고를 신중하게 편집해 주신 Heather Maughan과 Linda M. Kalikin에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH NHLBI (보조금 5R01HL136647-04)가 지원했습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
13C 포도당Sigma-Aldrich389374-1G
2-Stg 디아프 펌프Entech Instruments01-10-20030
20 mL VOA 바이알Fisher Scientific5719110
24 mm 검은색 구멍이 있는 캡, 격막 없음Entech Instruments01-39-76044B의 뚜껑 라이너를 제자리에 고정합니다
.Entech InstrumentsSP-L024S상단에 진공 밀봉을 할 수 있도록 합니다
.Entech Instruments5600-SPES5600 흡착 펜 추출 장치 -120 VAC
96-well 분석 플레이트Genesee25-224
뇌 심장 주입(BHI) 매체Sigma-Aldrich53286-500G
ChemStation 스토웨어애질런트
DB-624 컬럼애질런122-1364E60m, 0.25mm ID, 1.40미크론 필름 두께, GC-MS
중수소산화물시그마-알드리치151882-1L
Dexsi 소프트웨어Dexsi(오픈 소스)
GC-MS(7890A GC 및 5975C 비활성 XL MSD(3축 검출기 포함)애질런트7890A GC 및 5975C 비활성 XL MSD(3축 포함) 검출기
헤드스페이스 번들 HS-B01, 120VAEntech InstrumentsSP-HS-B01번들에 포함된 실행 헤드스페이스 추출용 항목
헤드스페이스 흡착 펜(HSP) - 빈Entech InstrumentsSP-HS-0
헤드스페이스 흡착식 펜(HSP) Tenax TA(35/60 메시)Entech InstrumentsSP-HS-T3560
마이크로 원심분리기 튜브(2mL)VWR53550-792
O-링Entech InstrumentsSP-OR-L024
샘플 준비 레일Entech Instruments
흡착식 펜 열 조절기Entech Instruments3801-SPTC
Todd Hewitt (TH) 미디어SigmaT1438-500G
는 흡착제 펜용 바이알 24mm 바이알 라이너는 펜이 바이알 5600 흡착 펜 추출 장치(SPEU) 트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
  2. Nakhleh, M. K., et al.

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