본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.
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방법 논문
세포 주기 차별 화상 진찰과 결합된 BrdU DNA 라벨링을 사용하여 글로벌 DNA 이중 가닥 끝 절제술의 평가
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
DNA 손상 반응(DDR)의 연구는 복잡하고 필수적인 분야이며, 이는 암 치료를 위한 DDR 표적 약물의 사용으로 인해 더욱 중요해졌습니다. 이러한 표적은 다양한 형태의 DNA 수리를 시작하는 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제(PARP)입니다. PARP 억제제(PARPi)를 사용하여 이러한 효소를 억제하는 것은 유방암 유형 1(BRCA1), BRCA2 또는 BRCA2(PALB2)의 파트너 및 국소화로 인한 동종 재조합(HR)-결핍세포에 대한 치료적 취약성을 부여하여 합성 치사를 달성한다.
PARPi로 처리된 세포는 DNA 이중 가닥 휴식(DSBs)을 축적한다. 이러한 휴식은 DNA 끝 절제 기계에 의해 처리되며, 단일 좌초 (ss) DNA 및 후속 DNA 수리의 형성으로 이어진다. BRCA1 결핍 맥락에서, DNA 절제술 억제제의 돌연변이를 통해 DNA 절제술을 통해 DNA 절제술을 재활성화, 와 같은 53BP1 및 DYNLL1, PARPi 저항을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 셀룰로에서 DNA 절제술을 모니터링할 수 있는 것은 DNA 수리 경로에 대한 명확한 이해와 PARPi 저항을 극복하기 위한 새로운 전략의 개발에 매우 중요합니다. 면역 형광 (IF) 기반 기술은 DNA 손상 후 글로벌 DNA 절제술의 모니터링을 허용합니다. 이 전략은 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)와 긴 펄스 게놈 DNA 라벨을 필요로합니다. DNA 손상 및 DNA 끝 절제술에 이어, 생성된 단일 좌초 DNA는 네이티브 조건하에서 항 BrdU 항체에 의해 구체적으로 검출된다. 더욱이, DNA 절제술은 세포 주기 마커를 사용하여 세포 주기의 다양한 단계를 구별하는 연구될 수 있다. S/G2 상에 있는 세포는 G1 세포가 비 동형 종결합 (NHEJ)를 연구하기 위하여 이용될 수 있는 반면, HR 내의 끝 절제술의 연구를 허용합니다. 세포 주기 차별과 결합된 이 IF 방법에 대한 자세한 프로토콜은 이 논문에 설명되어 있습니다.
서론
DNA 수리 인자의 변조는 암 치료를 위한 끊임없이 진화하는 방법, 특히 DNA DSB 복구 결핍 종양 환경에서. 특정 수리 요인의 억제는 DNA 손상 에이전트에 암세포를 민감하게 하는 데 사용 되는 독창적인 전략 중 하나입니다. 연구의 수십 년 치료 전략 선택에 대 한 바이오 마커로 DNA 복구 유전자의 다양 한 돌연변이의 식별으로 주도 1. 결과적으로 DNA 수리 분야는 다양한 치료법을 보장하기 위한 약물 개발의 허브가 되어 개인화된 의학 개념을 강화합니다.
DSB는 NHEJ와 HR2의 두 가지 주요 경로에 의해 수리됩니다. NHEJ 통로는 오류가 발생하기 쉽고, 두 DNA 끝을 DNA 최종 처리가 거의 또는 전혀 없이 빠르게 결합하고 단백질 키나아제(DNA-PKcs), Ku70/80 복합체, 53BP1 및 RIF1 단백질3와 관련이 있습니다. 대조적으로, HR은 BRCA14에 의해 시작된 충실한 기계장치입니다. HR 수리의 필수적인 단계는 DNA-말 절제 과정으로, 이는 3'-OH 끝이 있는 단면(ss) DNA로 이어지는 깨진 끝의 저하입니다. BRCA1은 5'에서 ....
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프로토콜
1. 세포 배양, 치료 및 커버 슬립 준비
참고: 모든 세포 도금, 경질 및 치료는 조사 외에도 멸균 세포 배양 후드 에서 이루어져야 합니다.
- 1일차
- 6웰 플레이트에 필요한 만큼의 조건에 대해 각각 하나의 커버슬립을 배치합니다. 플레이트 ~150,000 Fefection 또는 약물 치료를 위한 HeLa 세포, 원하는대로.
참고: 횡단하는 경우 도금 시 역경을 하는 것이 좋습니다. 역성 형질은 세포가 추가되기 전에 커버슬립에 형질 전환 믹스를 추가하여 수행됩니다. 따라서 세포가 준수되기 전에 전환이 시작됩니다. 반대로, 전방 형질은 일반적으로 다음 날에 표면에 대한 경피 혼합 후 준수의 첨가이다. 그러나, 세포가 부착할 수 있는 충분한 시간이 주어지면 같은 날에 이 작업을 수행할 수 있다. - 이 방법에 대 한, 사용 4 우물: 음 1: siRNA 제어 (siCTRL 이라고); 음 2: PARP-1에 대한 siRNA (siPARP-1); 음 3: 치료되지 않은; 음 4: 조사 전에 5 μM BMN673 1 h로 처리되는 세포.
참고: 이 프로토콜에서는 모든 테스트가 조사된 조건하에서 수행되었습니다(섹션 1.3 참조). - 형질 프로토콜은 최대 3 일 동안 배양 할 수 있....
- 6웰 플레이트에 필요한 만큼의 조건에 대해 각각 하나의 커버슬립을 배치합니다. 플레이트 ~150,000 Fefection 또는 약물 치료를 위한 HeLa 세포, 원하는대로.
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결과
이 프로토콜에서, 브로모톡시리딘(BrdU)-기반 분석체는 조사 유도손상에 대한 HeLa 세포의 절제 반응을 정량적으로 측정하는 데 사용되었다. 생성된 ssDNA 트랙은 면역 형광 염색 후 뚜렷한 초점으로 시각화됩니다 (도 1A). 확인된 포시는 핵에서 BrdU 염색의 총 통합 강도로 정량화되고 발현되었다(도 1B, 보충 도도 S1, 보충 도S2, 및 보충 도 S3). 이는 총 핵 강도보다 신뢰성이 낮지만, 부분적으로 BrdU foci의 가변 크기로 포시 수 또는 평균 초점 강도를 측정할 수 있다.
NHEJ와 HR의 장거리 절제술의 결과로 단거리 절제술을 구별하기 위해, 공동 염색은 항 PCNA 항체를 사용하여 S-phase를 통과하는 세포를 식별하도록 수행하였다(도 1
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토론
이 논문은 셀룰로의 DNA 절제술의 변이를 측정하기 위해 IF 염색을 사용하는 방법을 설명합니다. DNA 절제술에 대한 효과를 관찰하기위한 현재 표준은 RPA 염색을 통해; 그러나, 이것은 DNA 복제에 의해 영향을 받을 수 있는 간접적인 방법입니다. 이전에는 BrdU-정산 DNA 절제술 IF 기술이 BrdU 양성 및 BrdU-음성 세포의 결과로 발생하는 강도를 분류하기 위해 설명되었습니다. 이 방법은 HR을 거치지 않는 세포가 높은 BrdU 강도14,15,16의 결과로 배경 또는 미토콘드리아 염색으로 인해 양성으로 계산될 수 있도록 허용하였다. 본 논문에 기재된 방법의 1차 참신은 PCNA 염색의 첨가이며, 이는 세포 주기의 S 및 G2 단계에 대한 선택성을 허용하여, 결과 BrdU 신호가 절제에 기인하고 따라서, homology 지향 수리에 기.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 뛰어난 기술 적 조언에 대한 마리 크리스틴 카론 감사합니다. 이 작품은 건강 연구 J.Y.M (CIHR FDN-388879)의 캐나다 연구소에서 자금 지원을 받고 있습니다. J.-Y.M. DNA 수리 및 암 치료제에서 1단계 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다. J.O'S는 FRQS 박사 과정 학생 펠로우이며, S.Y.M박사 후 펠로우입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa 568 염소 안티 토끼 | 분자 프로브 | A11011 | 1:800 |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 | 분자 프로브 | A11001 | 1:800 |
| 안티 PARP1 (F1-23) | 수제 | 1:2500 | |
| 안티 PCNA (SY12-07) | Novus | NBP2-67390 | 1:500 |
| 안티 알파 튜불린 (DM1A) | Abcam | Ab7291 | 1:100000 |
| anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1:1000 |
| 탁상용 X선 조사기 | 셀 라드 | ||
| BMN673 | MedChem Express | HY-16106 | |
| 브로모데옥시우리딘(BrdU) | 시그마 | B5002 | |
| BSA | 시그마 | A7906 | |
| 세포 프로파일러 | Broad Institute | V 3.19 | https://cellprofiler.org/ |
| Curwood Parafilm M 실험실 포장 필름 4in / 250 ft | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen Life Technology | D1306 | |
| DMEM 고포도 | 당 Fisher scientific | 10063542 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fetal 소 혈청 | Gibco | 12483-020 | |
| Fisherbrand 커버 안경: 사각형 22 x 22 | Fisher scientific | 12 541B | |
| 형광 현미경 | Leica | DMI6000B | 63x 침수 대물렌즈 |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HERACELL 160I CO2 인큐베이터 CU 1-21 TC 120V | VWR | 51030408 | 37% CO2 |
| MgCl2 | BioShop Canada | MAG520.500 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002.10 | |
| 바늘 | |||
| PBS 1x | Wisent Bio Products | 311-010-CS | |
| PFA 16% | Cedarlane Labs | 15710-S(EM) | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen Life Technology | P-36930 | |
| RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| siPARPi | Dharmacon | AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT | |
| siRNA control | Dharmacon | UUCGAACGUGUCACGUCAA | |
| 나트륨 Deoxycholcate | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| 설탕 | BioShop Canada | SUC507.5 | |
| Tris-base | BioShop Canada | TRS001.5 | |
| Trition X-100 | Millipore Sigma | T8787-250ML | |
| Tween20 | Fisher scientific | BP337500 | |
| 핀셋 |
참고문헌
- Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-path....
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