Method Article

뮤린 폐 판막의 상관 화상 진찰을 위한 수술 및 견본 처리

DOI:

10.3791/62581

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August 5th, 2021

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1Center for Electron Microscopy and Analysis, The Department of Materials Science and Engineering, Ohio State University, 2Center for Regenerative Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 3Thermo Fisher Scientific

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 우리는 뮤린 폐 판막의 절제, 가압, 고정 및 이미징에 대한 상관 관계 워크플로우를 설명하여 총 형태 및 국소 세포외 매트릭스 구조를 결정합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

심장 판막 관련 질병 (HVD)의 근본 원인은 애매합니다. Murine 동물 모델은 HVD를 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공하지만, 여러 길이의 저울에 걸쳐 구조와 조직을 정확하게 정량화하는 데 필요한 수술 및 기악 전문 지식은 발전을 저해했습니다. 이 작품은 다른 길이 비늘에서 심장 판막을 묘사하기위한 뮤린 해부, en 블록 염색, 샘플 처리 및 상관 관계 이미징 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 수압기압은 심장판막 형성을 화학적으로 고정하여 측두체 이질성을 제어하는 데 사용되었습니다. 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT)은 심장 판막의 형상을 확인하고 직렬 블록 페이스 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)에 필요한 다운스트림 샘플 처리에 대한 참조를 제공하는 데 사용되었습니다. 세포외 매트릭스(ECM)의 고해상도 직렬 SEM 이미지를 촬영하고 재구성하여 조직의 로컬 3D 표현을 제공합니다. μCT 및 SBF-SEM 이미징 방법은 폐 밸브를 가로지르는 공간 적 변화를 극복하기 위해 상관관계가 있었다. 제시된 작품은 폐 판막에만 있지만, 이 방법론은 생물학적 시스템의 계층 적 조직을 설명하기 위해 채택될 수 있으며 여러 길이 의 구조 특성에 중추적인 역할을 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐 판막(PV)은 오른쪽 심실과 폐 동맥 사이의 단방향 혈류를 보장하는 역할을 합니다. 폐 막막 기형은 선천성 심장 질환의 여러 형태와 연관된다. 선천성 심장 판막 질환 (HVD)에 대한 현재 치료는 환자의 일생 동안 다중 침습적 수술을 필요로 할 수있는 valvular 수리 또는 밸브 교체입니다1. 심장 판막의 기능은 구조에서 유래되는 것으로 널리 받아들여졌으며, 종종 구조 기능 상관 관계라고도 합니다. 보다 구체적으로, 심장의 기하학적 및 생체 역학적 특성은 그 기능을 지시합니다. 기계적 특성은 차례로 ECM의 조성 및 구성에 의해 결정됩니다. 뮤린 심장 판막의 생체역학적 특성을 결정하는 방법을 개발함으로써, 형질전환 동물 모델은 심장 판막 기능 및 기능 장애2,3,4,5에ECM의 역할을 심문하는 데 사용될 수 있다.

murine 동물 모형은 다른 종에 비교된 마우스에서 더 쉽게 유효하기 때문에 인간적인 모형이 분자 연구 결과를 위한 표준으로 오랫동안 여겨져 왔습니다. ....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서 동물의 사용은 프로토콜 AR13-00030에 따라 전국 어린이 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 따라했다.

1. 폐 밸브 절제

  1. 마우스 해부에 필요한 도구를 자동으로 복제합니다. 여기에는 미세 가위, 마이크로 집게, 마이크로 혈관 클램프, 클램프 적용 집게, 마이크로니들 홀더, 스프링 가위 및 리트랙터가 포함됩니다.
  2. 수술 전에 최소 2 주 동안 모든 마우스를 수용하십시오. C57BL/6 마우스를 제거, 약 1 년, 그들의 케이지에서 무게, 다음 케타민 / 자일라진 칵테일 (3:1 케타민 : 자일라진, 0.01 g 당 mL) 과다 복용으로 안락사.
  3. 트레이에 등소 재림 위치에 마우스를 놓고 테이프로 팔다리를 고정합니다. 일단 고정되면, thoracotomy을 수행합니다.
    1. 어떤 과잉 지방 조직 및 근막을 제거 하 여 심장을 노출.
    2. 오른쪽 아트리움을 제거하고 실온 식염수 용액 (0.9 % NaCl)으로 왼쪽 심실을 통해 perfuse. 관류는 30 s를 통해 약 20 mL를 취해야한다. 이것은 마우스의 멸종을 초래한다.
  4. 우수한 베나 카바, 열등한 베나 카바, 폐 동맥 및 대동맥을 분리하여 심장 전체를 제거하....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

가압 튜브에 폐 동맥의 해부학은 도 1A에도시된다. 정수압의 적용에 따라 폐트렁크는 폐밸브 전단지가 폐쇄된 구성에 있음을 나타내는복사(도 1B)를분해한다. 폐 밸브 형태는 μCT에 의해 확인되었다. 이 경우, 전단지는 동술(closed)이고 무효화는 원형(도2A)이었다. 도 2B,C는 고정(도 2B) 또는 동맥 붕괴(도2C)에의해 부적절한 폐 밸브 가압의 다양한 정도를 나타낸다.

샘플 블록 트리밍은 μCT 볼륨 렌더링에 의해 유도되었다. 이 경우, 부노 관 접합에 평행한 평면을 슬라이스 방향으로 선택되었다. 해부학적 랜드마크를 사용하.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

심실제거는 두 가지 목적을 제공합니다. 첫째, 심실측을 대기압에 노출시켜 폐밸브의 동맥측으로부터 경진압력을 가해 폐트렁크의 비틀림을 방지하기 위한 안정적인 베이스를 제공한다. 가압 하는 동안, 폐 트렁크는 복사 하 고 열등 하 게 분산, 뒤틀린 경향이 만들기, 폐 트렁크의 붕괴를 일으키는. 식염수 용액으로 폐 밸브를 미리 로드하면 가압이 적절하고 시스템에 누출이 있는지 확인하기 위해 추가 품질 검사를 제공합니다. 기본 고정제의 동작은 몇 초 의 순서로 빠르며 식염수 용액을 가진 정력 전하없이 폐 밸브는 임의의 형태로 고정됩니다. 사전 하중없이 폐쇄 된 폐 밸브의 성공률은 약 10 %-20 %였습니다. 사전 로딩 단계로 성공률은 90%를 넘었습니다.

이 응용 프로그램에 대해 μCT 및 SBF-SEM 이미징 조건이 조정되었습니다. 폐 밸브는 완전히 뻗어있을 때 두께가 10 μm 미만일 수 있습니다. 일반적으로 기능을 해결할 수 있도록 3 개의 복셀의 임계값이 필요합니다. 따라서 μC.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 부분적으로 R01HL139796 및 R01HL128847 교부금으로 지원되며 CKB 및 RO1DE028297 및 DWM용 CBET1608058에 지원됩니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25% 글루타르알데히드 (aq)EMS162101차 정착 성분
0.9% 염화나트륨 주입호스피라 주식회사NDC 0409-4888-10
1mL 주사기BD309659
10mL 주사기BD309604
200 프루프 에탄올EMS15055
22G 바늘BD305156
3mL 주사기BD309657
3방향 마개Smiths Medical ASD, Inc.
4% 사산화오스뮴EMS19150염색 성분
4% 파라포름알데히드(aq)EMS157-4-100주요 고정 성분
흡수성 지혈Ethicon1961
아세톤EMS10012
검은색 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사, 10-0ARO수술 기구 주식회사
블랙 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사, 6-0ARO수술기구 CorporationSN-1956
C57BL / 6 마우스Jackson Laboratories664약 1 yo
염화칼슘Sigma-Aldrich10043-52-4
집게 적용 집게FST00072-14
코튼 팁 애플리케이터Fisher Scientific23-400-118
DPBSGibco14190-144
Dumont #5 forcepFST11251-20
Dumont #5/45 forcepsFST11251-35
Dumont #7 fine forcepFST11274-20
Durcupan ACM resinEMS14040임베딩용
파인 시저FST14028-10
Heliscan microCTThermo Fisher ScientificMicro-CT
케타민 염산염 주입Hospira Inc.NDC 0409-2053
L- 아스파르트 산Sigma-Aldrich56-84-8염색 성분
질산 납EMS17900염색 성분
저진공 후방 산란 검출기Thermo Fisher ScientificVSDBSSEM 후방 산란 검출기
마이크로 아드슨 겸FST11018-12
Millex-GP 필터, 0.22 um, PES 33mm, 비멸균EMD MilliporeSLGP033NS
부직포 송McKesson Corp.94442000
칼륨 헥사시아노페레이트(II) 삼수화물Sigma-Aldrich14459-95-1염색 성분
수산화칼Sigma-Aldrich1310-58-3
압력 모니터 라인Smiths Medical ASD, Inc.MX562
식염수(멸균 0.9% 염화나트륨)(주)호스피라NDC 0409-0138-22
크기 3 BEEM 캡슐EMS69910-01임베딩 용기
나트륨 카코딜 레이트 삼수화물시그마-알드리치6131-99-3버퍼
Solibri 견인기FST17000-04
스퍼터, 탄소 및 전자 빔 코터LeicaEM ACE600골드 코터
수술 현미경LeicaM80
Thiocarbohydrazide (TCH)EMS21900염색 성분
Tish needle holder/ypepMicrinsMI1540
TrimmerWahl9854-500
Uranyl acetateEMS22400염색 성분
Volumescope 주사 전자 현미경Thermo Fisher ScientificVOLUMESCOPESEM직렬 블록 얼굴 주사 전자 현미경
Xylazine 멸균 솔루션Akorn Inc.나다# 139-236
MX5311L제 TI38402자 륨

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
  2. Ng, C. M., et al.

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