방법 논문

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

DOI:

10.3791/62591

⸱

2021년 7월 7일

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Irvine, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine

이 논문에서

요약

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미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

초록

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배아 미세 주입 기술은 곤충 종의 많은 분자 및 유전 연구에 필수적입니다. 그(것)들은 안정적이고 헤아린 방식으로 곤충 생식선으로 유리한 특성뿐만 아니라 관심있는 유전자를 인코딩하는 외인성 DNA 단편을 소개하는 수단을 제공합니다. 결과 형질전환균은 기본적인 질문에 대답하거나 실제 응용분야에서 사용되는 통합 된 DNA의 발현으로 인한 표현성 변화를 연구 할 수 있습니다. 이 기술은 간단하지만 효율성을 극대화하는 수준의 기술을 달성하기 위해서는 조사자의 인내와 연습이 필요합니다. 여기에 표시 아프리카 말라리아 모기의 배아의 미세 주입을위한 방법이다, Anopheles 감비아. 목표는 개발 된 생식선 (극) 세포에서 채택 될 수 있도록 배아에 미세 주입 외인성 DNA에 의해 전달하는 것입니다. 트랜스포지아제, 정수, 재조합, 또는 기타 뉴클레아제(예: CRISPR 관련 단백질, Cas)의 주입된 DNA로부터 발현은 염색체로의 공유 삽입으로 이어지는 이벤트를 유발할 수 있다. 이러한 기술에서 생성된 트랜스제닉 An. 감비아는 면역 계통 구성 요소, 혈액 공급에 관여하는 유전자 및 후각 시스템의 요소에 대한 기본 연구에 사용되었습니다. 또한, 이러한 기술은 말라리아 기생충의 전송을 통제하는 것을 도울 수 있는 특성을 가진 An. 감비아인 긴장을 생성하는 데 이용되었습니다.

서론

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미세 주입 기술은 1900년대 초부터 유기체를 실험적으로조작하는 데 사용되어 왔다. 미세 주입은 기본적인 생물학적 기능을 연구하고 원하는 유기체의 생물학에 중요한 변화를 도입하는 데 사용되었습니다. 미세 주입 기술은 벡터 생물학자에게 특히 관심이 있었으며 벡터 게놈2-11을조작하는 데 널리 사용되어 왔다. 절지동물 벡터의 트랜스게네스 실험은 종종 벡터의 체력을 감소시키거나 전달되는 병원체에 대한 내화성을 증가시키는 변화를 제정함으로써 병원균을 전송하는 데 벡터를 덜 효율적으로 만드는 것을 목표로 합니다. 모기는 다양한 인간 병원체를 전송하고 전 세계적으로 이환율과 사망률에 중요한 영향을 미칩니다. 모기의 아노페스 속은 인간 말라리아 기생 병원균, 플라스모듐 spp를 전송합니다. Anopheles를 가진 유전 공학 실험은 생물학을 더 잘 이해하고 새로운 말라리아 제거 전략을 개발하기 위한 노력에 있는 이 모기의 벡터 용량을 감소시키는 것을 목표로 했습니다.

전 세계적으로 가장 말라리아 감염을 기여하는 모기 벡터는 Anopheles 감비아 종 복합체에 있습니다. 그러나, 성공적인 유전자 실험의 대다수는 인도 아대륙의 말라리아 벡터에, Anopheles stephensi에수행되었습니다. 실험실 적응 Anopheles 감비아균의 많음이 존재하는 동안, 형질전환 Anopheles 감비아의 수는. 이 다름에 대한 이유는 알려지지 않았지만, Anopheles 감비아배아는 Anopheles stephensi보다성공적인 전염을 주입하고 달성하기가 더 어렵다고 생각됩니다. 이 프로토콜은 미세 주입을 통해 Anopheles 감비아아아의 전염을 달성하는 데 지속적으로 성공한 것으로 입증된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 이전에 Hervé Bossin과 마크 베네딕트(12)에 의해 개발 된 방법을 기반으로하고 몇 가지 추가 세부 사항 및 변경은 과기 생성의 효율성을 높이기 위해 발견 된 추가.

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프로토콜

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1. 미세 주입을 위한 모기 준비

  1. 케이지13 (~5000cm3)을~100명의 수컷과 200-300명의 암컷 1-2일 성인 1-2일 성인 1-2일 동안 종자하고 2일 동안 짝짓기를 허용합니다.
  2. 짝짓기 기간 이후에는 인공 수식 장치로 2mL의 혈액을 사용하여 모기에게 혈액 식사를 제공하거나 곤충 관행에 따라 마취 된 동물을 살 수있습니다(14) 다음 날 모기에게 두 번째 혈액 식사를 제공하여 모든 짝짓기 암컷이 먹이를 줄 기회가 있고 부분적으로 먹이는 모기가 완전히 강화되도록합니다.
  3. 두 번째 혈액 식사 후 2-4 일 배아 수집을 위해 모기를 활용하십시오.
    참고: 라발 영양은 성인의 견고성과 생식 적합성에 중요합니다. 건강한 곤충을 후면하는 방법에 대한 자세한 내용은 베네딕트 외 (2020)를 참조하십시오14. 모기가 인공 피더에 공급되거나 마취 된 동물을 살 때 계란 누워에 중요한 차이가 관찰되지 않았습니다. 곤충에서 Anopheles 감비아에 일상적으로 사용되는 방법을 사용하십시오.

2. 배아 준비

  1. 양단에서 열리도록 절단된 투명 50mL 원뿔튜브에 20~30명의 암컷을 배치하고 한쪽 끝에 라텍스 치과필름으로 덮여 있고 다른 한쪽 끝에는 나일론 메쉬및 필터 종이를 배치한다(그림1).
    참고: 모기는 필터 용지에 알을 입금하고 나일론 메쉬는 필터 용지를 제자리에 단단히 고정시합니다. 모기 계란은 형상의 원통형, ~500 μm 길이, ~200 μm의 직경은 가장 넓은 지점에서, 전방 및 후방 끝에서 가늘어지게한다(도 2).
  2. 모기가 가득한 튜브를 작은 (60mm x 15mm) 페트리 접시에 이중 증류수(ddH2O)로 채우십시오. 튜브와 접시를 인큐베이터에 28°C에서 45분 동안 놓습니다(그림3).
  3. 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 튜브를 빈 케이지에 삽입합니다. 튜브를 살짝 눌러 모기가 날아와 모든 모기가 날아오면 케이지에서 튜브를 제거합니다.
  4. 튜브가 모기가 없는 경우, 바닥 고리를 풀고 나일론을 제거하고 집게를 사용하여 튜브에서 계란이 있는 필터 용지를 조심스럽게 제거합니다. 필터 용지를 ddH2O로 적신 필터 용지 층이 들어 있는 플라스틱 페트리 접시(100mm x 15mm)에 놓습니다.
  5. 계란을 관찰하십시오. 밝은 회색색(그림4)이정렬할 수 있는 지점까지 숙성된 계란.
    1. 계란이 여전히 흰색인 경우 인큐베이터로 돌려보내 5분마다 색상을 확인하십시오. 흰 알은 깨지기 쉽고 쉽게 파열되며 주입 과정 이후에 잘 생존하지 못하여 부화가 낮습니다.
    2. 짙은 회색이나 검은 색의 달걀은 너무 많이 노화되었습니다. 사용하지 마십시오.

3. 배아 정렬

  1. 나일론 블로팅 멤브레인(2cm x 1cm)을 면도날로 자르고 가장자리가 깔끔하게 다듬어졌는지 확인합니다.
    참고: 가장자리가 직선이 아닌 경우 주사 과정에서 계란이 멤브레인에 제대로 부착되지 않습니다.
  2. 유리 슬라이드에 멤브레인을 넣고 필터 용지 (2cm x 2cm)로 멤브레인을 덮어 멤브레인 필터의 ~ 1mm를 발견(그림 5).
    참고: 현미경 슬라이드를 사용하기 전에 깨끗하게 하고 깨끗한 집게를 사용하여 멤브레인 필터를 조작합니다.
  3. 계란으로 deionized H2O와 필터 종이를 적시면 장기간 건조하면 죽습니다.
    참고: 배아가 주입 과정에서 움직이기 때문에 종이에 너무 많은 물을 넣지 말고 배아가 건조되는 것을 방지하기에 충분한지 확인하십시오(그림6A,B). 과도한 물은 필터 용지로 흡수하여 제거할 수있습니다.
  4. 30-50개의 배아를 페인트 브러시(크기 #0)로 멤브레인 가장자리로 부드럽게 옮기습니다. 브러시를 사용하여 복부 측(볼록)이 위쪽으로 향하도록 슬라이드에서 부드럽게 굴려 멤브레인을 따라 계란을 수직으로 정렬합니다.
  5. 모든 계란을 미세 주입 현미경으로 관찰할 때, 후방 끝(더 뾰족한, 도 6A,B)이다운 위치에 있고 바늘로 ~15°의 각도를 형성할 수 있도록 모든 계란을 동일한 방향으로 지향한다(도6C). 멤브레인의 전체 가장자리를 계란(30-50)으로 정렬하고 슬라이드를 현미경 아래에 배치하여 주입합니다.
    참고: 계란을 신중하게 선택하십시오. 흰색(너무 젊거나 개발되지 않은) 또는 어두운 회색(너무 오래되어 바늘을 부러뜨리고) 비정상적인회색(그림 7)을버리십시오. 필터 용지가 항상 촉촉하게 유지되는지확인합니다.

4. DNA 준비

  1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 내독신없는 DNA 플라스미드 맥시 프레프 키트와 함께 최소한 주입을위한 플라스미드 DNA를 정화합니다.
  2. 4°C에서 30분 동안 냉장 원심분리기에서 PCR 급 물과 원심분리기의 DNA를 17,100 x g로 재차식합니다. 그런 다음, 상체를 새롭고 깨끗한 1.5 mL 원문 튜브로 옮김합니다. 조심스럽게 마이크로 파이펫은 열에서 원치 않는 미립자 물질을 전송하지 않도록합니다.
  3. 3M 나트륨 아세테이트의 1/10 부피와 100% 에탄올의 2배 부피를 사용하여 DNA의 두 번째 강수량을 수행합니다.
  4. 1000 ng/μL의 최종 플라스미드 농도를 위해 PCR 급 수의 300-500 μL에서 DNA를 재연하여 300-400 ng/μL의 최종 플라스미드 농도를 위해 플라스미드 칵테일을 주입 버퍼에 혼합하고 10-20 μL 알리쿼트를 만듭니다.
    참고: DNA는 -20°C에서 저장될 수 있다. DNA 미세주입 알리따트는 -20°C, 또는 RNA 성분을 사용하는 경우 -80°C에서 저장될 수 있다. 점도가 바늘이 막히게 하기 때문에 주사 믹스에서 DNA의 800 ng/μL을 초과하지 마십시오.

5. 바늘 준비

  1. 프로그래밍 가능한 마이크로 파이펫 풀러를 사용하여 10cm 석영 모세 혈관을 당겨 바늘을 만듭니다.
  2. 끝이 잘 형성되었는지 확인하기 위해 현미경의 밑에 바늘을 검사합니다. 프로그래밍 가능한 풀러의 바늘 설정이 터미널 끝에서 ~0.5mm를 테이퍼하기 시작하고 미세 한 점으로 끝나는 팁을 생성하는지 확인하십시오 (그림 6참조). 쉽게 깨는 바늘은 일반적으로 테이퍼의 너무 오래있다.
    참고: 조건은 바늘 풀러에 따라 다를 수 있습니다(저자는 요청 시 사용하는 프로그래밍 가능한 풀러에 대한 설정을 사용할 수 있습니다. 저널 제한은 특정 브랜드를 인용에서 우리를 방지). 바늘은 손으로 당길 수 있지만 대부분의 실험실에서 사용할 수없는 기술 세트가 필요합니다.

6. 배아 미세 주입

  1. 마이크로 로더 팁을 사용하여 바늘을 DNA 혼합물 2 μL로 채웁니다. 바늘 홀더에 바늘을 삽입하고 자동 압력 펌프 튜브(도 8)를연결합니다.
  2. 중요: 바늘을 정렬하여 슬라이드의 평면과 15° 각도를 만들 수 있도록합니다(그림 8).
  3. 바늘 끝을 조심스럽게 만져서 바늘 끝을 열고 바늘 의 끝을 삽입하여 10 μm≤ 후면 극에 삽입하십시오. 성공적인 주사는 계란 내의 세포질의 작은 운동으로 이끌어 낼 것입니다.
  4. 현미경 동축 단계 컨트롤을 사용하여 다음 계란으로 이동하여 주사를 계속하십시오.
    1. 바늘 끝이 열려 있고 막히지 않았는지 확인하려면 다른 배아에 들어가기 전에 주입 버튼을 누르고 바늘의 개구부에서 작은 물방울을 시각화하십시오.
    2. 바늘이 막히면 클리어 버튼을 눌러 바늘을 지우고 물방울 시각화 테스트를 반복합니다. 바늘 팁 개구부가 약간 커지면 필요에 따라 압력을 조정하여 액적의 크기가 작게 유지되도록 합니다.
    3. 바늘 1개에 ~40-50알을 주입합니다.
      참고: 필터 용지가 항상 촉촉하게 유지되는지 확인합니다. 바늘에 충분한 역압을 유지하여 지워지도록 하십시오. 막힐 수 없는 바늘은 새 바늘로 교체해야 합니다. 배아 배치, 바늘 삽입 및 주사단계의 수평 이동을 위한 동축 조절이 있는 현미경으로 쉽게만들어집니다(그림 9).
  5. 주사가 완료된 후, 필터 종이가 늘어선 유리 용기에 계란을 헹구고 50mL의 50mL의 탈온화 H2O(그림10)로채워지게 한다.
    참고: 배아는 주입 후 2일 동안 부화하기 시작하고 3-5일 정도 걸릴 수 있습니다. 부화 된 첫 번째 인스타 애벌레는 즉시 (매일 2 번 확인) 물과 음식이있는 깨끗한 용기로 옮겨야합니다.

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결과

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설명된 미세 주입 프로토콜의 적용의 대표적인 예는 카르발라-Lejarazú 외5에서발견될 수 있다. 여기서 의도는 An. gambiae의실험실 균주 G3의 세균에 자율 적인 유전자 구동 시스템을 삽입하는 것이었습니다. 이 시스템은 이 종의 제3 염색체에 대한 추기경 정형골 궤적 궤적(Agcd)을 대상으로 설계되었으며, 이는 3-하이드록시키누레닌의 환전을 xanthommatin으로 촉매하는 헴 과록시다아제, 옴모크롬 생합성의 마지막 단계(도11)를대상으로 설계되었다. 동질 유전자 드라이브 함유 모기는 유충, 푸파 및 새로 나타난 성인이 적목 현상형을 가진 기능 상실 추기경 돌연변이체입니다. 드라이브 시스템을 포함하는 플라스미드, pCO37은 An의 규제 요소를 제어하에 연쇄상 구균 pyogenes Cas9 (SpCas9) 엔도누셀리스를 표현한다. 감...

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토론

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CRISPR/Cas9와 같은 정밀하고 유연한 유전 공학 기술의 가용성이 증가함에 따라 형질 전환 생물은 이전보다 보다 간단하고 안정적인 방식으로 개발될 수 있습니다. 이 공구는 연구원이 병원체 (인구 수정) 또는 헤아릴 수 있는 불임 (인구 억제)에 내화성의 원하는 속성을 달성에 아주 가까운 모기 벡터의 형질전환균을 만들 수 있었습니다. 그러나 가장 안전하고 안정적인 유전자 변형 모기를 개발하기 위해서는 추가 형질 전환선을 생성하고 평가하여 현장 연구를 위해 최적의 라인을 선택해야합니다. 설명된 프로토콜은 인구 수정 및 억제 전략을 위해 추가 후보자를 개발할 수 있도록 Anopheles gambiae 형질형 형질전환생성의 효율성을 높일 수 있습니다.

설명된 미세 주입 절차는 모기 또는 그밖 절지동물 벡터의 micro주입을 일상적으로 수행하는 실험실에서 유효할 가능성이 있는 장비 및 재질을 이용합니다. 프로토콜 전체의 세부 사항에 주의를 유지하는 것이 중요합니다. ...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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드루실라 스틸링거, 키오나 파커, 패리시 파월, 매들린 노톨리에게 모기 축산에 감사드립니다. 기금은 캘리포니아 대학, 어바인 말라리아 이니셔티브에 의해 제공되었다. AAJ는 캘리포니아 대학교 어바인의 도널드 브렌 교수입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x 미세주입 완충액--1 mM NaHPO4 완충액, pH 6.8, 50 mM KCl
블로팅 멤브레인(Zeta-Probe GT 게놈 테스트 블로팅 멤브레인)Bio-Rad2x1cm 조각으로 깔끔하고 직선적으로 절단
원뿔형 튜브 50ml(일회용 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌)Fisher 브랜드엔드 컷
탈이온수 또는 이중 증류수(ddH20) Mili-Q세척 병에 
해부 현미경 라이카 Leica MZ12배아 정렬용
집게 5 호 크기 
유리 용기 PyrexNo. 3140125 x 65
유리 슬라이드 Fisher 브랜드번호 12-549-375x26 mm
인큐베이터Barnsted Lab-line모델 번호 15028 ° C
KCl50mM
라텍스 치과용 필름 Crosstex InternationalNo. 19302
마이크로인젝터서터 기기XenoWorks 디지털 마이크로인젝터
마이크로로더 피펫 팁 에펜도르프 20 & 마이크로; L 마이크로로더 epT.I.P.S.
MicromanipulatorSutter InstrumentXenoWorks Micromanipulator
Micropipette 라이닌 20 & 마이크로; L
마이크로피펫 풀러 Sutter InstrumentSutter P-2000 마이크로피펫 풀러
현미경 LeicaDM 1000 LED 또는 M165 FC마이크로주입용
최소 섬유 여과지 Fisher 브랜드번호 05-714-4크로마토그래피 종이, 두꺼운 
모기 MR4, BEI ResourcesAnopheles gambiae, 짝짓기 성인 암컷, 폐하 후 4-5일 후 혈액 공급
NaHPO4 buffer 1 mM, ph 6.8
나일론 메시
페인트 브러시BlickNo. 05831-7040세밀, 크기 4/0
페트리 디쉬플라스틱, (60x15 mm, 90x15 mm)
아세트산  3M
석영 유리 모세관 셔터 기기번호 QF100-70-10필라멘트 포함, 1mm OD,  ID 0.7 10cm 길이
물 PCR 등급 로슈No. 03315843001
나트륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).
  2. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  3. Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587(2011).
  4. Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  5. Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
  6. Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
  7. Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
  8. Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010(2016).
  9. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  10. Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
  11. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
  12. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).
  13. Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440(2019).
  14. Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838(2020).
  15. Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).

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