Method Article

배아 개발에서 퇴화까지 의 상호 디스크의 광학 단면 및 시각화

DOI:

10.3791/62594

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July 8th, 2021

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1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 2Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 3Institute for Bioinformatics and Medical Informatics, Faculty of science of the University of Tübingen, 4Medical faculty of the University of Tübingen, 5Bavarian Health and Food Safety Authority

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 광학 단면 법을 사용하여 추간판의 골문 섬유증에서 공간 연골 세포 조직을 조사하는 방법을 제시한다.

Abstract

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무척추 동물 디스크 (IVD) 변성은 요통의 주요 원인이며 영향을받는 개인을위한 높은 수준의 손상을 수반합니다. 디스크 퇴행성을 해독하고 재생 접근법을 개발할 수 있도록 IVD의 세포 생물학에 대한 철저한 이해가 필수적이다. 아직도 대답되지 않는 남아 있는 이 생물학의 한 양상은 세포가 생리적인 상태 및 변성 도중 공간적으로 배열되는 방법의 질문입니다. IVD의 생물학적 특성과 가용성은 이 조직을 분석하기 어렵게 만듭니다. 본 연구는 초기 배아 발달에서 말기 변성까지 골문 섬유증에 있는 공간 연골세포 조직을 조사합니다. 광학 단면방법(Apotome)은 척추 수술을 받은 환자로부터 얻은 동물 모델 및 인간 디스크 조직으로서 소 배아 조직을 이용한 고해상도 염색 분석을 수행하기 위해 적용된다. 초기 배아 소 디스크에서 매우 높은 연골 세포 밀도에서, 세포의 수는 임신, 성장 및 성숙 도중 감소합니다. 인간 디스크에서, 세포 밀도의 증가는 조직 퇴화의 진행을 동반. 이미 관절 연골에서 입증 된 바와 같이, 클러스터 형성은 고급 디스크 변성의 특징을 나타냅니다.

Introduction

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무척추 디스크(IVD)는 생화학적으로 세포 건축과 관련하여, 첫눈에, 여러 가지 면에서 관절 연골1과유사한 연골 계 구조이다. 실제로, 관절 연골의 IVD 변성 및 골관절염(OA)은 연골 마모, 부전성 낭종 및 골관절염 형성, 및 아전철 경화증2,3로인한 관절 공간 협종화를 특징으로 한다. 이러한 유사성에도 불구하고 두 조직의 아키텍처와 기능적 역할이 다릅니다. 관절 연골의 매트릭스는 주로 아케이드 형성 콜라겐 형 II 네트워크로 형성되는 동안, IVD는 조직의 세 가지 유형으로 구성되어 있습니다 : 중앙에 콜라겐 유형 II 풍부한 핵 pulposus는 축부하를 차지하고 축부하를 소요하고 축섬유라고 조밀하게 포장 된 원형 콜라겐 유형 I 섬유의 포괄 링으로 전송. 이들의 기능은 장방향 섬유 강도로 프로테오글리칸 및 물이 풍부한 핵에 의해 수신된 번역된 축 압력을 흡수하는 것이다. 각 핵및 항문의 위쪽과 하단에서 hyaline 카르틸라기나기드 엔드플레이트는 인접한 척추4(도 1)에접합을 형성한다.

관절 ....

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Protocol

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배아 발달 및 성숙의 분석을 위해 소 디스크가 사용되었습니다. IVD의 변성을 평가하기 위해 인간 샘플을 분석하였다.

인간 IVD 조직은 정형 외과의 학과에서 요추 디스크 변성, 디스크 탈출, 또는 척추 외상을 위한 수술을 받은 환자에서 얻어졌습니다, 튀빙겐 대학 병원 및 BG 외상 센터 Tübingen. 전체 윤리위원회의 승인은 연구 개시 전에 얻어졌습니다 (프로젝트 번호 244/2013BO2). 서면 통보 된 동의는 참여하기 전에 모든 환자로부터 수신되었습니다. 이 방법은 승인된 지침에 따라 수행되었습니다.

소 조직은 보건 및 식품 안전 /Oberschleißheim에 대한 바이에른 주 사무소와 바르샤바 (독일)에있는 렌더링 공장에서 얻어졌다. 현지 및 수의학 당국의 승인은 죽은 동물로부터 조직에 대한 수신되었다.

1. 샘플 수확

  1. 인간 IVD 조직: 수술 중 에서 얻은 IVD 샘플을 DMEM(DMEM)에 즉시 배치하여 페니실린 연쇄절제술의 2%(v/v)와 추가 처리전까지 4°C에 저장합니다. 48 시간 이내에 조직을 처리합니다. 또는 조직을 -20°C에서 몇 주 동안 저장합니다.
  2. 소 IVD 조직 : 죽음 ....

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Results

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모자이크 이미지를 사용하여, 항문 및 부드러운 핵에 조밀 한 콜라겐 섬유 네트워크를 가진 IVD의 아키텍처는 명확하게 인식 될 수있다(도 4). 세포 밀도의 지속적인 감소는 배아 발달 중에 관찰될 수있다(도 5). IVD의 초기 단계에서는 소 항문 섬유증에서 11,435 세포/mm²의 세포 밀도를 발견할 수 있지만 소 핵 펄포서스의 세포/mm²는 발견될 수 있지만, 이 숫자는 1,011세포/mm²(소 항성섬유서스)와 488개의 세포(모공포스)까지 급격히 감소한다. 성인 가축에서 71 세포/mm² (항문 섬유증) 수고. 106 세포/mm² (핵 펄포푸스)가 보입니다(도 6 A-B). 아포토메와 함께 이중 채널 이미징을 사용하면 공간 패턴의 3D 아키텍처를 시각화할 수있습니다(그림 7).

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Discussion

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모자이크 이미징 및 광학 단면에 의해 증강된 형광 현미경법을 사용하여, 개발, 성숙 및 변성을 통해 요추 IVD의 항문에서 연골 세포의 공간 배열을 평가했습니다. 퇴행성 조직은 디스크 퇴화를 위한 척추 수술을 받은 환자로부터 수확될 수 있지만, 배아 기간 및 성숙 단계의 분석은 모형 유기체(소)의 사용을 요구하였다. 높은 세포 밀도는 초기 배아 발달 도중 항문에서 주의되었습니다. 개발의 추가 과정에서, 산후 성장 및 성숙 세포 밀도에 있는 뚜렷한 감소를 관찰할 수 있었습니다. 진보된 디스크 변성을 가진 인간 조직에서, 우리는 그 때 항문 섬유증에 있는 세포 밀도에 있는 증가를 정량화할 수 있었습니다.

적극적으로 분할 및 생합성 활성 노토코드 세포와 결합된 조직 부피의 급속한 증가는배아(25)에서관찰되는 세포 밀도의 변화에 대한 가능성이 있다. 그러나 변성으로 세포 밀도가 다시 증가하는 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 항문의 퇴행성 공정은.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 그들의 도움과 지원에 대한 원래 출판물에서 우리의 공동 저자에게 감사드립니다. 우리는 종말 이미지를 취득하는 데 도움 샬롯 엠마 밤버거 감사합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
암포테리신 BMerck KGaA,  독일A2942
접착 현미경 슬라이드 SuperFrost PlusR. Langenbrinck, 독일03-0060
ApoTomeCarl Zeiss MicroImaging GmbH, 독일462000115
AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiXCarl Zeiss MicroImaging GmbH, 독일
CellMask Actin Tracking StainThermo Fischer Scientific, USA57249
저온 유지 장치Leica Biosystems, 미국CM3050S
DAPIThermo Fischer Scientific, USD1306
Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)Gibco, Life Technologies, 독일41966052
에틸렌디아민테트라아세트산Sigma-Aldrich, US60004
형광 미스코스코프 - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 및 ColibriCarl Zeiss MicroImaging GmbH, 독일3834000604
포름알데히드Merck KGaA,  독일104002
Image J 1.53a, 셀 카운터 플러그인National Insittute of Health (NIH), US
Invitrogen Alexa Fluor 568 PhalloidinThermo Fischer Scientific, USA12380
Microscopic Cover GlassesR. Langenbrinck, Germany01-1818/1
PAP Pen Liquid BlockerScience Sevices  GmbH, 독일N71310
페니실린-스트렙토마이신시그마-알드리치, 미국P4333
인산염 완충 식염수시그마-알드리치, 미국P5119
메스pf medical AG, 독일2023-01
Tissue-tek O.C.T. 컴파운드Sakura Finetek, 네덜란드SA6255012

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
  2. Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004....

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Intervertebral DiscDisc DegenerationOptical SectioningChondrocyte OrganizationEmbryonic DevelopmentMosaic ImagingFluorescence MicroscopyCell Density AnalysisAnnulus FibrosusNucleus Pulposus

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