이 원고는 생물 발광 이미징을 사용하여 세균 부하의 생체 내 분석에서 마우스의 요로 감염을 유도하기 위해 호화 요법 을 가진 비뇨기과 박테리아의 내막 투여를 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
요로 감염 (UTI) 인간에서 가장 일반적인 세균 성 감염 중 순위 와 정기적으로 경험적 항생제로 치료. 그러나, 미생물 저항증가 때문에, 가장 많이 사용된 항생제의 효험은 쇠퇴했습니다. 대체 치료 옵션을 찾기 위해, UTI 병인및 UTI 감수성을 결정하는 기계장치의 더 나은 이해를 위한 중대한 필요가 있습니다. 동물 모델에서 이를 조사하기 위해, UTI의 과정을 연구하는 재현 가능한 비침습적 분석은 필수적입니다.
수년 동안, 세균 부하의 열거에 대한 금 본위제는 특정 시료 부피에 대한 콜로니 성형 유닛(CFU)의 결정이었다. 이 기술은 사후 장기 균질화 및 직렬 희석을 요구하여 데이터 출력과 재현성을 제한합니다. 대안으로, 생물 발광 화상 진찰 (BLI)는 세균 부하를 결정하기 위하여 인기를 얻고 있습니다. 럭스 오페론을 가진 병원체를 라벨링하면 비침습적 방식으로 민감한 검출 및 정량화를 허용하여 세로 후속 조치를 가능하게 합니다. 지금까지, UTI 연구에서 BLI의 채택은 제한 남아.
이 원고는 마우스 요로 감염 모델에서 BLI의 실제 구현을 설명합니다. 여기에서, 박테리아를 배양하기위한 단계별 가이드, 내장 주입 및 이미징이 제공됩니다. CFU와의 생체 내 상관 관계를 검사하고 항생제 치료 동물과 치료되지 않은 감염된 동물의 세균 부하를 비교하여 개념 증명이 제공됩니다. 또한 생체 내 UTI 모델에서 BLI 구현과 관련된 장점, 제한 및 고려 사항에 대해 논의합니다. UTI 연구 분야에서 BLI의 구현은 크게 UTI의 병인에 대한 연구와 요로 감염을 예방하고 치료하는 새로운 방법의 발견을 용이하게 할 것입니다.
서론
요로 감염 (UTI)은 인간에서 가장 흔한 세균 감염 중 하나입니다. 모든 여성의 거의 절반은 일생 동안 증상 UTI를 경험하게 될 것입니다1. 방광에 국한된 감염은 오줌 주파수, 긴급성, 혈뇨증, 요실금 및 고통의 증가와 같은 오줌 현상을 초래할 수 있습니다. 감염이 위요로 올라갈 때, 환자는 불쾌감, 발열, 오한 및 허리 통증으로 열성염을 일으킵니다. 더욱이, UTI를 가진 환자의 최대 20%는 항생감2,3,4의극적인 감소의 결과로 재발성 감염 때문에 손해를 입습니다. 최근 몇 년 동안, 재발성 UTI의 치료 및 예방을위한 새로운 치료에 대한 관심이 증가하고있다. 하부 요로의 선천적이고 적응력있는 면역력과 침략과 식민지화에 필요한 세균성 독성 요인에 대한 더 나은 이해에도 불구하고, 치료 정권의 급진적인 변화는 매일 비뇨기과 연습2로번역되지 않았다. 유로병증과 생체내감수성을 연구하기 위해서는 재현 가능한 비침습적 분석이 필수적입니다.
여러 동물 UTI 모델은 선충에서 영장류....
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프로토콜
모든 동물 실험은 유럽 연합 지역 사회 위원회 지침에 따라 수행되었으며 KU Leuven의 동물 윤리위원회 (P158/2018)의 승인을 받았습니다.
1. 배양 박테리아(7,13,14에서적응)
- 준비
- 실험적 요구에 가장 적합한 발광 UPEC 변형을 선택하십시오.
참고: 여기서, 임상 방광염 분리, UTI89(대장균)는인간과 설치류 모두에서 비뇨기과증 용량, 그리고 뮤린 UTI 모델5,7,15에서의일반적인 사용으로 인해 선택되었다. 완전한 럭스 오페론(luxCDABE)을 운반하는생물발광 동종 균주는 UTI89-럭스라고 더 합니다. 이 오페론은 또한 카나마이신 황산염 (Km) 저항 유전자를 운반합니다. 따라서, Km은 생물 발광콜로니(13)를선택하는 데 사용할 수 있다.
- 실험적 요구에 가장 적합한 발광 UPEC 변형을 선택하십시오.
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결과
생체 내 BLI는 주입 시 접종시 접종의 CFU와 상관관계가 있습니다.
생체 내 BLI의 검출 한계및 접종의 CFU와의 상관관계를 평가하기 위해, 마우스는 음의 대조군으로서 UTI89-럭스 및 PBS의 상이한 농도에 감염되었다. 주입하기 전에 감염되지 않은 동물을 스캔하여 배경 발광을 결정했습니다. 후속 이미지는 즉시 주입 후(도1A)을얻었다. UTI89-lux의 주입 후, 생체 발광은 2 x 104 CFU 이상으로 강력하게 검출가능하고 접종과 생물 발광의 CFU 사이의 선형 상관관계가 확립되었다(도1B). 대조적으로, 총 광자 플럭스는 PBS로 주입된 동물및 2 x 103 CFU의 가장 낮은 세균 성 농도에 있는 동물을 위한 배경 신호와 비교되었습니다........
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토론
CFU 수에 비해 BLI의 장점
세로 데이터
미생물 부담을 정량화하기 위해 CFU를 세는 전통적인 방법의 주요 단점은 동물 당 단면 데이터 포인트만 제공하는 사후 조직 균질화의 요구 사항입니다. 반대로 BLI는 감염된 동물의 비침습적 종방향 후속 조치를 가능하게 합니다. 동물은 감염의 역학에 대한 자세한 통찰력을 제공, 하루에 2 ~ 3 번 이미지 할 수 있습니다. 또한 동일한 동물의 반복적인 측정은 적절하게 구동되는 실험에 필요한 동물의 수를 크게 줄입니다. 또한, 연구원은 개별 간 가변성에 초점을 맞출 수 있고 새로운 에이전트로 동물을 검사하거나 취급하기 전에, 실시간 데이터를 사용하여 미리 지정된 세균 부하를 가진 동물을 선택할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 실험의 AUC를 사용하여 연구원은 단단 값이 아니라 전반적인 세균 부하에 집중할 수 있습니다. UTI 설정에서 세로 및 실시간 데이터의 부가 가치를 과대 평가할 수 없습니다.
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 연구 재단의 보조금에 의해 지원되었다 - 플랑드르 (FWO 블라안데렌; G0A6113N, KU 루벤 연구 위원회 (C1-TRPLe; T.V. 및 W.E.) 및 VIB (T.V.에). W.E.는 연구 재단의 수석 임상 연구원입니다 - 플랑드르 (FWO 블라안데렌). 변형 UTI89-럭스는 교수 의 실험실에서 관대 한 선물이었다13.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 블랙 플랫 바닥 폴리스티렌 플레이트 | Corning | 3925 | in vitro 이미징 |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | 헤어 트리머, GT608 캡 |
| 포함 마취 기화기 | 하버드 장치 제한 | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | 노란색 혈관 카테터, 주입용 멸균 플라스틱 팁 사용 |
| C57Bl/6J 마우스 | Janvier | N/A | |
| 원심분리기 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | , OD 600nm |
| Dulbecco의 인산염 완충 측정 식염수, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| 에탄올 70% 변성 5L | VWR 국제 | 85825360 | |
| Falcon 14ml 라운드 바닥 폴리스티렌 튜브, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT 주사기, PTFE luer lock, 100 µ L | Sigma-Aldrich | 26203 | 은 50 µ의 느린 박테리아 주입을 보장합니다. L |
| 접종 루프 | Roth | 6174.1 | 홀더: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra 수의학 제품 | N/A | Isoflurane |
| IVIS 스펙트럼 In Vivo 이미징 시스템 | PerkinElmer | REF 124262 | 이미징 장치 |
| Kanamycine 용액 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| 리빙 이미징 소프트웨어 | PerkinElmer | N/A | BLI 수집 소프트웨어, 버전 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | 는 한 |
| 천으로 Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L2897 | 은 |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | 보충된 LB 한천으로 채울 |
| . SLW1141/08-20EA | |||
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | OD 600nm |
| UTI89-lux | 측정 N/A | /A | |
참고문헌
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug ....
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