우리는 유기형 뇌 슬라이스 모델에서 유방암 뇌 전이성 세포의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하기위한 프로토콜을 소개합니다. 상기 방법은 뇌 미세환경 계면 내에서 생체외 방식으로 유방암으로부터의 뇌 전이에 대한 다양한 치료법의 치료 효과를 조사하기 위한 정량적 검정을 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
뇌 전이는 이러한 종양이 치료하기 어렵고 열악한 임상 결과와 관련이 있기 때문에 여성에게 유방암의 심각한 결과입니다. 유방암 뇌 전이성 (BCBM) 성장의 전임상 마우스 모델은 유용하지만 고가이며, 뇌 실질 내에서 살아있는 세포 및 종양 세포 침윤을 추적하기가 어렵다. 여기에 제시된 것은 두개골 내 주사된 유방암 뇌-추구 클론 서브라인을 함유하는 이종이식편된 마우스로부터의 생체외 뇌 슬라이스 배양을 위한 프로토콜이다. MDA-MB-231BR 루시퍼라아제 태깅된 세포를 Nu/Nu 암컷 마우스의 뇌에 두개내 주사하고, 종양 형성 후, 뇌를 분리하고, 슬라이스하고, 생체외 배양하였다. 종양 절편을 영상화하여 루시퍼라아제를 발현하는 종양 세포를 확인하고 최대 10일 동안 뇌 실질에서 증식 및 침윤을 모니터링하였다. 또한, 프로토콜은 이온화 방사선 또는 화학요법으로 치료한 후 종양 세포의 성장 및 침습적 거동을 이미지화하기 위한 타임랩스 현미경의 사용을 기술한다. 치료에 대한 종양 세포의 반응은 라이브 이미징 현미경, 생체 발광 강도 측정, BCBM 세포를 포함하는 뇌 조각에 대한 조직학 수행으로 시각화 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 생체외 슬라이스 모델은 뇌 미세환경 내에서 개별 환자의 유방암 뇌 전이성 성장을 표적으로 하는 개인화된 약물을 식별하기 위해 신규한 치료제를 단독으로 또는 방사선과 조합하여 신속하게 시험하는데 유용한 플랫폼이 될 수 있다.
서론
유방암 뇌 전이 (BCBM)는 세포가 원발성 유방 종양에서 뇌로 퍼질 때 발생합니다. 유방암은 폐암 후 뇌 전이의 두 번째로 빈번한 원인이며, 전이는 환자의 10-16 %에서 발생합니다1. 불행히도, 뇌 전이 환자의 >80 %가 뇌 전이 진단 후 일년 이내에 사망하고 신경 기능 장애로 인해 삶의 질이 저하되기 때문에 뇌 전이는 여전히 치료할 수 없습니다2. 보다 효과적인 치료 옵션을 확인하는 것이 시급합니다. 단층 이차원 또는 입체 배양 모델은 실험실에서 치료제를 테스트하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나, 그들은 종양 표현형과 성장의 주요 동인인 복잡한 BCBM 미세환경을 모방하지 않는다. 이들 모델이 유용하지만, 이들은 복잡한 종양-기질 상호작용, 독특한 대사 요건, 및 종양의 이질성을 포착하지 못한다3. 종양-기질 상호작용 및 미세환경 이질성을 보다 충실하게 재조정하기 위해, 우리 그룹과 다른 사람들은 환자 유래 종양 세포(원발성 또는 전이성) 또는 암 세포주 4,5,6을 이용한 유기형 뇌 전이 "슬라이스" 배양물을 생성하기 시작했다. 고전적인 시험관내 시스템과 비교하여, 이러한 단기 생체외 모델은 대규모 동물 코호트에서 전임상 평가 전에 새로운 치료제를 스크리닝하기 위한 보다 관련성이 높은 조건을 제공할 수 있다.
Ex vivo 모델은 주로 다양한 암의 성공적인 치료법을 확인하기 위해 구축되고 성공적으로 사용되었습니다. 그들은 며칠의 평가가 필요하며 추가로 환자 별 약물 검사에 맞출 수 있습니다. 예를 들어, 인간 방광 및 전립선암 생체외 조직은 도세탁셀 및 겜시타빈7의 용량 의존적 항종양 반응을 나타내었다. 유사한 결장직장 암종 생체외 조직이 화학요법 약물인 옥살리플라틴, 세툭시맙 및 펨브롤리주맙8을 스크리닝하기 위해 개발되었다. 본 출원은 기질 환경과 췌장덕트 선암종 9,10의 유전형 및 표현형 특성 사이의 필수적인 상호작용을 고려하여 췌장암에서 널리 사용되어 왔다. 더욱이, 이러한 유기형 모델은 머리, 목, 위 및 유방 종양(11,12)에서 유사한 스크리닝을 위해 개발되었다.
여기서, 이종이식편된 유방암 뇌전이성 종양 세포의 생체외 뇌 슬라이스 모델이 그들의 미세환경에서 생성되고 있다. 마우스는 TNBC 전이 14,15의 공통 부위인 대뇌 피질 정수리 엽에 유방암 뇌 전이성 뇌 영양 MDA-MB-231BR 세포13을 두개내 주사하고 종양을 발생시키도록 허용하였다. 뇌 절편은 이들 이종이식편된 동물로부터 생성되었고,16,17에 기재된 바와 같이 유기형 배양물로서 생체외를 유지하였다. 이 신규한 생체외 모델은 뇌 실질종 내에서 BCBM 세포의 성장 분석을 허용하고 뇌 미세환경 내의 종양 세포에 대한 치료제 및 방사선 효과를 시험하는데 사용될 수 있다.
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프로토콜
이 프로토콜은 Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 동물 관리 지침을 승인하고 준수합니다. Nu/Nu 흉선 여성 마우스(6-8주령)를 본 연구에 사용하였다.
1. 종양 세포의 두개내 주사
- 모든 장비 (핀셋, 가위, 봉합 가위, 핸드 드릴)를 오토클레이브의 건조 사이클 하에서 살균 표시기를 포함한 살균 파우치에서 최대 45 분 동안 멸균하십시오. 여러 동물에 대한 수술을 실시하는 경우 가열 된 구슬 살균기 (최대 3x)를 사용하여 동물 사이의 도구를 멸균하십시오.
- 수술 시작 전에 사용자의 동물 관리 프로토콜 (예 : 이소플루란 (유도 4 %, 유지 1-2 %)에 따라 마우스를 마취시키고 진통 (피하, 0.1mg / kg 부프레노르핀 SR-LAB의 0.1mL)을 투여하십시오. 발가락을 꼬집고 최적의 마취 깊이를 보장하십시오.
- 마우스를 입체 택시 프레임에 넣고 표준 이어 바를 사용하여 머리를 고정시킵니다 (그림 1A). 안과 연고를 눈에 바르십시오.
- 절개 전에 요오드 면봉과 70 % 에탄올의 반복적이고 번갈아 가며 적용하여 머리 표면을 살균하십시오.
- 외과 적 메스를 사용하여 마우스의 뇌를 두 개의 대칭 반쪽으로 나누어 두개골을 노출시키는 상상의 선에 약간 대각선 각도로 피부를 통해 1cm 중간 선을 절개하십시오. 면봉으로 피를 닦으십시오.
- 주사 부위를 노출시키기 위해 피부를 옆으로 편향시킵니다 : 오른쪽 2mm, 브레그마 (+2 평측 (+2ML), +1 로스트랄 / 코달 (+1RC)을 기준으로 앞으로 1mm.
- 버 비트 (0.73 mm)를 사용하여 두개골 +2ML, + 1RC를 브레그마에 관통하고 약간의 압력과 비틀림 동작으로 구멍을 뚫습니다.
- 뇌 주사 주사기를 사용하여 초기에 3.5mm 깊이의 주사기를 뇌에 삽입하여 멸균된 1x PBS에 100,000 MDA-MB-231BR (GFP-루시페라아제를 안정적으로 발현하는) 세포/μL 용액 5μL를 주입합니다.
- 주사기가 2 분 동안 정착하도록하십시오. 약 1mm를 위로 당기고 2 분 후에 천천히 볼륨의 전반부를 주입하십시오.
- 나머지 주사를 주입하기 전에 2 분 정도 더 기다린 다음 최종 주사 후 3 분 후에 주사기를 천천히 당깁니다.
참고 : 느린 주사는 부피가 뇌 조직에 잘 흡수되고 주사기를 당긴 후 누출이 발생하지 않도록하여 암세포가 의도 된 부위 외부에서 자랄 수 있음을 경험적으로 보여줍니다. - 두개골의 주사 부위에 뼈 왁스를 바른 다음 폴리 프로필렌 봉합사를 사용하여 조직을 봉합하십시오. 마우스는 마취 제거 후 5 분 이내에 회복됩니다.
- 수술 직후 약 10 분, 3 시간 후 및 다음날 행동을 모니터링하여 식염수 주사, 부드러운 음식 등을 포함한 특별한 치료가 빠른 회복을 돕기 위해 필요한지 확인하십시오.
- 이미징 시스템에서 생체 발광 이미징을 통해 종양 성장을 모니터링합니다.
- 이를 위해 먼저 이미징 시스템에서 산소와 이소플루란을 켭니다. 둘 다 이미징 박스 외부의 별도의 챔버에 분배되도록 허용하십시오.
- 그런 다음 소프트웨어를 켜고 계측기를 초기화 한 다음 마우스 몸체 전체를 시각화하고 캡처하는 데 적합한 옵션을 선택하십시오.
- 마우스를 이소플루란으로 별도의 챔버에 놓고 발가락을 꼬집어 최적의 마취 깊이를 보장하십시오. 마우스를 30mg/mL 루시페린 200μL로 복강내 주사한다.
- 마우스의 위를 산소와 이소플루란이 공급된 이미징 챔버의 코렛으로 옮깁니다. 챔버를 잠그고 2분 노출을 선택하여 이미징을 시작합니다.
- 소프트웨어의 ROI (관심 영역) 도구를 사용하여 종양의 생체 발광 신호를 정량화하십시오.
- 종양 크기를 분석하려면 원 모양 도구를 선택하고 종양 모양과 크기 주위에 맞춥니다. ROI를 측정하고 총 판독값을 보고합니다.
- 뇌 절편을 생성하기 전에 12-14일 동안(또는 루시퍼라제가 약 7.0 x 106 단위에 도달할 때까지) 고형 종양 성장을 허용하십시오(그림 1B).
참고: 주사할 세포의 수를 늘리면 종양이 더 빨리 성장할 수 있습니다. 따라서 뇌 조각의 생성은 12 일 이전에 발생할 수 있습니다. 반면에, 더 큰 종양은 14 일 동안 성장하도록 허용되면 더 많은 GFP + 슬라이스로 이어질 것입니다. 14 일 후, 생쥐의 건강은 빠르게 악화되기 시작합니다. 따라서 동물 건강 모니터링은 10 일 시점 이후에 하루에 한 번으로 증가해야하며, 통증 및 / 또는 불편 함의 징후를 보이는 마우스는 조각을 생성하는 데 사용해야합니다.
2. 뇌 조각 생성
참고: 멸균된 층류 후드에서 뇌 분리 후 단계를 수행하십시오. 전형적으로 MDA-MB-231BR 세포를 주입한 마우스로부터 종양 세포(루시퍼라제 신호)를 포함하는 35-40개의 개별 슬라이스를 생성할 수 있다(도 1C).
- 오토클레이브의 모든 수술 도구를 멸균하십시오. 멸균 층류 후드에 티슈 슬라이서를 놓고 70 % 에탄올로 모든 도구와 도구를 청소하십시오.
- 두개내 MDA-MB-231BR 세포 주사 후 12-14일 후, 1.2에 기재된 바와 같이 사용자의 동물 관리 프로토콜에 따라 마우스를 마취한다. 발가락을 꼬집고 최적의 마취 깊이를 보장하십시오.
- 그들의 뇌를 얼음처럼 차가운 (4°C) 내로 급속히 (45초 이내) 놓고, 다음으로 구성된 수크로스-ACSF를 제거한다: 280 mM 수크로스, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mMCaCl2,20 mM 글루코스, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-아스코르베이트, 3 mM 티오우레아, 2 mM Na+, 29 mM 피루베이트; pH = 7.3.
- 날카롭고 멸균 된 메스 또는 면도날을 사용하여 뇌의 바닥 부분을 포함하여 모든면에서 종양이 포함되지 않은 뇌의 과도한 부분을 잘라냅니다.
- 뇌의 모양을 완벽하지 않은 큐브로 가져와 60mm 접시 뚜껑의 ACSF 젖은 여과지에 평평하게 앉아 슬라이스를 용이하게하십시오.
참고 : 종양이 자랄 것 같지 않은 뇌의 여분의 조직은 슬라이스하기 전에 제거되어 대부분 GFP + 슬라이스를 생성 할 수 있으며 기기 표면에 안정적이며 슬라이스로 인한 진동에 의해 방해받지 않는 뇌 모양을 만듭니다. - 미리 젖은 (ACSF 포함) 여과지 원 몇 장을 절단 플랫폼 위에 놓고 차단 된 조직을 그 위에 놓습니다.
- 제공된 눈금자에서 계측기의 절단 크기를 2 또는 2.5 단위로 설정하여 조직을 200-250 μm 섹션으로 슬라이스합니다.
참고: 최대 350μm 또는 100μm의 얇은 슬라이스가 가능합니다. 200μm 이< 조각의 경우 비브라톰 또는 압축기를 사용하십시오. - 페인트 브러시 (sable)를 사용하여 뇌 조각을 자당 ACSF가 들어있는 접시로 옮기고 27G 바늘을 사용하여 가벼운 현미경으로 조각을 분리하십시오.
- 형광 현미경으로 GFP 양성 슬라이스를 확인하고 멸균된 1mL 분리 피펫(와이드 오프닝)을 사용하여 2-3mL의 성인 슬라이스 배지(뉴로베이스 배지 A, 2% B12 보충제, 1% N2 보충제, 1% 글루타민, 0.5% 글루코스, 10U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신)가 들어있는 새로운 60mm 접시로 옮깁니다.
참고 : 뇌 표면 위로 자라는 종양 세포를 포함하는 뇌 조각 (아마도 주사 세포 누출 등으로 인한 것일 수 있음)은 제외됩니다. - 3-5 슬라이스를 각각 30 mm, 0.4 μm 공극 크기 조직 배양 삽입물 상에 6-웰 플레이트에 넣고 서로 성장할 수 없는 거리로 옮긴다.
- P1000 피펫을 사용하여 인서트의 표면으로부터 과량의 배지를 제거하고, 각 인서트 아래에 1 mL의 성인 마우스 슬라이스 배지를 첨가하고, 슬라이스하기 전에 인큐베이터에서 배지를 평형화시킨다.
- 영상화하기 전에 조직을 24시간 동안 37°C, 5%CO2, 및 95% 습도에서 인큐베이션한다.
3. 조각의 IVIS 이미징
참고: 멸균된 층류 후드에서 루시퍼라아제 및 억제제 첨가 단계를 수행하십시오.
- 30mg/mL 루시페린 용액 5μL를 포셉으로 인서트를 들어올려 웰의 배지에 루시페린을 첨가한 후 다시 웰에 넣어 인서트 아래의 배지에 피펫을 넣습니다.
- 뚜껑이 있는 6웰 플레이트를 고정식 카메라 아래의 기기의 이미징 챔버 안에 놓고 챔버 도어를 잠급니다.
- 소프트웨어를 열고 계측기를 초기화합니다.
- 이미지당 하나의 웰만 시각화하고 캡처할 수 있는 카메라 설정을 선택합니다. 스테이지를 위로 이동(5cm의 FOV)하고 카메라 바로 아래에 이미지화해야 하는 우물을 놓습니다.
- 종양이 방출할 루시퍼라아제의 강도에 따라 이미징 시간을 가장 적절하게 설정하며, 이는 10초에서 5분까지 다양할 수 있습니다. 먼저 10초로 설정한 다음 신호가 낮으면 증가하되 실험이 끝날 때까지 모든 시점과 조건에 대해 일관성을 유지합니다(그림 1D).
- ROI 도구 (원 모양 도구)를 사용하여 종양 모양과 크기 주위에 맞추고, ROI를 측정하고, 슬라이스에서 각 종양의 생체 발광 신호를 정량화하기 위해 총 판독 값을보고하십시오.
- 플레이트를 멸균 층류 후드로 다시 가져 와서 포셉을 사용하여 우물에서 인서트를 약간 들어 올립니다.
- 배지를 흡인하고 1 mL의 신선한 배지로 교체 한 다음 삽입물을 웰에 다시 넣으십시오.
- 슬라이스가 억제제, 대사산물 등과 같은 다양한 화합물로 처리되는 실험을 위해, 1.5 mL 튜브의 뇌 슬라이스 배지 1.2 mL에 적절한 농도의 시약을 준비한 다음 슬라이스가 들어있는 웰로 1 mL를 옮긴다.
- 연구 기간 동안 48 시간마다이 과정을 반복하십시오.
4. 생체외 뇌 조각에서 종양 성장의 라이브 이미징
참고: 라이브 이미징 중에 추가 매체를 추가할 수 없으므로 실험 기간을 지속하기에 충분한 배지(1.5mL)를 삽입하여 공급하십시오.
- 6-웰 플레이트를 인큐베이터 내부의 자동화된 현미경 플레이트 홀더 위에 놓는다(37°C, 5%CO2, 및 95% 습도).
- 소프트웨어를 열고 첫 번째 사분면에서 밝은 필드를 켜서 슬라이스를 보는 데 필요한 노출을 조정합니다. 슬라이스의 위치(좌표 "xy")를 찾으려면 두 번째 사분면의 "xy"로 탐색하여 현미경의 좌표 "xyz"를 제어합니다.
- 이 실험에 사용 된 랩웨어로 6 웰 플레이트를 선택하십시오. ROI 맵 편집기를 선택하고 새 ROI를 선택하여 해당 위치를 등록하고 해당 ROI를 추가 및 저장합니다.
- 다른 웰의 다른 모든 관심 영역에 대해 동일한 단계를 반복합니다. 모든 ROI를 추가한 후 모든 ROI를 저장합니다.
- 프로토콜에서 기존 항목 지우기를 선택하고 획득에서 타임랩스를 선택한 다음, 관심 채널(이 경우 GFP)을 선택합니다.
- 초점 설정에서 자동 초점을 끄고 모든 슬라이스에 적합한 초점으로 수동으로 조정합니다. 마지막으로 Brightfield 강도와 형광 채널 여기 및 노출 시간을 적절한 수준으로 조정하십시오.
- 48시간 동안 15분마다 이미지를 수집하도록 프로토콜을 설정합니다.
- 프로토콜을 저장하고 실행합니다. 실험이 끝나면 저장된 파일에는 모든 ROI에 대해 캡처 된 밝은 필드와 GFP 이미지가 모두 포함됩니다.
- 비디오에서 이미지를 결합하려면 관심 있는 모든 이미지의 이름을 동일한 이름 다음에 이진수로 바꿔 캡처된 순서대로 구성합니다(예: ROI1(1), RO1(2) ...)
- ImageJ를 열고 파일 > 이미지 시퀀스 가져 오기를 클릭하여 이미지> 가져옵니다. 목록에 나타나는 파일 이름을 선택하고 비디오에 대해 선택한 파일을 식별하는 파일 이름 포함 상자에 파일 이름의 내용을 씁니다.
- 결합된 이미지를 파일 > AVI에 다른 이름으로 저장> 아래에 저장합니다.
5. 생체외 뇌조직의 MTS 분석 및 면역조직화학
- MTS ASSAY
- 조직의 가장자리를 따라 각 슬라이스 아래의 조직 배양 막을 절단하여 슬라이스를 절제하고 멤브레인에 여전히 부착 된 조직을 96-웰 플레이트로 옮깁니다.
- MTS 시약을 배양 배지 및 0.01% 트리톤(1x)과 1:5 비율로 혼합하여 조직 내의 용액의 침투를 허용하도록, 각 웰에 120 μL의 총 부피로 첨가한다.
- 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 에이전트로 사용하여 뇌 조각을 실행 불가능하게 만들고이 실험에 대한 긍정적 인 대조군으로 만듭니다. MTS 분석을 진행하기 전에 관심 있는 뇌 조각을 RT(실온)에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 4% PFA에 담그십시오.
- MTS 시약이 슬라이스에서 4시간 동안 반응하도록 허용하고, 웰에서 슬라이스를 제거하고, 슬라이스가 없는 빈 웰을 포함한 모든 조건에 대해 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 판독값을 디지털 캘리퍼 눈금자로 측정된 조직 슬라이스 영역의 함수로 보고합니다.
- 면역조직화학 제제
- 멤브레인 인서트 표면에 부착된 뇌 조각을 4°C에서 하룻밤 동안 10% 포르말린에 담그십시오.
- 임베딩, 처리, 차단을 수행하고 조직의 얼룩지지 않은 슬라이드를 생성합니다. 표준 면역조직화학 염색 프로토콜을 사용하여 H&E, Ki-67, 감마-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI 염색
6. 생체외 뇌 조각에 종양의 조사
- 종양을 6 Gy (310 kVp x-rays)로 조사하십시오.
참고: 6Gy의 총 용량을 얻기 위해 입력된 단위는 R 단위(Victoreen 전기계를 사용하여 측정됨)와 앞서 설명한18과 같이 골무, 공기 밀도 및 cGy/R에 대한 보정을 고려한 후 3522 단위입니다. 노출 시간은 130.9 초입니다. - 0.25mm Cu +1mm Al 추가 여과, 50cm SSD, 분당 125cGy를 사용합니다.
- 기본 표준에 대해 보정된 빔 내 이온화 챔버에 의해 선량측정을 수행합니다.
- 습도, 온도 및 기압에 대해 매일 보정하십시오.
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결과
MDA-MB-231BR-GFP-루시퍼라제 세포를 상기 설명된 바와 같이 4-6주령의 Nu/Nu 마우스의 우반구에 두개내 주사하고(도 1A) 12-14일 동안 성장시키고, 이 기간 동안 종양 성장을 생체발광 영상에 의해 모니터링하였다(도 1B). 우리는 다른 그룹19에 의해보고 된 것처럼 100,000 개의 암세포를 두개골 내로 주사했지만 20,000 세포만큼 낮은20을 주입 할 수 있습니다. 뇌 슬라이스 생성 후(도 1C), 전술한 바와 같이, 슬라이스를 IVIS 상에서 영상화하여 24시간 인큐베이션 후 생체발광 영상화를 통해 종양 존재를 확인하였다. 이는 0일로 간주됩니다. 종양 성장은 매 48 h마다 생체발광 신호전달을 정량화함으로써 모니터링되었고, 이는 6일에 걸친 점진적 성장을 ...
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토론
이 연구는 외래식 이종이식편 뇌종양에 대한 새로운 생체외 뇌 배양 방법을 확립한다. 우리는 BCBM 세포 MDA-MB-231BR 세포가 마우스의 뇌에 두개내 주사되어 생체외 뇌 절편에서 생존하고 성장할 수 있음을 보여줍니다. 이 연구는 또한 두개내 주사 된 U87MG 교모세포종 (GBM) 세포를 테스트했으며 이러한 암세포가 뇌 조각에서 생존하고 성장한다는 것을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 우리는이 모델이 BCBM과 GBM을 넘어 폐암과 흑색종을 포함하여 뇌로 쉽게 전이되는 다른 암으로 확장 될 수 있다고 믿습니다. 유방암 뇌영양 세포의 두개내 주사는 뇌종양을 생성하는 간단하고 빠른 방법이며 뇌 거대전이(25)에 적합한 모델로 간주되기 때문에 선택되었다. 그러나, 유사한 종양 슬라이스 모델은 심장 내 접종 또는 원발성 지방 패드로의 동위원소 주사로부터 개발될 수 있다. 무혈청 배지에서 성인 뇌 절편을 성장시키고 48시간마다 신선한 배지를 공급함...
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공개 사항
저자는 선언 할 재정적 인 갈등이 없습니다.
감사의 글
Julia Farnan, Kayla Green 및 Tiziana DeAngelis의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 펜실베니아 연방 유니버설 연구 향상 보조금 프로그램 (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) 및 W.W. Smith Charitable Trusts (EjH)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
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| 6웰 플레이트 | Genessee | 25-105 | |
| 자동 현미경 및 LUMAVIEW 소프트웨어 | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| 비커 50mL | Fisher | 10-210-685 | |
| 무딘 검은 담비 붓, 크기 #5/0 | 전자 현미경 과학 | 66100-50 | |
| 뼈 왁스 | ModoMed | DYNJBW25 | |
| 뇌 주입 주사기 | Hamilton Company | 80430 | |
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| 포비돈 요오드 면봉 스틱 | DME 공급 미국 | Cat : 689286X | |
| 메스 블레이드 #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| 메스 핸들 #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 나트륨 피루브산 | 시그마 Aldrich | S8636 | |
| 스패튤라/프로브 | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS 양면 면도날 (American safety razor co (95-0043))VWR | 55411-060 | ||
| 설탕 | Amresco | 57-50-1 | |
| 외과 메스 | Exelint International | D29702 | |
| 조직 헬기 | Brinkman | (McIlwain 유형) | |
| 조직 배양 인서트 | Millipore | PICMORG50 또는 PICM03050 | |
| 기계 | 정밀도 250 kVp |
참고문헌
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