우리는 유기형 뇌 슬라이스 모델에서 유방암 뇌 전이성 세포의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하기위한 프로토콜을 소개합니다. 상기 방법은 뇌 미세환경 계면 내에서 생체외 방식으로 유방암으로부터의 뇌 전이에 대한 다양한 치료법의 치료 효과를 조사하기 위한 정량적 검정을 제공한다.
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이 논문에서
요약
초록
뇌 전이는 이러한 종양이 치료하기 어렵고 열악한 임상 결과와 관련이 있기 때문에 여성에게 유방암의 심각한 결과입니다. 유방암 뇌 전이성 (BCBM) 성장의 전임상 마우스 모델은 유용하지만 고가이며, 뇌 실질 내에서 살아있는 세포 및 종양 세포 침윤을 추적하기가 어렵다. 여기에 제시된 것은 두개골 내 주사된 유방암 뇌-추구 클론 서브라인을 함유하는 이종이식편된 마우스로부터의 생체외 뇌 슬라이스 배양을 위한 프로토콜이다. MDA-MB-231BR 루시퍼라아제 태깅된 세포를 Nu/Nu 암컷 마우스의 뇌에 두개내 주사하고, 종양 형성 후, 뇌를 분리하고, 슬라이스하고, 생체외 배양하였다. 종양 절편을 영상화하여 루시퍼라아제를 발현하는 종양 세포를 확인하고 최대 10일 동안 뇌 실질에서 증식 및 침윤을 모니터링하였다. 또한, 프로토콜은 이온화 방사선 또는 화학요법으로 치료한 후 종양 세포의 성장 및 침습적 거동을 이미지화하기 위한 타임랩스 현미경의 사용을 기술한다. 치료에 대한 종양 세포의 반응은 라이브 이미징 현미경, 생체 발광 강도 측정, BCBM 세포를 포함하는 뇌 조각에 대한 조직학 수행으로 시각화 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 생체외 슬라이스 모델은 뇌 미세환경 내에서 개별 환자의 유방암 뇌 전이성 성장을 표적으로 하는 개인화된 약물을 식별하기 위해 신규한 치료제를 단독으로 또는 방사선과 조합하여 신속하게 시험하는데 유용한 플랫폼이 될 수 있다.
서론
유방암 뇌 전이 (BCBM)는 세포가 원발성 유방 종양에서 뇌로 퍼질 때 발생합니다. 유방암은 폐암 후 뇌 전이의 두 번째로 빈번한 원인이며, 전이는 환자의 10-16 %에서 발생합니다1. 불행히도, 뇌 전이 환자의 >80 %가 뇌 전이 진단 후 일년 이내에 사망하고 신경 기능 장애로 인해 삶의 질이 저하되기 때문에 뇌 전이는 여전히 치료할 수 없습니다2. 보다 효과적인 치료 옵션을 확인하는 것이 시급합니다. 단층 이차원 또는 입체 배양 모델은 실험실에서 치료제를 테스트하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나, 그들은 종양 표현형과 성장의 주요 동인인 복잡한 BCBM 미세환경을 모방하지 않는다. 이들 모델이 유용하지만, 이들은 복잡한 종양-기질 상호작용, 독특한 대사 요건, 및 종양의 이질성을 포착하지 못한다3. 종양-기질 상호작용 및 미세환경 이질성을 보다 충실하게 재조정하기 위해, 우리 그룹과 다른 사람들은 환자 유래 종양 세포(원발성 또는 전이성) 또는 암 세포주 4,5,6을 이용한 유기형 뇌 전이 "슬라이스" 배양물을 생성하기 시작했다.
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프로토콜
이 프로토콜은 Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 동물 관리 지침을 승인하고 준수합니다. Nu/Nu 흉선 여성 마우스(6-8주령)를 본 연구에 사용하였다.
1. 종양 세포의 두개내 주사
- 모든 장비 (핀셋, 가위, 봉합 가위, 핸드 드릴)를 오토클레이브의 건조 사이클 하에서 살균 표시기를 포함한 살균 파우치에서 최대 45 분 동안 멸균하십시오. 여러 동물에 대한 수술을 실시하는 경우 가열 된 구슬 살균기 (최대 3x)를 사용하여 동물 사이의 도구를 멸균하십시오.
- 수술 시작 전에 사용자의 동물 관리 프로토콜 (예 : 이소플루란 (유도 4 %, 유지 1-2 %)에 따라 마우스를 마취시키고 진통 (피하, 0.1mg / kg 부프레노르핀 SR-LAB의 0.1mL)을 투여하십시오. 발가락을 꼬집고 최적의 마취 깊이를 보장하십시오.
- 마우스를 입체 택시 프레임에 넣고 표준 이어 바를 사용하여 머리를 고정시킵니다 (그림 1A). 안과 연고를 눈에 바르십시오.
- 절개 전에 요오드 면봉과 70 % 에탄올의 반복적이고....
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결과
MDA-MB-231BR-GFP-루시퍼라제 세포를 상기 설명된 바와 같이 4-6주령의 Nu/Nu 마우스의 우반구에 두개내 주사하고(도 1A) 12-14일 동안 성장시키고, 이 기간 동안 종양 성장을 생체발광 영상에 의해 모니터링하였다(도 1B). 우리는 다른 그룹19에 의해보고 된 것처럼 100,000 개의 암세포를 두개골 내로 주사했지만 20,000 세포만큼 낮은20을 주입 할 수 있습니다. 뇌 슬라이스 생성 후(도 1C), 전술한 바와 같이, 슬라이스를 IVIS 상에서 영상화하여 24시간 인큐베이션 후 생체발광 영상화를 통해 종양 존재를 확인하였다. 이는 0일로 간주됩니다. 종양 성장은 매 48 h마다 생체발광 신호전달을 정량화함으로써 모니터링되었고, 이는 6일에 걸친 점진적 성장을 .......
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토론
이 연구는 외래식 이종이식편 뇌종양에 대한 새로운 생체외 뇌 배양 방법을 확립한다. 우리는 BCBM 세포 MDA-MB-231BR 세포가 마우스의 뇌에 두개내 주사되어 생체외 뇌 절편에서 생존하고 성장할 수 있음을 보여줍니다. 이 연구는 또한 두개내 주사 된 U87MG 교모세포종 (GBM) 세포를 테스트했으며 이러한 암세포가 뇌 조각에서 생존하고 성장한다는 것을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 우리는이 모델이 BCBM과 GBM을 넘어 폐암과 흑색종을 포함하여 뇌로 쉽게 전이되는 다른 암으로 확장 될 수 있다고 믿습니다. 유방암 뇌영양 세포의 두개내 주사는 뇌종양을 생성하는 간단하고 빠른 방법이며 뇌 거대전이(25)에 적합한 모델로 간주되기 때문에 선택되었다. 그러나, 유사한 종양 슬라이스 모델은 심장 내 접종 또는 원발성 지방 패드로의 동위원소 주사로부터 개발될 수 있다. 무혈청 배지에서 성인 뇌 절편을 성장시키고 48시간마다 신선한 배지를 공급함.......
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공개 사항
저자는 선언 할 재정적 인 갈등이 없습니다.
감사의 글
Julia Farnan, Kayla Green 및 Tiziana DeAngelis의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 펜실베니아 연방 유니버설 연구 향상 보조금 프로그램 (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) 및 W.W. Smith Charitable Trusts (EjH)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
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참고문헌
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
- Niikura, N., et al.
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