방법 논문

포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리

DOI:

10.3791/62621

⸱

2021년 6월 30일

 ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 자당 밀도 그라데이션 초원심 분리를 사용하여 포유류 세포에서 종양을 재활용하는 것을 준비하기위한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

내적 인신 매매는 광범위한 생물학적 사건을 규제하는 필수적인 세포 과정입니다. 단백질은 플라즈마 막에서 내면화된 다음 초기 내분으로 운반됩니다. 내부화된 단백질은 분해를 위해 리소솜으로 이동하거나 플라즈마 멤브레인으로 다시 재활용될 수 있습니다. 강력한 내세포 재활용 경로는 내분비증에서 멤브레인 물질의 제거의 균형을 위해 필요합니다. 다양한 단백질은 ADP-리보실화 인자 6(ARF6)을 포함하는 통로를 조절하는 것으로 보고된다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 세포 분획을 위한 고전적인 방법입니다. 원심분리 후, 세포기관은 이소피닉 표면에 퇴적됩니다. 분수는 다른 다운스트림 응용 프로그램에 수집되고 사용됩니다. 여기에 기재된 프로토콜은 밀도 그라데이션 초원심분리를 사용하여 전감염된 포유류 세포로부터 내분 함유 분획을 재활용하는 프로토콜이다. 격리된 분획은 단백질 함량을 분석하기 위한 표준 서양 블로팅을 실시하였다. 이 방법을 채택함으로써, 우리는 ras 관련 C3 보툴리눔 독소 기판 1 (Rac1) 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자인 삼장 막표적이 ARF6 매개 내분비성 재활용을 통해 확인하였다.

서론

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내피 인신 매매는 다양한 생물학적 사건1,예를 들어 신호 수용체, 이온 채널 및 접착 분자의 운송을 연루시키는 필수적인 생리학적 과정입니다. 플라즈마 멤브레인에서 국소화된 단백질은 내분비2에 의해 내면화된다. 내부화된 단백질은 초기 내분3에의해 정렬됩니다. 단백질 중 일부는 분해4용리소좀을 대상으로 한다. 그러나, 단백질의 상당수는 빠른 재활용 및 느린 재활용 프로세스에 의해 세포 표면으로 다시 재활용됩니다. 빠른 재활용에서 단백질은 초기 내분모를 떠나 플라즈마 막으로 직접 돌아갑니다. 반대로, 느린 재활용에서 단백질은 먼저 내막 재활용 구획으로 분류된 다음 다시 플라즈마 멤브레인으로 운반됩니다. 다양한 화물 단백질은 예를 들어, 클래트린, 레트로머 복합체, 리트리버 복합체 및 Wiskott-Aldrich 증후군 단백질 및 SCAR 호모글로그(WASH) 복합체, 이러한 멤브레인 재활용공정4,5,6,7,8,9에참여한다. 내분비및 재활용 이벤트의 균형은 세포 생존에 매우 중요하며, 예를 들어 세포 접착, 세포 이동, 세포 극성 및 신호 변환과 같은 다양한 세포이벤트(10)에기여합니다.

ARF6, 작은 GTPase, 내피 인신 매매의 보고 된 레귤레이터7,11,12. 관심있는, 다양한 연구 그룹은 내용 재활용13,14,15,16,17에서ARF6의중요성을설명했다. 이 연구는 ARF6 매개 중성염 아웃성장과 내세포 재활용 사이의 관계를 조사하는 것을 목표로합니다. 이전 보고서는 ARF6의 활성화가 사이토카네시스 1 (DOCK180) 복합18의ELMO1-헌납기에 작용하여 Rac1 활동에 상류되는 것을 시사한다. 그러나 ARF6가 ELMO1-DOCK180 중재 된 Rac1 신호를 어떻게 유발하는지는 불분명합니다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 이러한 과정에서 ARF6 매개 내막 재활용의 역할을 조사하기 위해 사용되었다. 이를 이용하여, 재활용 내성 함유 분획은세포용액(19)으로부터수득하였다. 분획은 단백질 함량 분석을 위한 서양 블로팅을 실시하였다. 면역블롯 결과는 FE65, 뇌가 풍부한 어댑터 단백질의 존재 하에서 활성 ARF6가 실질적으로 내모성 함유 분획을 재활용하는 ELMO1의 수준을 증가시켰다는 것을 밝혔습니다. 다음 프로토콜은 포유류 세포를 (1) 횡단하는 절차에 대한 절차를 포함한다; (2) 샘플 및 밀도 그라데이션 컬럼을 준비; 및 (3) 재활용 내분 함유 분획을 획득한다.

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프로토콜

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1. 포유류 세포 배양 및 형질

  1. 100mm 배양 접시에 2 x 106 셀을 접시. 각 트랜스페션에 4가지 요리를 사용하십시오.
    참고: 필요한 세포 수는 셀주에 따라 다를 수 있습니다. 격리 단계로 진행하기 전에 최적화가 필요할 수 있습니다.
  2. 다음 날, 제조 업체의 지침에 따라 리포펙 타민으로 세포를 변형.

2. 세포 수확

  1. 배양 배지 48h 후 형질 전환을 폐기하십시오.
  2. 얼음처럼 차가운 PBS(10mM 나트륨 인산염, 염화 2.68m, 염화 나트륨 140m)로 세포를 두 번 세척합니다.
  3. 각 접시에 1mL의 얼음 차가운 PBS+ (0.5 배 프로테아제 억제제 칵테일과 0.5 배 인산 억제제 칵테일로 보충된 PBS)를 추가하십시오.
  4. 세포 스크레이퍼로 세포를 수집하고 세포 현탁액을 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
  5. 5 분 동안 400 x g에서 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
  6. 상체를 버리고 5mL의 균질화 완충제(HB; 250m 자당, pH 7.4에서 3mM 이미다졸, 1mM EDTA0.03m 사이클로헥시미드, 1x 프로테아제 억제제 칵테일, 1x 포세파테스 억제제)로 부드럽게 세포 펠릿을 회수한다.
  7. 10 분 동안 1,300 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.
  8. HB의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
  9. 15-20 스트로크용 두스 균질화로 세포를 균질화합니다.
    참고: 다른 균질화 방법, 예를 들어, 주사기를 통해 샘플을 전달, 사용될 수있다. 균질화 효율은 위상 대비 현미경하에서 균주전을 관찰함으로써 드러나게 될 수 있다.
  10. 2mL 원심분리 튜브로 균동화를 전달합니다.
    참고: 5배 샘플 버퍼의 12.5 μL을 사용하여 50 μL의 동종을 수확하고 총 lysate로 레이블을 지정합니다.
  11. 동종모네이트에 0.7mL의 HB를 추가합니다.
  12. 4°C에서 10분 동안 희석된 균질을 2,000 x g에서 10분 동안 회전합니다.
    참고: 펠릿에는 핵과 깨지지 않은 세포가 포함되어 있습니다.
  13. 상체 1.5mL을 수집하고 한 번 2.12 단계를 반복하십시오.
  14. 상체 1.4mL을 수집하고 핵 후 수퍼나티(PNS)로 레이블을 지정합니다.

3. 밀도 그라데이션 열 준비

  1. PNS1.2mL을 초원심분리기 튜브로 옮기다.
  2. 62% 자당 용액(2.351M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)의 1mL을 샘플에 넣고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞는다.
    참고: 결과 솔루션은 40.6% 자당 솔루션입니다.
  3. 3.3mL의 자당 용액(1.177M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)을 시료 위에 조심스럽게 넣습니다.
  4. 2.2mL의 25% 자당 용액(0.806M 자당, pH 7.4m imidazole 3m)을 35% 자당 용액 위에 조심스럽게 넣습니다.
    참고: 실온에서 62%, 40.6%, 35%, 25%의 굴절률은 각각 1.44, 1.40, 1.39, 1.37입니다. 자당 솔루션의 굴절 인덱스는 실험의 정밀도와 일관성을 보장하기 위해 회부계로 확인할 수 있습니다.
  5. HB로 초원심분리튜브를 채웁니다.
    참고: 준비된 밀도 그라데이션 컬럼을 4°C에 임시로 저장합니다.

4. 재활용 내분 함유 분획의 분획 및 회수

  1. 4°C에서 3h에 대해 210,000 x g의 컬럼을 원심분리합니다.
  2. 그라데이션 의 상단에서 시작하여 12분획(각 1mL)을 신중하게 수집합니다.
    참고: 재활용 내분은 35%에서 25% 자당 솔루션 사이의 인터페이스에서 찾아야 합니다. 수집된 분획은 액체 질소에서 스냅 동결및 -80°C에 저장될 수 있다.
  3. 희석 버퍼 1mL(pH 7.4, 1mM EDTA에서 3mM imidazole)로 모든 분획을 희석하십시오.
  4. 4°C에서 1h에 대해 100,000 x g의 희석된 시료원심분리기.
  5. 수퍼네티를 흡인하고 1x 샘플 버퍼의 50 μL을 추가하여 분수를 수확합니다.
  6. 서양 블로팅에 의해 분획의 단백질 함량을 분석합니다.

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결과

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밀도 그라데이션 극심분리에 의해 비감염된 HEK293 세포를 분수한 후, 그라데이션의 상단에서 시작하여 12개의 분획이 수집되었다. 수확된 분획은 희석 버퍼로 희석하여 1:1 비율로 희석하고 두 번째 원심분리를 실시하였다. 견본은 그 때 그들의 단백질 내용물 분석을 위한 서쪽 얼룩을 복종했습니다. 도 1에도시된 바와 같이, 재활용 내성 마커 Rab11은 분수 720에서검출된다. β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 및 Lamp1을 포함한 다른 세포 전세포 마커도 조사되었습니다. 양수 EEA1 신호도 분수 7에서도 검출됩니다. GAPDH, COX IV 및 Rab11의 밴드 강도는 분수 7과 PNS 모두에서 ImageLab 소프트웨어(Bio-Rad)로 측정되었습니다. 7에서 PNS로 마커의 강도 비율이 계산되고 SD± 바 차트로 표현되었다.

이전 연구는 ARF6및 E...

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토론

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위의 프로토콜은 초원심분리에 의한 배양된 세포로부터의 재활용 내모를 분리하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 방법의 신뢰성은 최신간행물(22)에의해 입증되었으며, 재활용 내성들이 골기 장치 및 미토콘드리아와 같은 다른 세포기관으로부터 성공적으로 분리되었음을 입증하였다(그림1). 좋은 분리 결과를 얻기 위해 몇 가지 중요한 단계는주의를 기울여야합니다. 자당 솔루션을 준비하는 동안, 리프라도미터를 사용하여 솔루션의 굴절률을 검증하는 것이 좋습니다. 실온에서 62%, 35%, 자당 25%의 굴절률은 각각 1.44, 1.39, 1.37입니다. 또한, 기포는 그라데이션에서 피해야한다. 열에 거품이 있으면 그라데이션의 연속성을 방해할 수 있습니다. 그들은 세포기관의 막을 손상하기 때문에 세제는 균질화 과정에서 피해야한다. 이것은 막 단단 세포기관에서 단백질의 방출로 이끌어 내고 가혹한 오염귀착될 수 있었습니다. 또한, 모든 균질화 도구는 균질화...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 문서의 내용과 이해상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 인다우먼트 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금으로 지원되었습니다. 이 작품의 수치는 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 "ARF6-Rac1 시그널링 매개 중계 중성염 아웃성장이 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 ARF6 6 및 ELMO1을 통해 뉴런 어댑터 FE65에 의해 전능적이다"라는 이전 간행물에서 채택되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL, 개방형 후벽 폴리프로필렌 튜브, 11 x 34mmBeckman Coulter347287
100mm 조직 배양 접시SPL20100
13.2mL, 인증된 무료 개방형 Thinwall Ultra-Clear 튜브, 14 x 89mmBeckman CoulterC14277
5x 시료 완충액GenScriptMB01015
cOmplete, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일Roche11873580001
COX IV (3E11) Rabbit mAb세포 신호 기술4850SCOX IV 검출을 위한 토끼 단클론 항체.
CycloheximideSigma-AldrichC1988
Dounce 조직 분쇄기, 7 mLDWK Life Sciences357542
HyCloneSH30021.01가진 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM)
Cruz BiotechnologySC-271519ELMO1 검출을 위한 마우스 단클론 항체.
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
FE65 항체 (E-20)Santa Cruz BiotechnologySC-19751FE65 검출용 염소 다클론 항체.
소 태아 혈청, 연구 등급HyCloneSV30160.03
GAPDH 단클론 항체 (6C5)GAPDHAM4300마우스 단클론 항체.
ImageLab 소프트웨어Bio-Rad밴드 강도 측정
이미다졸Sigma-AldrichI2399
Lipofectamine 2000 Transfection 시약Invitrogen11668019
Monoclonal Anti-β-COP 항체SigmaG6160Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP.
Myc-tag (9B11) 마우스 mAb세포 신호 전달 기술2276Smyc 태그 단백질을 검출하기 위한 마우스 단클론 항체.
OmniPur EDTA, 디소듐 솔트, 디하이드레이트Calbiochem4010-OP
Optima L-100 XPBeckman Coulter392050
Optima MAX-TLBeckman CoulterA95761
Opti-MEM I 감소 혈청 미디어Gibco 31985070
PBS 정제Gibco18912014
PhosSTOPRoche
RAB11A 특이적 다클론 항체Proteintech20229-1-APRab11 검출을 위한 토끼 다클론 항체.
SucroseAffymetrixAAJ21931A4
SW 41 Ti 스윙 버킷 로터Beckman Coulter331362
TLA-120.2 고정각 로터Beckman Coulter362046
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드Gibco25300062
저혈당 ELMO1 항체 (B-7)를 Santa 검출을 위한 Ambion 4906845001

참고문헌

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