이 논문은 자당 밀도 그라데이션 초원심 분리를 사용하여 포유류 세포에서 종양을 재활용하는 것을 준비하기위한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.
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방법 논문
포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리
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이 논문에서
요약
초록
내적 인신 매매는 광범위한 생물학적 사건을 규제하는 필수적인 세포 과정입니다. 단백질은 플라즈마 막에서 내면화된 다음 초기 내분으로 운반됩니다. 내부화된 단백질은 분해를 위해 리소솜으로 이동하거나 플라즈마 멤브레인으로 다시 재활용될 수 있습니다. 강력한 내세포 재활용 경로는 내분비증에서 멤브레인 물질의 제거의 균형을 위해 필요합니다. 다양한 단백질은 ADP-리보실화 인자 6(ARF6)을 포함하는 통로를 조절하는 것으로 보고된다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 세포 분획을 위한 고전적인 방법입니다. 원심분리 후, 세포기관은 이소피닉 표면에 퇴적됩니다. 분수는 다른 다운스트림 응용 프로그램에 수집되고 사용됩니다. 여기에 기재된 프로토콜은 밀도 그라데이션 초원심분리를 사용하여 전감염된 포유류 세포로부터 내분 함유 분획을 재활용하는 프로토콜이다. 격리된 분획은 단백질 함량을 분석하기 위한 표준 서양 블로팅을 실시하였다. 이 방법을 채택함으로써, 우리는 ras 관련 C3 보툴리눔 독소 기판 1 (Rac1) 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자인 삼장 막표적이 ARF6 매개 내분비성 재활용을 통해 확인하였다.
서론
내피 인신 매매는 다양한 생물학적 사건1,예를 들어 신호 수용체, 이온 채널 및 접착 분자의 운송을 연루시키는 필수적인 생리학적 과정입니다. 플라즈마 멤브레인에서 국소화된 단백질은 내분비2에 의해 내면화된다. 내부화된 단백질은 초기 내분3에의해 정렬됩니다. 단백질 중 일부는 분해4용리소좀을 대상으로 한다. 그러나, 단백질의 상당수는 빠른 재활용 및 느린 재활용 프로세스에 의해 세포 표면으로 다시 재활용됩니다. 빠른 재활용에서 단백질은 초기 내분모를 떠나 플라즈마 막으로 직접 돌아갑니다. 반대로, 느린 재활용에서 단백질은 먼저 내막 재활용 구획으로 분류된 다음 다시 플라즈마 멤브레인으로 운반됩니다. 다양한 화물 단백질은 예를 들어, 클래트린, 레트로머 복합체, 리트리버 복합체 및 Wiskott-Aldrich 증후군 단백질 및 SCAR 호모글로그(WASH) 복합체, 이러한 멤브레인 재활용공정4,5,6,7,
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프로토콜
1. 포유류 세포 배양 및 형질
- 100mm 배양 접시에 2 x 106 셀을 접시. 각 트랜스페션에 4가지 요리를 사용하십시오.
참고: 필요한 세포 수는 셀주에 따라 다를 수 있습니다. 격리 단계로 진행하기 전에 최적화가 필요할 수 있습니다. - 다음 날, 제조 업체의 지침에 따라 리포펙 타민으로 세포를 변형.
2. 세포 수확
- 배양 배지 48h 후 형질 전환을 폐기하십시오.
- 얼음처럼 차가운 PBS(10mM 나트륨 인산염, 염화 2.68m, 염화 나트륨 140m)로 세포를 두 번 세척합니다.
- 각 접시에 1mL의 얼음 차가운 PBS+ (0.5 배 프로테아제 억제제 칵테일과 0.5 배 인산 억제제 칵테일로 보충된 PBS)를 추가하십시오.
- 세포 스크레이퍼로 세포를 수집하고 세포 현탁액을 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
- 5 분 동안 400 x g에서 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
- 상체를 버리고 5mL의 균질화 완충제(HB; 250m 자당, pH 7.4에서 3mM 이미다졸, 1mM EDTA0.03m 사이클로헥시미....
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결과
밀도 그라데이션 극심분리에 의해 비감염된 HEK293 세포를 분수한 후, 그라데이션의 상단에서 시작하여 12개의 분획이 수집되었다. 수확된 분획은 희석 버퍼로 희석하여 1:1 비율로 희석하고 두 번째 원심분리를 실시하였다. 견본은 그 때 그들의 단백질 내용물 분석을 위한 서쪽 얼룩을 복종했습니다. 도 1에도시된 바와 같이, 재활용 내성 마커 Rab11은 분수 720에서검출된다. β-COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab7 및 Lamp1을 포함한 다른 세포 전세포 마커도 조사되었습니다. 양수 EEA1 신호도 분수 7에서도 검출됩니다. GAPDH, COX IV 및 Rab11의 밴드 강도는 분수 7과 PNS 모두에서 ImageLab 소프트웨어(Bio-Rad)로 측정되었습니다. 7에서 PNS로 마커의 강도 비율이 계산되고 SD± 바 차트로 표현되었다.
이전 연구는 ARF6및 E.......
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토론
위의 프로토콜은 초원심분리에 의한 배양된 세포로부터의 재활용 내모를 분리하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 방법의 신뢰성은 최신간행물(22)에의해 입증되었으며, 재활용 내성들이 골기 장치 및 미토콘드리아와 같은 다른 세포기관으로부터 성공적으로 분리되었음을 입증하였다(그림1). 좋은 분리 결과를 얻기 위해 몇 가지 중요한 단계는주의를 기울여야합니다. 자당 솔루션을 준비하는 동안, 리프라도미터를 사용하여 솔루션의 굴절률을 검증하는 것이 좋습니다. 실온에서 62%, 35%, 자당 25%의 굴절률은 각각 1.44, 1.39, 1.37입니다. 또한, 기포는 그라데이션에서 피해야한다. 열에 거품이 있으면 그라데이션의 연속성을 방해할 수 있습니다. 그들은 세포기관의 막을 손상하기 때문에 세제는 균질화 과정에서 피해야한다. 이것은 막 단단 세포기관에서 단백질의 방출로 이끌어 내고 가혹한 오염귀착될 수 있었습니다. 또한, 모든 균질화 도구는 균질화.......
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공개 사항
저자는 이 문서의 내용과 이해상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 인다우먼트 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금으로 지원되었습니다. 이 작품의 수치는 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 "ARF6-Rac1 시그널링 매개 중계 중성염 아웃성장이 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 ARF6 6 및 ELMO1을 통해 뉴런 어댑터 FE65에 의해 전능적이다"라는 이전 간행물에서 채택되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1mL, 개방형 후벽 폴리프로필렌 튜브, 11 x 34mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100mm 조직 배양 접시 | SPL | 20100 | |
| 13.2mL, 인증된 무료 개방형 Thinwall Ultra-Clear 튜브, 14 x 89mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x 시료 완충액 | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | 세포 신호 기술 | 4850S | COX IV 검출을 위한 토끼 단클론 항체. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce 조직 분쇄기, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| HyClone | SH30021.01 | 가진 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(DMEM) | |
| Cruz Biotechnology | SC-271519 | ELMO1 검출을 위한 마우스 단클론 항체. | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 항체 (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | FE65 검출용 염소 다클론 항체. |
| 소 태아 혈청, 연구 등급 | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH 단클론 항체 (6C5) | GAPDH | AM4300 | 마우스 단클론 항체. |
| ImageLab 소프트웨어 | Bio-Rad | 밴드 강도 측정 | |
| 이미다졸 | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection 시약 | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP 항체 | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) 마우스 mAb | 세포 신호 전달 기술 | 2276S | myc 태그 단백질을 검출하기 위한 마우스 단클론 항체. |
| OmniPur EDTA, 디소듐 솔트, 디하이드레이트 | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I 감소 혈청 미디어 | Gibco 31985070 | ||
| PBS 정제 | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | ||
| RAB11A 특이적 다클론 항체 | Proteintech | 20229-1-AP | Rab11 검출을 위한 토끼 다클론 항체. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti 스윙 버킷 로터 | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 고정각 로터 | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드 | Gibco | 25300062 |
참고문헌
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research.
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재인쇄 및 허가
