감마 델타(γδ) T 세포의 확장 및 농축

백혈병 재발은 ^AML1,2,3를 가진 환자에서 조혈 세포 이식 (HCT) 후에 사망의 주요 한 원인입니다. 더 나은 백혈병 없는 생존은 접목 대 호스트 질병 (GVHD)⁴의 증가한 리스크 없이 HCT 후에 혈액 γδ T 세포의 증가한 복구로 보고되었습니다. γδ T 세포의 능력은 MHC 독립적 인 방식으로 항원을 인식하고 강한 세포 및 Th1 과 같은 이펙터 기능을 개발하여 T 세포의 이 경미한 하위 집단을 재발 위험에 처한 AML 환자의 치료에 이상적입니다⁵. Vγ9Vδ2 T 세포가 주변T 세포의 0.5%에서 5%에 이르는 T 림프구의 사소한 하위 집합이라는 점을 감안할 ^{때, 우리는} 임상 시험을 위한 잠재적으로 치료용량을 달성하기 위해 혈액 세포의 이 희소한 인구를 확장하는 견고한 시스템을 확립하기 시작했습니다.

다른 사람들은 졸레드로닉산과 심지어 aAPC를 사용하여 γδ T 세포를 성공적으로 확장했지만, 우리는 잠재적으로 229,749 배까지 γδ T 세포를 확장 할 수있는 프로세스를 개발했습니다. 팽창은 양면이다 : 첫째, 림프구는 분리 계측기를 사용하여 용광에 의해 얻어진다. 이 장비는 카운터플로우 원심분리에 의한 크기, 모양 및 밀도에 따라 셀을 분리할 수 있는 폐쇄 시스템을 제공합니다. 림프구를 농축한 후, Vγ9Vδ2 T 세포의 선택적 팽창은 7일 동안 졸레드로닉산 및 IL-2로 처리함으로써 달성된다. 이 치료 직후, TCR-αβ T 세포는 미생물 기술을 사용하여 고갈되어 K562 유래 aApC를 사용하여 γδ T 세포의 후속 확장을 허용합니다.

공정 검증을 위해, × ¹⁰⁶ 개의 졸레드로닉산 확장γδ T 세포만이 aApC를 이용한 상2 공동배양 확장을 위해 사용되었다. 이 확장 단계에서, γδ T 세포는 Moffitt에서 제조된 K562-CD3-41BBL(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)의 현재 양호한 제조 관행(cGMP)-호환 작업 세포 은행(WCB)을 사용하여 활성화된다. 이러한 biphasic 확장의 근거는 단세포에서 파네실 디포스페이트 신타제(FDPS)를 억제하는 조레드로닉산의 능력에 기초하여, Vγ2Vδ2 세포를 직접 자극하는 이스토닐 파이로포스페이트의 축적으로 이어진다. 확장의 두 번째 단계에서 K562 유래 aApC(K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)는 모든 T 셀에 강력한 자극을 제공한다. 그러나, 세포 생성물은 이미 γδ T 세포를 위해 농축되어, γδ T 세포의 견고한 팽창을 초래한다.

특정 장비와 플라스크를 사용하면 이 공정이 기능적으로 폐쇄되어 오염 위험이 줄어듭니다. 또한, 1L 폐쇄시스템 생물반응기는 수유를 위한 최소한의 필요를 가지고 총 1L의 배지에서 세포의 최대 성장과 확장을 용이하게 한다. Moffitt 방법의 장점은 동종 투여를 위한 매우 순수한 기증자 유래 γδ T 세포 제품을 생산하기 위해 신속하고 재현 가능하며 매우 실현 가능한 GMP 시스템을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 부분적이고 완전한 면제가 있는 암 환자의 미생물 및 종양에 대한 면역을 중재하기 위해 Vγ2Vδ2 T 세포 수용체를 채택 면역 요법으로 발현하는 인간 γδ T 세포를 사용하는 것을 목표로 하는 모든 임상 시험에 적용될 수 있다. 또한, γδ 키메라 항원 수용체 양성(CAR⁺) T 세포의 개발 및 생산을 위한 견고한 플랫폼을 제공한다.

참고: IRB 승인을 받았고 기부자로부터 통보된 동의를 얻었습니다.

1. 림프구 격리

1. 아페레시스 제품을 깨끗한 방으로 옮기.
   참고: 원료 재료 수집 규정을 준수하는 외부 상용 벤더의 일반 기증자 apiheresis를 사용하여 공정 유효성 검사를 수행했습니다.
2. 멸균 테스트, 세포 수 및 세포 현상을 위해 샘플을 수집합니다.
3. 1% 인간 혈청 알부민(HSA)과 식염수 용액의 이차 매체(0.9% 염화나트륨 주입 USP) 또는 덜벡코의 인산염 버퍼살린(DPBS)을 이용한 카운터플로우 원심분리 장치에 용류한다. 용액 원심분리 속도를 900 × g 로 설정하고 유량과 시간에 따라 분수를 수집합니다.
4. 분수 2에서 샘플을 수집하고 다음 테스트를 수행 : 멸균 테스트를위한 2 mL; acridine 오렌지/프로피듐 요오드 (AO/ PI)를 사용하여 세포 수 및 생존을위한 0.5 mL; 5 × ¹⁰⁶ 세포에 의한 세포 피노티핑에 의한 유동 세포.
5. 1L 폐쇄시스템 생물반응기에서 10× ¹⁰⁶ 세포/^cm2 에서 1L 의 세포 분획(분수 2)을 1L 폐쇄형 시스템 생물반응기에서 5μmol/L, IL-2의 300IU/mL로 확장한다.
6. 37°C에서 5%의 _CO2로 설정된 인큐베이터에서 7일 동안 배양합니다.

2. 알파 베타 (αβ) T 세포 고갈

1. 1 L 폐쇄 시스템 생물 반응기 플라스크에서 세포를 수확합니다. 멸균-용접 1 L 이송 팩을 폐쇄시스템 생물반응기의 레드 라인으로 용접하고, 적절한 제약 펌프를 사용하여 세포를 이송 팩으로 이송한다.
2. 다음 샘플을 복용: 10 mL 소요 된 중간 멸균; AO/PI를 이용한 세포 수 및 생존가능성을 위한 세포의 0.5mL; 5 × ¹⁰⁶ 세포 유동 세포 측정
3. 인산염 완충식식염(PBS) 또는 (PBS/에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)) 버퍼 + 0.5% HSA 및 생체음 TCR αβ 특이적 항체에서 ~5× ¹⁰⁸ 세포/mL에서 세포를 재연한다.
4. 셰이커를 냉장고에 넣고 셀을 2-8°C에서 약 15분 동안 흔들어 줍니다.
5. PBS/EDTA 버퍼 + 0.5% HSA의 총 600mL로 셀을 세척합니다. 원심분리기는 2-8°C에서 15분 동안 200-500 × g 에서 언바운드 항체를 제거한다. PBS/EDTA 완충제에서 ~5× ¹⁰⁸ 세포/mL을 재일시 중단 + 0.5% HSA 에 안티 비오틴 특이 미생물(7.5 mL/1 유리병).
6. 셰이커를 냉장고에 넣고 셀을 2-8°C에서 약 15분 동안 흔들어 줍니다. 인큐베이션 후, 2-8°C에서 15분 동안 200-500 × g 의 세포를 원심분리하여 언바운드 마이크로비드를 제거한다. PBS/EDTA 버퍼 + 0.5% HSA에서 ¹⁰⁷ 셀/mL을 × 6개의 셀/mL을 재일시 중단하고 전송 팩 백으로 옮기.
7. 제조업체의 지시에 따라 임상 등급 자기 세포 분리 장치에 튜브 세트를 설치하고, PBS/EDTA 버퍼와 계측기의 셀 제품으로 전사 팩을 배치하고 계측기의 지시에 따라 스파이크합니다.
8. 표지된 αβ T 세포의 고갈을 위해 고갈 1.2 프로토콜을 선택한다.
9. 원심분리기 표적 분획(농축γδ T 세포)을 배지로 분리하고 10%의 인간 AB 혈청으로 보충하였다.
10. 0.5mL 샘플을 채취하고 AO/PI 얼룩으로 셀 수와 생존력을 수행합니다. 약 1 × ¹⁰⁶ 세포/mL의 최종 농도에 세포를 가져옵니다. 유동 세포피토메트리 페노티핑 후 고갈을 위해 제품의 5 × ¹⁰⁶ 세포의 샘플을 채취한다.

3. aAPC와의 공동 문화

1. X선 생성 기기의 100Gy에서 5 × ¹⁰⁷ aAPC/플라스크를 조사합니다.
2. γδ T 세포와 10:1 비율로 공동 배양에 aApC를 사용합니다. 조사된 aApC(5× ¹⁰⁷ 세포/플라스크) 및 γδ T 세포(5 × ¹⁰⁶ 세포/플라스크)를 1L 폐쇄시스템 생물반응기 플라스크에 1L의 인간 AB 세럼으로 보충한다. 최대 10개의 플라스크를 시드합니다.
3. 37°C 및 5% _CO2에서 인큐베이터에서 10일 동안 배양세포를 확장한다.
4. 스트립, 포도당 및 젖산 미터를 사용하여 3-4 일마다 포도당 및 젖산 수준을 모니터링하십시오.
5. 포도당이 250 mg/dL로 떨어지면, 폐시스템 생물반응기의 레드 라인으로 1L 이송 팩을 멸균 용접하여 제약 펌프를 사용하여 플라스크의 부피를 200mL로 줄입니다.
6. 나머지 200mL에서 세포를 혼합하고, AO-PI 염색에 의한 세포 계수 및 생존성 측정을 위해 0.5mL 샘플을 채취한다. 셀 카운트가 ≥¹⁰⁹인 경우, 플라스크 를 두 개의 플라스크로 나누고 AIM-V가 10%의 인간 AB 세럼으로 보충하여 각 플라스크를 최대 1L까지 채웁니다. 세포 수가 <¹⁰⁹인 경우, 10%의 인간 AB 혈청으로 보충된 배양 배지의 신선한 리터로 세포를 공급한다.
7. 모든 플라스크에 대해 3.6단계를 반복하고 37°C 및 5% _CO2에서 인큐베이터로 돌려보세요. 3~4일마다 3.4-3.7단계를 반복합니다.

4. 세포 수확

1. 공동 배양에서 10 일의 끝에서, 모든 생물 반응기 플라스크를 수확. 한 번에 1 개의 생물 반응기 플라스크를 수확하고 모든 세포를 적절한 크기의 이송 팩으로 풀을 넣습니다. 폐시스템 생물반응기의 레드 라인으로 이송 팩을 멸균-용접하고, 제약 펌프를 사용하여 세포를 이송 팩으로 이송한다.
2. 다음과 같은 품질 관리 샘플을 제거: 혈액 배양 및 그램 염색에 의해 멸균에 대 한 약물 제품의 1 %(DP); AO/PI를 이용한 세포 계산 및 생존가능성을 위한 0.5mL; 유동 세포측정을 위한 5-10 × ¹⁰⁶ 세포(게이팅 전략에 대한 그림 1 참조); 엔도독신용 0.5mL; 그램 염색에 대한 0.5 mL; ¹⁰⁶ 세포는 마이코플라즈마 테스트를 위해 소비된 배지의 10mL로 급증했습니다.
3. 실온에서 15 분 동안 200-500 × g 에서 세포를 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
4. 균형 잡힌 결정용액+ 0.5% HSA의 용액으로 셀을 실온에서 15분 동안 × 200-500g 에서 세척하십시오. 균형 잡힌 결정용액 + 0.5% HSA의 목표 부피 100-300 mL로 재보설한다.

5. 릴리스 테스트

1. 다음을 위해 γδ T 세포 DP의 품질 관리 테스트를 수행 : 흐름 세포측정에 의한 순도 및 정체성 (라이브 / 죽은, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); AO/PI 염색에 의한 생존 가능성; 엔도독신; 중합체 연쇄 반응 (PCR)에 의한 마이코플라즈마 테스트; 그램 염색 및 호기성 및 혐기성 혈액 배양에 의한 멸균; 잔류 K562 유동 세포측정제별 분석(CD3-CD16-CD56-CD71⁺).

γδ T 세포 공정은 γδ T 세포 약물의 생산에 대한 특성화 및 최적화되었다. 공정 최적화는 용산화를 이용한 1) 림프구 농축, 2) γδ T 세포 약물 물질(DS) 세포 별 팽창조드로 조드로닉산, 3) γδ T 세포 DS 고갈 TCRαβ, 4) K562 유래 aAPC 및 5) 최종 DP를 이용한 γ T 세포 DS의 이차 확장을 포함하였다. 공정 최적화 후, 3명의 건강한 기증자로부터 유래된 물질을 사용하여 스케일로 확인 실행을 수행하여 세포 처리 적합성을 확인했습니다. 모든 데이터를 분석하고 표 1, 표 2 및 표 3에 요약됩니다. 포스트 카운터플로우 원심분리 분수2(F2)로부터 분리된 세포는 평균 99.23% CD45+ 셀(총 라이브 게이트의 주파수로 보고됨) 및 95.80%의 우수한 평균 생존율을 가진 순수 림프구 집단을 산출하였다(표 1).

졸레드로닉산을 가진 γδ T 세포 특이적 팽창은 용액 화 후 림프구 분획(F2)에 존재하는 천연 킬러(NK) 세포의 초기 비율에 의존하였다. TCRαβ 고갈을 가진 γδ T 세포 DS의 농축은 일관적이었습니다(표 2). 3명의 건강한 기증자로부터 제조된 γδ T 세포 DP는 TCR αβ+ T 세포의 ≤1%의 방출 기준을 충족하기 ± 0.05% CD20+ B 세포 및 0.00%± 0.00%의 ± 평균 0.11%를 가졌다. 최종 제품에서 NK 셀의 평균 비율은 17.06% ± 26.19%이며 <35%의 방출 기준을 충족합니다. 또한 최종 제품에서 T세포 및 NK 세포계수-음수 세포의 평균 백분율은 0.48%± 0.42%(표 3)였다. 전지 표면 염색 및 유동 세포 측정 분석은 도 2A-D에 도시된 바와 같이 DS 및 DP의 정체성, 순도 및 공정 불순물을 특성화하기 위해 활용되었다.

AAPC(K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)의 공동 배양으로부터 달성된 이차 팽창은 10:1의 비율로 WCB 및 γδ T 세포 DS를 생성하여 표 4에 나타난 바와 같이 모든 방출 기준을 충족하는 γδ T 세포 DP를 생성하였다. 또한, 세포는 0-카운터플로우 원심분리 F2 세포에서 유동 세포측정에 의해 염색되고 평가되었다, 일 7-졸레드로닉산 팽창 T 세포, 일 7-TCR αβ T 세포 고갈, 일 17-최종 DP 분화의 다음 바이오 마커 클러스터에 대한 (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC chemokine 수용체 7 (CCR7), 프로그램 세포 죽음 단백질 -1 (PD7), 프로그램 세포 죽음 단백질 -1(PD7), 프로그램 세포 죽음 단백질 -1(PD7), 프로그램 세포 죽음 단백질 -1(PD7), 프로그램 세포 사멸 단백질-1(PD-1) 세포독성 T 림프구 관련 단백질 4 (CTLA4), 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3), 및 T 세포 면역 글로불린 및 뮤신 도메인 함유 단백질 3 (TIM3). 그림 3 에 표시된 데이터는 세 개의 독립적인 실행에서 평균되며 세포가 피로에 도달하지 않았다는 것을 보여줍니다. 또한 Moffitt CTF는 K562 유래 aApC(그림 4)와 관련된 DP 불순물을 결정하기 위해 잔류 K562 분석서를 개발했습니다.

세포 유형의 백분율을 특성화하는 데 사용되는 유동 세포 측정 게이팅 전략은 다음과 같습니다: 1) T 및 NK 세포 혈통-음수 집단(CD3-CD56-CD16-); 2) CD71+의 게이트(잔류 K562 세포의 검출을 허용하는 에리스로이드 계보 및 AML로 발현된 트랜스퍼린 수용체). 이 게이팅 전략은 aAPC (K562CL6 (scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)인 CD3-CD16-CD56-CD71+ 셀의 평가를 허용했습니다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.