방법 논문

렙토스피라의 병원성 종에서 유전자 침묵에 대한 CRISPR 간섭 (CRISPRi) 응용 프로그램

DOI:

10.3791/62631

⸱

2021년 8월 14일

 ,  ,  , 
1Infectious Bacterial Diseases Research Unit, National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas, Instituto Butantan

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 렙토스피라 종에서 특정 유전자 침묵에 대한 CRISPR 간섭(CRISPRi)의 적용이 기술된다. 렙포스피라 세포는 dCas9(촉매 "죽은" Cas9) 및 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 발현하는 플라스미드와 의결합하여 변형되며, 원하는 게놈 표적에 염기 페어링을 담당합니다. 유전자 침묵의 유효성을 검사하는 방법이 제시된다.

초록

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렙토스피로증은 매년 최소 100만 건의 사망자와 거의 60,000명의 사망을 담당하는 전 세계적으로 소홀히 한 동물노시스입니다. 이 질병은 렙토스피라속의 병원성 및 악성 박테리아에 의해 발생하며, 박테리아와의 직접적인 접촉또는 오염된 물이나 토양에 노출되어 간접적으로 발생합니다. 국내 동물과 야생 동물은 감염의 저수지 호스트 역할을, 신장의 식민지 신장 관에서 렙토피레스를 흘리, 소변을 통해, 환경으로. 렙토스피라의 돌연변이 균주의 생성은 감염의 병원성 메커니즘을 평가하고 이해하는 데 중요합니다. CRISPR 간섭 (CRISPRi)는 병원성 렙토스피라에서유전자 침묵에 대한 간단하고 저렴하며 특정 도구로 입증되었습니다. 따라서, dCas9 및 가이드 RNA를 포함하는 플라스미드 구조를 획득하는 방법론적 세부 사항, 대장균 균주 β2163과 의 균주에 의한 플라스미드의 전달, 및 트랜스콩주간트 회수 및 평가, 설명될 것이다. 또한, 최근에 설명된 혼즈비-알트-날리(HAN) 매체는 비교적 빠른 격리와 천고 판에 돌연변이 식민지를 선택할 수 있다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

렙토스피라증은 렙토스피라속의 병원성 및 악성 종으로 인한 소홀한 전 세계 동물노시스입니다. 인간에서, 질병은1백만개 이상의 케이스 및 60,000의 죽음 년 세계1,2를차지합니다. 지금까지, 질병에 대 한 장기 및 효과적인 백신은 없습니다. 독성 요인과 병원성 메커니즘의 식별은 더 나은 치료 및 예방 전략의 개발에 중추적 인이다. 따라서, 유전돌연변이를 생성하고 결과형의 현상형을 평가하는 능력은 기능성 게놈 분석3에매우 중요하다.

병원성 렙토스피라에 돌연변이의 건설은, 지금까지, 본질적으로 비효율적이고, 힘들고, 비용이 많이 들고, 구현하기 어려운 고려되었다. 이 시나리오는 최근 CRISPR 간섭 (CRISPRi)을 saprophytic4 및 병원성5 렙토스피르에 적용하면서 크게 변경되었습니다.

유전자 침묵은 두 가지 성분의 발현에 의해 달성된다: CRISPR/Cas의 변이체(c 광택 regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR sociated) 연쇄상 구균 pyogenes에서효소 Cas9, 촉매 죽은 Cas9 (dCas9) 및 단일 가이드 RNA (sgRNA)라고, 이는 원하는 목표에 따라 편집 할 수6,7,8. dCas9 단백질은, sgRNA에 묶일 때, 왓슨과 크릭 염기 페어링에 의해 특정 DNA 표적으로 향하여 RNA 폴리머라아제 신장에 비질막힘을 일으켜, 막힌 유전자 전사7(그림1)으로인한 유전자 침묵의 결과로.

본 원고는 dCas9와 sgRNA, 기증자 대장균 β2163 및 수신자 렙토스피라 세포, 트랜스콩주간트 회수, 그리고 마지막으로 선택된 돌연변이 식민지의 검증 사이의 컨쥬션을 모두 표현하기 위한 플라스미드의 건설을 설명하는 것을 목표로 한다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 프로토 스페이서 정의 및 플라스미드 건설

참고: 본 섹션에서, sgRNA를 생성하기 위한 적절한 프로토스페이서를 선택하는 첫 번째 단계및 pMaOri.dCas9로의 추가 결찰은 설명된다(그림1). 이러한 프로토스페이스서 서열은 원하는 표적에 대한 20개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

  1. GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)에서 침묵에 대한 관심 유전자의 뉴클레오티드 서열을 획득한다. "Fasta Target"을선택한 후 연쇄상 구균 pyogenes Cas9 및 프로토스페이서 인접 모티프 NGG에 대해 정의된 매개 변수를 사용하여 CHOPCHOP 웹 서버(http://chopchop.cbu.uib.no/)에 제출하십시오. 매개 변수를 "CRISPR/Cas9" 및 PAM(프로토스페이서 인접 모티프) NGG로 정의합니다.
  2. 획득한 결과에 기초하여, 코딩 영역의 5'말에 가능한 한 가깝게 위치한 최상의 점수(녹색 화살표)를 가진 프로토스페이스를 선택하고, 가장 중요한 것은 sgRNA가 완전한 유전자 침묵을 위해 유전자의 코딩 가닥에 페어링되어야 하기 때문에 템플릿(minus) 가닥에 포함되어 있다.
    참고: NGG 모티프는 최종 sgRNA 서열에 포함되지 않습니다.
  3. lipL32 프로모터를 사용하여 5'말단및 보존된 dCas9 스캐폴드 서열에서 가변 20 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA를 발현한다. 20nt 서열, 프로토스페이서라고 불리는 리폴32 프로모터(5'end)와 sgRNA 스캐폴드(3'end)(도1B)에병합한다.
    참고: 잘 정의된 lipL32 프로모터의 경우, TSS에 -334를 포함하는 프로모터 영역을 활용한다(주코바 외9에기초한 전사 시작 사이트). 최종 sgRNA 카세트에 대한 보충 파일을 확인합니다.
  4. 순차적인 PCR5에 의해 sgRNA 카세트를 생성하거나 상용 공급자에 의해 합성한다.
  5. 카세트를 얻은 후, XmaI 제한 부위에서 pMaOri.dCas9 플라스미드로 리게이트 (cccggg)4.
    1. XmaI 제한 효소와 sgRNA 카세트와 pMaOri.dCas9 플라스미드를 모두 소화하고 결찰을 진행(도 1B).
    2. 복제의 pMaOri11 (및 확장, pMaOri.dCas9) 원점에서 인해 dT auxotrophic E. 대장균 균주 π110에서복제 단계를 수행, R6K-감마.
      참고: 결찰 및 클론 선택을 위한 자세한 프로토콜은 페르난데스와 나시멘토12의이전 간행물을 참조하십시오. sgRNA 유도 dCas9는 선택된 관심 유전자의 코딩 가닥에 결합하여, 따라서, RNA 폴리머라제신장(도 1C)을방해하여 유전자 침묵의 결과로 이어질 것이다.

2. 컨쥬게이션에 의한 렙토스피라 변신

참고: 이 단계의 그래픽 구성표는 그림 2에표시됩니다. 한 미디어와 한판을 만들려면 혼즈비 외13 및 페르난데스 외5를참조하십시오.

  1. 1:100에서 신선한 HAN에서 포화 배양을 희석시킴으로써 동요하에 한 배지13에서 병원성 렙토스피라 세포를 29 또는 37°C에서 성장시키는 단계; 일반적으로, L. 심문 세로바르 코펜하겐 균주 Fiocruz L1-130 소요 4-6 적절 한 세포 밀도 도달 하는 일.
    1. 배양이 컨쥬게이션에 사용하기 전에 420 nm(2 ~ 5 x 108 셀/mL)에서 0.2-0.4의 O.D.에 도달하도록 보장합니다.
      참고: 한매체가 세포 밀도가 증가함에 따라 색이 변하기 때문에(DMEM 미디어에 포함된 페놀 레드로 인해), 원심분리기(4,000xg, 15분, 실온) 1mL의 배양매체는 렙토스피레를 제거하고 O.D.D측정을 위한 빈공간으로 서퍼넌을 적용한다.
  2. 균주 대장균 균주 β2163, 디아미노피멜산(DAP)에 대한 보조영양제를 변환하고, 플라스미드 pMaOri.dCas9를 함유하고 sgRNA 카세트를 함유한다. E용. 대장균 변환, 열 충격 프로토콜 또는 전기 포공을 사용. 대조군으로 sgRNA 카세트없이 플라스미드 pMaOri.dCas9와 변환을 포함한다.
    1. 열 충격 변환을 위해, 플라스미드 DNA(100 ng)를 화학적으로 유능한 대장균 세포와 섞고 얼음에 30분 동안 배양합니다. 90s에 대한 42 °C에서 열 충격을 수행하고 5 분 동안 얼음에 다시 배치합니다. LB 매체의 1mL를 첨가하여 세포를 회수하고, 37°C에서 1h로 배양하고 도금으로 진행한다.
    2. 전기 포기의 경우, 플라스미드 DNA의 100 ng와 혼합 전기 유능한 세포를 사용합니다. 펄스에 대한 다음 매개 변수를 사용하십시오: 1.8 kV, 100 Ω 및 25 μF. 위에서 설명한 대로 세포를 복구하십시오.
    3. 탈피증을 선택할 수 있는 디아미노피멜산(DAP) (0.3mMMM) 및 스펙티노마이신(40 μg/mL)으로 보충된 LB 아가르 배지에서 변형된 기증자 대장균 세포를 플레이트한다.
  3. 연상의 경우, 컨스포지션 의 하루 전에 각 플레이트에서 하나의 식민지를 선택 (이는 렙토스피어의 문화의 O.D.를 모니터링하여 결정된다).
    1. 빈 pMaOri.dCas9에서 대장균 β2163의 1개의 콜로니를 선택하고, pMaOri.dCas9sgRNA 플레이트로부터 하나를 선택한다. 37°C에서 LB 플러스 DAP 및 스펙티노마이신의 10mL에서 하룻밤 사이에 성장할 수 있습니다.
    2. 다음날, 포화 배양1:100을 신선한 LB 플러스 DAP(여기에 항생제포함)로 희석하여 0.2-0.4의 OD420nm까지 희석한다. 일반적으로 대장균이 이러한 밀도에 도달하는 데는 2-3 시간이 걸립니다.
  4. BSL2 생체 안전 후드 내부에는 직경 25mm, 0.1 μm 모공 크기, 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인 필터를 유리 베이스 상단에 배치하여 여과 장치를 조립합니다. 상단에 15mL 유리 깔때기를 놓고 스프링 클램프로 두 조각을 모두 잡습니다. 유리를 진공 펌프에 연결하고 여과를 위해 배양기를 깔때기에 추가합니다.
  5. 깔때기에 렙토스피라 문화 5mL를 추가합니다. 두 배양의 OD420nm 값을 기준으로 1:1 비율을 구성하는 대장균의 부피를 추가합니다. 진공 펌프를 켜고 여과하여 세포를 농축합니다. 멤브레인 필터의 세포 농도 후 조심스럽게 검색하십시오. 배지가 멤브레인을 통해 필터링되었는지 확인합니다.
    참고: 여과는 5~10분 정도 걸립니다.
  6. DAP(0.3mMM)로 보완된 상용 EMJH 플레이트(재료 표참조)에 필터를 놓습니다. 박테리아 측이 위로 있는지 확인하십시오. 플레이트를 29°C에서 24시간 동안 배양한다.
    참고: HAN 또는 사내 EMJH14 플레이트를 보충하면 대장균이 의도한 1:1 비율을 증식하고 극복할 수 있으며, 이는 차례로 컨쥬게이션 효율5를감소시킬 수 있다.
  7. 24시간 후, 플레이트에서 필터를 회수하고 각 개별 필터를 50mL 원문 튜브에 놓습니다.
  8. 1mL의 액체 HAN 배지를 사용하여 광범위한 파이펫팅 및 소용돌이에 의해 필터 표면에서 세포를 방출합니다.
  9. 암흑장 현미경 검사법에 의해 회수된 혼합 세균용 용액을 시각화하여 세포 생존력과 운동성, 렙토스피라:E. 대장균 비율을 확인합니다.
    참고: 이 단계에서는 대장균과 렙토스피라의 동등한 숫자를 볼 수 있습니다.
  10. 이 배양의 100-200 μL을 0.4% 불활성화 토끼 혈청과 40 μg/mL 스펙티노마이신을 포함하는 HAN 플레이트에 퍼뜨리고 있습니다. 3% CO2 분위기에서 37°C에서 플레이트를 배양합니다.
    참고 : 일반적으로, L. 심문 세로바르 코펜하겐 균주 Fiocruz L1-130 세포는 제어 플레이트에 5-7 일 및 스펙티노마이신 플레이트에 8-10 일에 식민지를 형성한다. 이 단계에서 대장균은 DAP에 대한 보조 영양이 있기 때문에 성장하지 않습니다.
  11. 대조군으로서 배양기를104개의 렙토스피어스/mL로 희석하고 항생제 없이 플레이트에 100 μL을 추가하여 렙토나선형 성장을 모니터링합니다.

3. 식민지 선택 및 트랜스 콘주간트 성장 및 검증

참고: 식민지는 10일째에 명백해야 합니다. 그러나 시각화하기가 너무 쉽지 않습니다. 일반적으로 이 시점에서 HAN 플레이트는 확산된 건조된 세포로 인해 약간 불투명하며 렙토스피라 콜로니가 희끄무레한 배경에 대한 투명한 후광으로 나타날 수 있다. 다른 빛 발생률을 달성하기 위해 다른 각도로 판을 보는 것이 좋습니다, 따라서, 식민지를 더 분명하게 만드는. 더 긴 잠복 기 시간에, 식민지는 조밀 한 외관을 얻을 수 있습니다., 그리고이 경우, 그들은 어두운 배경에 대 한 유백색 후광으로 존재.

  1. 각 1.5mL 마이크로튜브에 액체 HAN 미디어 100 μL을 추가하여 돌연변이를 복구합니다. 각 접시에서 적어도 3 개의 식민지를 가져 가라.
    1. 마이크로피펫 팁의 도움으로, 렙토나선형 식민지가 지하표면이 될 수 있기 때문에 접시에서 식민지를 회수하기 위해 한고를 "파기"한다.
      참고: 이 단계에서 는 한천이 함께 촬영될 것으로 예상됩니다. 식민지는 빈 pMaOri.dCas9 플라스미드를 포함하는 대조군 플레이트에서 취해야 하며, 표적 유전자를 위해 설계된 dCas9 및 단일 가이드 RNA를 모두 표현하는 플라스미드를 포함하는 렙토스파이어가 함유된 플레이트에서 가져와야 한다.
    2. 수집된 콜로니를 1.5mL 마이크로튜브에 한 미디어의 100 μL로 분배하고 적극적으로 균질화한다. 이 단계에서 는 세포를 방출하기 위해 한천 무결성의 최대 파손을 보장합니다. 10 초 동안 서스펜션을 소용돌이.
  2. 유리 슬라이드에 5 μL 드롭을 추가하여 200-400x 배율에서 암장 현미경으로 회수된 세포를 시각화하고 덮개 슬립으로 즉시 샘플을 덮습니다.
    1. 식민지에서 회복된 살아있는 가능한 렙토스피레의 존재를 확인한다.
    2. 가능한 렙토스파이어의 시각화 및 확인 후, 세포의 100 μL을 40 μg/mL 스펙티노마이신을 포함하는 액체 HAN 매체로 이송한다.
  3. 액체 한 미디어의 성장 후, 프라이머 pMaOri2 F (ACGCAATGTATCGATACCGAC) 및 R (ATAGGTGAAGTAGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)와 플라스미드의 존재에 대한 문화를 평가, 이는 sgRNA 카세트 측면 영역을 인식.
    1. 200 μL의 배양, 원심분리기(4,000 x g,15분)를 수집하고, 상류물을 버리고, 20μL의 물에서 결과펠릿을 재보펜한다.
    2. DNA추출(12)이필요 없이 추가 PCR을 위한 템플릿으로 이 서스펜션을 사용한다.
      참고: pMaOri.dCas9를 가진 세포는 723 bp의 앰플리톤을 렌더링하는 sgRNA 카세트와 플라스미드를 포함하는 것과 비교하여 281 bp의 앰플리톤을 렌더링합니다.
  4. 유전자 침묵의 확인을 위해, pMaOri.dCas9 (음성 통제) 및 pMaOri.dCas9sgRNA를 포함하는 transconjugants에서 세포 추출물을 이용한 면역블롯을 수행하십시오.
    1. 나트륨 도데실 황산염 (SDS) 폴리 아크릴 아미드 젤의 차선 당 5 x 107 세포의 동등한을 적용합니다.
    2. 적절한 항체를 가진 잠복을 위한 막에 전기 전달 단백질. 침묵에 대한 표적 유전자에 대한 항체 외에, 제어를로드하기 위해 다른 하나를 사용합니다.
  5. 한 매체와 스펙티노마이신에 돌연변이 문화를 유지하여 플라스미드를 유지한다. 항생제가 미디어에 적용되지 않으면, 완전한 유전자 침묵은 적어도 3개의 구절5에대해 관찰될 수 있다.

결과

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렙토스피라의 CG 함량이 전형적으로 약 35%임에도 불구하고; 사실상 모든 유전자는 PAM 5'NGG 3'를 포함할 가능성이 높습니다. 이 모티프는 템플릿 가닥에서 고려해야 합니다. CHOPCHOP 결과에 기초하여 유전자의 코딩 서열(처음부터 코돈 중지)을 입력한 후, 프로토스페이서는 마이너스(-, 템플릿) 가닥에서 선택해야 합니다. 20nt sgRNA 프로토스페이서에 NGG 모티프를 포함하지 않는 것이 중요합니다.

1:1 기증자셀 비율로 컨쥬게이션이 수행되는 경우:수령세포 비율, EMJH 천지 플레이트 의 표면에 24h+ DAP, 및 회수된 세균 현탁액의 200 μL이 HAN 플러스 스펙티노마이신 한천판에 확산되고, 트랜스컨쥬펀트 식민지는 약 8-10일 후에 볼 수 있어야 한다. 이 부피의 확산은 일반적으로 플레이트 당 20-40 콜로니(그림 3A)를초래한다. 결합 후 세포 생존가능성을 확인하기 위해, 세포는 항생제 선택 없이 HAN 플레이트에 퍼질 수 있다. 이 경우 식민지는 7일 이내에 관찰될 수 있습니다. 한판은 3% CO2 분위기에서 옅은 노란색으로 변합니다.

식민지 피킹 및 액체 매체의 성장 후 플러스 스펙티노마이신, 전체 세포 및 pMaOri2 프라이머를 사용하여 PCR은 트랜스 컨저질(도 3B)의초기 품질 검사에 사용할 수 있습니다. 대조군 pMaOri.dCas9 플라스미드를 포함하는 렙토나선형 세포는 281 bp의 앰플리콘을 초래해야 하며, 침묵에 대한 플라스미드를 함유하는 세포는 dCas9와 sgRNA를 모두 함유하고 있으며, 723bp 앰플리콘을 초래해야 한다. pMaOri2 F 및 R 프라이머는 SgRNA 카세트 결찰 중에 사용되는 사이트인 XmaI 제한 부위를 측면에 있도록 설계되었습니다.

플라스미드 의 존재확인으로 세포는 미디어에서 수확하고 PBS로 두 번 세척한 다음 면역 blotting을 위한 전세포 추출물을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 침묵이 발생한 경우, 대상 단백질은, 이 경우, LipL32 또는 LigA 와 LigB 둘 다, 야생 형 세포와 pMaOri.dCas9를 포함하는 그에서만 관찰되어야 한다; 노출 시간이 높더라도 pMaOri.dCas9sgRNA(도3C)를함유하는 세포에서 해당 단백질을 볼 수 없습니다.

유전자 침묵 후 렙토나선형 독성을 평가하는 실험이 계획되면, 컨쥬게이션에 사용되는 배양은 낮은 통로 악성 렙토스피라여야한다. 유전자 침묵이 확인된 후, 여러 알리쿼트가 백업으로 동결될 수 있다. 침묵유전자가 측정 가능한 표현형을 가지고 있는 경우, 예를 들어, 재조합 단백질을 사용한 이전 작업에 기초하여 배양은 검증을 위해 사용될 수 있으며, 이 경우 pMaOri.dCas9만 함유하는 세포는 부정적인 대조군으로 포함될 수 있다.

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도 1: dCas9 및 sgRNA 발현 플라스미드의 개발. (A)20nt 긴 프로토스페이서, S. pyogenes dCas9 PAM 5'-NGG-3', 후속 sgRNA가 해당 코딩 가닥에 왓슨 및 크릭 베이스 페어링을 수행할 수 있도록 표적 유전자의 템플릿 가닥 내에서 선택되어 완전한 유전자를 생성한다. (B)sgRNA 카세트는 lipL32 프로모터, 20nt 프로토스페이서 및 dCas9 스캐폴드로 구성된다. pMaOri.dCas9 플라스미드는 XmaI 제한 부위에서 sgRNA 카세트 결찰을 위한 백본으로 사용됩니다. 결과 플라스미드, 불리는 pMaOri.dCas9sgRNA는 렙토스피레로 전달되고, dCas9 및 sgRNA 의 발현은 유전자 침묵에 책임이 있다. (C)sgRNA-지향dCas9RNA 폴리머라제 신장에 물리적 장벽역할을 하므로 전사를 방해한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 컨쥬게이션 프로토콜의 회로도 표현. 원하는 렙토스피라 종은 420 nm에서 0.2-0.4 (중간 로그 단계)의 O.D.까지, 동요하에 HAN 미디어에서 재배됩니다. 하루 전에, 관심의 플라스미드를 포함하는 재조합 기증자 대장균 β2163의 식민지는 LB + DAP + Spc 한천 판에서 수확, 세포는 동일한 보충액체 LB에서 하룻밤 재배로. 다음 날, 포화 E. 대장균 배양은 LB+DAP로 희석되고 420nm에서 0.2-0.4의 O.D.까지 재배된다. 기증자 대장균과 수령인 렙토스피라 모두 음압하에서 여과 장치에 의해 0.1 μm 필터의 표면에 1:1 세포 비율로 혼합된다. 이어서, 필터는 DAP로 보충된 EMJH 천판 위에 배치되고, 인큐베이션은 29°C에서 24시간 동안 진행된다. EMJH의 사용은 대장균 증식을 제한하고 의도된 1:1 비율이 유지됩니다. 박테리아는 1mL HAN 매체로 파이펫팅하여 필터에서 회수되며, 현탁액은 암장 현미경 검사법하에서 시각화됩니다. 마지막으로, 각 서스펜션의 100-200 μL은 0.4% 토끼 혈청을 함유한 HAN 한 천식판에 시드되고 3%CO2에서37°C로 배양된다. 이 단계에서, DAP는 생략되고, 그 결과로, auxotrophic 대장균은 성장하지 않을 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 돌연변이 평가에 대한 대표적인 결과. (A)빈 pMaOri.dCas9로 변형된 렙토스피라를 함유한 플레이트의 콜로니(추가 실험을 위한 음의 제어) 및 플라스미드 pMaOri.dCas9sgRNA(표적 유전자 침묵 포함)를 골라, 액체 한에서 활발히 균질화하고 한은을 함유하는 액체에서 재배하였다. 재조합 세포는 pMaOri.dCas9 내에서 XmaI 사이트를 측면에 프라이머와 PCR에 의해 검증 될 수있다. (B)이 경우, pMaOri.dCas9를 함유하는 세포는 281bp의 앰플리턴을 초래한 반면, dCas9 및 sgRNA를 모두 함유하는 침묵에 대한 플라스미드를 함유하는 세포는 723bp 앰플리톤을 보였다. 플라스미드의 존재를 확인한 후, 유전자 침묵은 면역블롯 분석에 의해 검증되었다. (C)표적 단백질과 로딩 제어 단백질 모두에 항체를 가진 배큐베이션이 권장됩니다. 대표적인 면역블롯에서, pMaOri.dCas9를 단독으로 포함하는 트랜스컨저질제에서 전세포 추출물또는 lipL32(pMaOri.dCas9sgRNAlipL32) 및 LigA 및 LigB(pMaOri.dCas9sgRNAlipL32)를 대상으로 하는 sgRNA 카세트가 표시되어 있습니다. 항-LipL32, 항 리겔랩 및 안티 립L41(비표적, 로딩 제어)을 통한 공동 배큐베이션은 pMaOri.dCas9sgRNAlipL32 및 PMaOri.dCas9sgRNAligARNARNAAB를 포함하는 세포에서 LipL32 단백질의 발현이 폐지되는 것을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일: 단일 가이드 RNA (sgRNA) 카세트 서열. sgRNA 전사는 구성 lipL32 프로모터(굵은 뉴클레오티드)에 의해 지시된다. sgRNA는 표적 유전자의 코딩 가닥에 기본 페어링을 담당하는 프로토스페이서를 지칭하는 20개의 뉴클레오티드및 dCas9 스캐폴드 서열(밑줄뉴클레오티드)으로 구성된다. 엑스마 (주) pMaOri.dCas9 플라스미드에서 결찰을 위해 양 끝에 포함되는 제한 사이트(cccggg). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

병원성15,16,17,18 및 사프로피라 종의 초기 염기서열 분석 후, 게놈의 데이터 마이닝은 렙토나선형 병원성 발생의 여러 측면에 빛을 비추는 다. 대부분의 경우, 단백질 기능은 퍼트렙토나선형 표면 노출 단백질의 재조합 대응 단백질과 원토 단백질기능(20,21,22, 23,23,24,25, 26)의후속 추측을 이용하여 탐구되었다. 

돌연변이의 생성 및 각 표현형의 평가는 기능적 게놈 분석의 핵심 구성 요소입니다. 렙포스피라 스프에서 돌연변이를 생성하려는 초기 시도는 무작위 트랜스포손 돌연변이 발생27,28,29,30에의해 달성되었다. 그러나, 중단된 유전자의 정체성을 추론하기 위한 광범위하고 힘든 분석 후에, L. 심문혈대 세로바르 마닐라에 있는 모든 유전자의 단지 15%가 중단되었다는 것을 주의되었습니다27. 표적 유전자 녹아웃은 자살 플라스미드를 활용한 상동성 재조합에 의해 추가로달성되었으며,원하는표적(31,32)내에서 동종 무기에 의해 측면에 있는 항성 내성 카세트를 전달했다.

이러한 기술을 적용함으로써, 렙토나선형 기초 생물학 및 독성의 여러 측면을 탐구했다31,33,34,35,36,37. 대장균의발달 -렙토스피라 컨쥬게이먼트 셔틀 벡터, pMaOri 11,상피 유전자 침묵에 대한 성분의 전달을 허용했다.

이전에는 Cas9 유도이중가닥이 렙토스피라 스프에 치명적임을 나타내었으며, 대안으로, 효소의 촉매비활성 변이체인 dCas9는 사염및 병원성 종4,5모두에서 유전자 침묵을 달성하는 데 사용될 수 있다. 플라스미드 pMaOri.dCas9를 sgRNA 카세트 결찰을 위한 중추로 사용함으로써, 특이적이고 안정적인 유전자 침묵은 dCas9 및 sgRNA 의 발현으로 인해 얻을 수 있다; dCas9 바운드 sgRNA는 왓슨 크릭 베이스 페어링에 의해 원하는 표적으로 단백질을 지도할 것입니다.

완전한 유전자 침묵의 경우, 프로토스페이스는 원하는 유전자의 템플릿 가닥에 기초하여 설계되어야 하며, sgRNA의 기본 페어링이 코딩 가닥과 함께 발생하도록 한다. 렙토스피라 스프에서 평균 C+G 함량이 35%에 달하며 PAM 5'-NGG-3'은 100bp마다 3배 이상 발생합니다. 따라서 렙토스피라의 게놈 내의 거의 모든 유전자는 적어도 하나의 PAM을 포함할 것이다. 그러나, 모티프 NGG를 찾을 수 없는 경우, 대체 NAG 모티브를 평가할 수 있다.

아연 손가락 및 TALE(전사 활성제 와 같은 이펙터)과 같은 이전 유전자 침묵 기술은 각 표적에 하나의 상이한 단백질의 구성에 의존하여 이러한 기술을 힘들고 비용이 많이 드는38을만들었습니다. CRISPRi의 경우, 가변 성분은 sgRNA이며, 5'end에서 20bp만 변경할 필요가 있습니다. 완전하고 안정적이며 표적화된 유전자 침묵은 렙토스피라 4,5뿐만아니라다른 박테리아8,39,40,41에서도관찰되었다.

한매체(13)의 개발은 식민지 형성의 인큐베이션 시간을 대폭 단축하고 렙토스피라가 37o C에서 성장할 수 있도록 함으로써 돌연변이의 회복을 선호했다. 그러나, 유도 단계 동안, 대장균이 적극적으로 이 매체에서 증식하고 기증자와 수령자 세포 사이 의도된 1:1 비율을 극복할 수 있기 때문에 그것의 사용은 권장되지 않습니다. 이 단계에서 EMJH 와 DAP는 대장균이이 미디어에서 제대로 복제되지 않았기 때문에 더 나은 선택입니다. 일부 실험실은 대장균 세포의 성장을 지원할 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있는 사내 보충 EMJH를 만든다는 것을 언급할 가치가 있습니다.

여기에 제시된 유도 프로토콜은 L. 심문혈구 혈청 체질 피오크루스 L1-130에 최적화되었으며, 토양 샘플5로부터최근 분리된 병원균균의 변형에 효과적인 것으로 입증되었다. L. borgpetersenii 종의 다른 세로바르를 가진 초기 시도는 기술된 프로토콜을 가진 더 낮은 연상 효율을 나타냅니다. 따라서, 렙토스피라의다른 종/세로바르로 작업할 때, 유도체:받는 세포 비율, 초기 세포 밀도, 인주 매체 및 시간(24 및 48h)을 고려하여, 유도체에 대한 최적의 조건을 경험적으로 결정해야 한다. 다른 렙토스피라 종과 세로바르가 다른 연상 프로토콜과 다르게 작동한다고 가정하는 것이 합리적입니다.

사프로피틱 렙토스피라 식민지는 플레이트에 비교적 쉽게 시각화할 수 있지만 병원성 식민지는 관찰하기가 더 어려울 수 있습니다. 일반적으로, 0.4%토끼 혈청과 스펙티노마이신으로 보충된 HAN 미디어를 사용함으로써, 10일째에 트랜스콩주간트 콜로니를 관찰할 수 있다. 우리의 경험에서, 식민지는 처음에 미디어 표면에 투명 후광으로 존재. 비디오 프로토콜에서, 조밀 한 식민지, 성장의 14 일 후, 투명 한 것 들 촬영 하기 어려운 이후 표시 됩니다. 이 단계에서, 다른 빛 발생률을 달성하기 위해 접시를 회전하고 흰색과 어두운 배경 사이를 이동하는 것은 식민지를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

돌연변이 유효성 검사를 위해 면역 블로팅은 간단한 접근 방식을 제공합니다. 그러나, 항체가 표적 단백질에 대하여 항상 유효하지 않기 때문에, 유전자 침묵을 검증하기 위하여 대체 전략은 추구될 수 있습니다. 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)은 표적 유전자에 대한 프라이머와 구성 조절을 사용하여 유전자 전사의 막힘에 책임이 있기 때문에 유전자 침묵의 유효성을 검사하는 데 효과적이다. 표적 유전자가 단백질 젤에서 명확하게 정의된 단백질 밴드를 인코딩하는 경우, SDS-PAGE는 침묵을 입증할 수 있고, lipL32 유전자 에 따라침묵5. LPS 생합성 유전자가 침묵하는 경우에, LPS 염색은 이용될 수 있습니다; 잘 정의된 기질을 가진 효소를 위해 인코딩하는 유전자를 침묵하는 경우, 염색체 기질을 가진 운동 분석은 유효한 전략입니다; l. 비플렉카에서 β 갈라토시다아제 침묵은 X-gal과 ONPG (직교-니트로페닐-β 갈라콘토사이드) 기판4의사용에 의해 검증되었다.

유전자 침묵의 확인 후에, 실험은 표현형을 추가로 평가하기 위하여 디자인될 수 있습니다. 결합 분석은 세균 접착제를 침묵하는 경우에 수행 될 수있다; 혈청 도전 아세는 병원성 렙토스피라5에의해 표시되는 혈청 생존에서 LigA와 LigB의 역할을 확인했습니다. 돌연변이는 또한 독성의 감쇠를 평가하기 위하여 동물을 접종하는 것을 이용할 수 있습니다; 이 경우, 돌연변이와 접종된 동물은 pMaOri.dCas9만 을 함유하는 세포에 감염된 동물과 비교되어야 한다.

결론적으로, 현재 프로토콜은 10 일 이내에 돌연변이 회복을 용이하게하기 위해 HAN 미디어를 사용하여 병원성 렙토스피라 종에서 유전자 침묵에 대한 CRISPRi의 적용을 설명합니다. 기능성 게놈 분석과 결합된 유전자 침묵은 렙토스피라의병원성 메커니즘에 대한 이해를 향상시키고 궁극적으로 질병 통제를 위한 더 나은 예방 전략의 개발로 이어질 것입니다.

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USDA는 동등한 기회 제공 자 및 고용주입니다. 이 출판물에서 무역 이름이나 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. 브라질 기관 FAPESP (보조금 2014/50981-0) 재정적으로이 작업을 지원; LGVF는 FAPESP(2017/06731-8, 2019/20302-8)의 펠로우십으로 지원됩니다. 펀더는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다. 저자는 또한 촬영 및 비디오 프로토콜을 편집USDA 비주얼 서비스에서 한나 힐과 알렉산더 그리미스에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1 & 마이크로; m 기공 크기 혼합 셀룰로오스 에스테르 멤브레인MilliporeVCWP02500세균 접합을 위한 여과
2,6-Diaminopimelic acid (DAP)SigmaD1377auxotrophic E. coli &beta의 성장; 2163
한천 노블BD & 회사214230고체 EMJH 및 HAN 플레이트
Bacto AgarBD & 준비에 사용 Company214010고체 LB 플레이트 준비에 사용
Clarity Western ECL 기판Biorad170-5060화학발광 기판
dNTP 세트Thermo Fisher10297-018PCR 반응용 dNTP
유리 미량 분석 필터 홀더MilliporeXX1012530세균 접합
이미징 시스템BioradChemiDoc MP화학발광 감지
LB 육수, MillerBD & 회사244620E. coli culturing
Leptospira Enrichment EMJHBD & 회사279510EMJH media
Leptospira Medium Base EMJHBD & 보충 Company279410렙토스피라
Mini-PROTEAN TGX 겔Biorad4568043폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 사용
광학 밀도 리더 분자장치SpectraMax M2박테리아 배양의 광학 밀도 측정용
인산염 완충 식염수 7.4Sigma806552세균성 펠릿
SpectinomycinSigma S0692pMaOri 백본 플라스미드 선택
Taq DNA 중합효소Thermo FisherEP0402PCR 반응을위한 Enyme, 완충액 및 MgCl2
ThermocyclerApplied BiosystemGeneAmp PCR System 9700PCR 반응 순환에 사용
Thymidine (dT)SigmaT9250auxotrophic E. coli< / em> &pi의 성장; 1
XmaI 제한 효소New Englan BioLabsR0180L플라스미드 및 인서트 분해
용 여과 이미징 시스템 용 EMJH 배지 12%세척용 식염수 용액

참고문헌

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