Method Article

조직에서 단백질 및 RNA 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식

DOI:

10.3791/62651

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July 6th, 2022

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1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 종양 미세 환경을 더 잘 특성화하고 특정 세포 집단을 식별하기 위해 Spatial Omics 기술의 관심 영역(ROI)을 미세 조정하는 프로토콜을 설명합니다. 단백질체학 분석의 경우 자동화된 맞춤형 프로토콜이 ROI 선택을 안내할 수 있는 반면, 전사체학 분석은 50μm의 작은 ROI를 활용하여 미세 조정할 수 있습니다.

Abstract

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멀티플렉싱을 사용하면 동일한 조직에서 여러 마커를 평가하는 동시에 공간적 맥락을 제공할 수 있습니다. Spatial Omics 기술은 각각 광절단 가능한 올리고 태그 항체와 프로브를 활용하여 단백질과 RNA 멀티플렉싱을 모두 가능하게 합니다. 올리고는 조직 전체의 특정 영역에서 절단되고 정량화되어 기본 생물학을 설명합니다. 여기에서 이 연구는 자동화된 맞춤형 항체 시각화 프로토콜을 활용하여 공간 단백질체학 분석과 함께 ROI 선택을 안내할 수 있음을 보여줍니다. 이 특정 방법은 공간 전사체학 분석에서 허용 가능한 성능을 나타내지 않았습니다. 이 프로토콜은 티라마이드 신호 증폭(TSA)을 사용하여 주어진 단백질 표적의 형광 신호를 증폭하고 선택할 수 있는 항체 풀을 늘리는 자동화된 플랫폼에서 마커 시각화를 위한 3-plex 면역형광(IF) 분석의 개발을 설명합니다. 시각화 프로토콜은 품질과 재현성을 보장하기 위해 철저히 검증된 3-plex 분석을 사용하여 자동화되었습니다. 또한 공간 프로파일링 플랫폼에서 TSA 기반 IF 분석의 이미징을 허용하도록 SYTO 염료에 대한 DAPI의 교환을 평가했습니다. 또한 공간 전사체학 분석을 사용하여 작은 ROI를 선택하여 매우 특정한 관심 영역(예: 주어진 세포 유형에 대해 풍부한 영역)을 조사할 수 있는 능력을 테스트했습니다. 50 μm 및 300 μm 직경의 ROI를 수집하였으며, 이는 각각 대략 15 개의 세포 및 100 개의 세포에 해당한다. 샘플을 라이브러리로 만들고 시퀀싱하여 조직의 작은 ROI 및 프로파일 특이적 영역에서 신호를 감지하는 기능을 조사했습니다. 우리는 공간 단백질체학 기술이 ROI 선택을 안내하는 자동화되고 표준화된 프로토콜의 이점을 크게 활용한다고 판단했습니다. 이 자동화된 시각화 프로토콜은 공간 전사체학 분석과 호환되지 않았지만 표준 수동 시각화 프로토콜을 사용하여 작은 ROI에서도 특정 세포 집단을 성공적으로 검출할 수 있는지 테스트하고 확인할 수 있었습니다.

Introduction

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멀티플렉싱 기술의 발전은 종양에 존재하는 표적에 대해 더 나은 특성화 도구를 계속 제공합니다. 종양 미세환경(TME)은 종양 세포, 침윤 면역 세포 및 기질의 복잡한 시스템으로, 공간정보는 관심 바이오마커 간의 상호 작용 메커니즘을 더 잘 이해하고 해석하는 데 중요합니다1. GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP) 및 10x Visium과 같은 새로운 기술을 통해 공간 컨텍스트 내에서 여러 대상을 동시에 감지하고 정량화할 수 있습니다. 조직 시각화를 용이하게 하는 면역형광 프로토콜을 사용하면 이러한 기술의 공간 프로파일링 기능을 더욱 향상시킬 수 있습니다.

이 방법 개발을 위해 집중한 Spatial Omics 기술은 UV 민감성 광절단 링커를 통해 올리고뉴클레오티드가 항체 또는 RNA 프로브에 부착되는 공간 단백질체학 및 전사체학 분석으로 구성됩니다. 조직학적 슬라이드는 이러한 올리고-접합된 항체 또는 프로브로 표지된 다음 공간 프로파일링 플랫폼에서 이미지화됩니다. 다음으로, 조명을 위해 다양한 크기와 모양의 ROI를 선택하고, 광절단된 올리고뉴클레오티드를 흡인하여 96웰 플레이트에 수집합니다. 광절단 올리고뉴클레오티드는 나노스트링 nCounter 시스템 또는 차세대 염기서열분석(N....

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Protocol

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모든 인체 조직은 적절한 기관 검토 위원회의 승인과 정보에 입각한 동의를 얻었다는 보증에 따라 상업용 바이오뱅크 또는 공인 조직 은행에서 획득했습니다.

참고: 프로토콜은 디스커버리 울트라 및 GeoMx 디지털 공간 프로파일러를 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 공간 단백질체학 분석을 위한 자동화된 시각화 프로토콜

  1. 형광 시각화 항체를 적용하기 위한 프로그램 자동염색기
    1. 오토스테이너 소프트웨어에서 홈 버튼을 클릭하고 프로토콜을 선택합니다. 그런 다음 프로토콜 만들기/편집을 클릭하고 절차로 RUO 디스커버리 유니버설 을 선택합니다.
    2. Depar v2> 탈파라핀화를 > 첫 번째 시퀀스를 클릭합니다. 중간 온도의 경우 72°C를 선택한 다음 전처리를 클릭하고 셀 컨디셔닝

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Results

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ROI 선택을 안내하는 자동화된 시각화 프로토콜
이 백서에서는 자동화된 맞춤형 TSA 기반 IF 프로토콜을 사용하여 조직을 시각화하고 특정 ROI를 선택하는 방법을 소개합니다. 흑색종과 인간 정상 피부를 대조군 조직으로 사용하는 시각화 패널 개발은 에피토프 안정성 테스트, 마커 강도의 미세 조정 및 대조군을 배제한 출혈 평가로 구성되었습니다. 항체의 에피토프 안정성이 반복적인 용리 단계에 의해 영향을 받는지 시험하기 위해, FAP 및 항체 X 신호를 3-플렉스의 각 위치에서 표지한 후 정성적으로 평가하였다. 항체 X 신호는 모든 위치에서 일관되게 유지된 반면, FAP 신호 강도는 1회 용리 후 감소했습니다(그림 2). 이전의 내부 연구에 따르면 panCK 에피토프는 3-plex 분석 전반에 걸쳐 안정적입니다. 따라서, FAP는 3-플렉스에서 1번째 위치에, panCK는 2번째에, 항체 X는 3번째위치에 위치하도록.......

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Discussion

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현재까지, 수동 프로토콜에서 직접 접합된 형광 항체는 공간 단백질체학 또는 공간 전사체학 분석(9,10)을 위한 시각화 패널로서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 직접 접합된 형광 항체의 사용은 덜 풍부한 마커에 대해 도전적일 수 있으며, 적합한 항체의 선택을 제한할 수 있다. 이 프로토콜은 공간 단백질체학 분석을 지원하기 위해 TSA 기술을 사용하는 자동화된 염색 플랫폼에서 시각화 마커의 라벨링을 자동화할 수 있음을 보여줍니다. 이를 통해 시각화 패널의 사용자 정의에 더 많은 유연성을 허용하여 조직의 특정 영역에서 관련 생물학적 데이터를 보다 표적화된 ROI 선택 및 획득할 수 있습니다. TSA 기술은 또한 낮은 존재비 마커의 시각화를 허용하여 잠재적으로 적합한 항체의 수를 증가시킵니다. 또한 시각화 프로토콜의 자동화는 라벨링 절차의 재현성과 품질을 보장합니다.

3-ple.......

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Disclosures

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Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan, Sandra Rost는 Roche Group의 일원 인 Genentech의 직원이자 주주입니다. Roche의 일부인 다른 회사는이 원고에 사용 된 시약과 도구를 생산합니다. Ciara Martin은 이 원고에 사용된 시약과 기기를 생산하는 NanoString Technologies Inc의 정규직 직원입니다.

Acknowledgements

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저자는 NGS 파일을 처리 한 Thomas Wu를 인정합니다. 결과 토론과 원고 검토에 대해 James Ziai와 내부 원고 수정을 위해 Meredith Triplet과 Rachel Taylor에게 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tris 완충 식염수(TBS)Cell Signaling Technologies12498SDEPC 처리수에서 1x TBS로 희석
항체 X(미공개)항체 기밀성으로 인해 맹검
DEPC 처리수ThermoFisherAM9922다른 하나를 사용할 수 있습니다
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)Ventana950-500
DISCOVERY Cy5 KitVentana760-238Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243as FAM
DISCOVERY Goat ig blockVentana760-6008Refer as Gt ig block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRPVentana760-4310Refer as OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation SystemVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FS원고에 autostainer로 표기
FAP [EPR20021] 항체AbcamAb207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1Y원고에서 공간 프로파일링 플랫폼이라고 하는
습도 챔버SimportM920-2
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonPythonStatistical analysis
Reaction Buffer (10x)를Ventana950-300
통계 분석 소프트웨어GraphPadPrism 7통계 분석
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana950-223
Ventana 항체 희석제와 카제인Ventana760-219원고
에 명시된 희석제로 표기Ventana 1차 항체 디스펜서Ventana카탈로그 번호는 디스펜서 번호에 따라 다릅니다
, Refer as Refer 다른 하나는 Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] 항체 Abcam Ab27988 사용할 수 있습니다..

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
  2. Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J.

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Spatial OmicsSpatial ProteomicsSpatial TranscriptomicsRegion Of InterestMultiplex ImmunofluorescenceTyramide Signal AmplificationAutomated Visualization ProtocolProtein Expression ProfilingRNA Expression ProfilingFormalin Fixed Paraffin Embedded

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