방법 논문

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

DOI:

10.3791/62654

⸱

2021년 5월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

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인간 배아 줄기 세포 (hESC)에서 파생 된 간세포와 같은 세포 (HLC)의 잠재적 인 기능은 질병 모델링 및 약물 선별 응용 프로그램에 대한 큰 약속을 보유하고 있습니다. 여기에 제공 기능 용 HLC로 hESC의 분화를위한 효율적이고 재현 가능한 방법이 있습니다. 엔도름 혈통의 확립은 HLC와 차별화의 핵심 단계입니다. 우리의 방법에 의해, 우리는 지속적으로 최종 엔도담 (DE)로 hESC 분화 하는 동안 Activin A와 CHIR99021을 보충 하 여 주요 신호 경로를 조절 하 고, 간 선조 세포의 생성 에 이어, 그리고 마지막으로 완전히 정의 된 시약을 가진 단계 별 방법으로 전형적인 간세포 형태와 HLCs. 이 방법에 의해 생성된 hESC 유래 HLC는 단계별 마커(알부민 포함) 및 HNF4α 핵수용체 및 타우로콜레이트 응수송 폴리펩티드(NTCP)는 성숙하고 기능적인 간세포(인도시아닌 그린 염색, 글리코겐 저장, 헤마톡시린-에신 염색 및 CYP3 활성 포함)와 관련된 특별한 특성을 나타내며, HLC 기반의 응용 분야의 개발을 위한 플랫폼을 제공할 수 있다.

서론

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간은 탈산화, 글리코겐 저장, 단백질1의분비 및 합성을 포함하여 여러 가지 역할을 하는 매우 신진 대사 기관이다. 각종 병원균, 약물 및 항종은 간에서 병리학적 변화를 일으킬 수 있으며 그 기능에 영향을 미칠 수있습니다2,3. 간장의 주요 기능 단위인 간세포는 인공 간 지원 시스템 및 약물 독성 제거에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 1 차적인 인간 간세포의 자원은 간 질병 연구에서 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 치료에서 제한됩니다. 따라서 기능성 인간 간세포의 새로운 소스를 개발하는 것은 재생 의학 분야에서 중요한 연구 방향입니다. 1998년 hESC가 설립된 이래4년이래, hESC는 우수한 분화 잠재력(적절한 환경에서 다양한 조직으로 분화할 수 있음) 및 높은 수준의 자기 갱신성 으로 인해 연구자들이 널리 고려해 왔으며, 따라서 생체인공간, 간세포 이식, 심지어 간 조직 공학5에이상적인 공급세포를 제공한다.

현재, 간 분화 효율은 엔도름6을농축함으로써 크게 증가할 수 ....

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프로토콜

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1. 줄기 세포 유지 보수

참고: 아래에 설명된 세포 유지 보수 프로토콜은 부착된 단층에서 유지되는 hES03 세포주에 적용됩니다. 이 원고의 모든 다음 프로토콜에 대해 세포는 생물학적 안전 캐비닛에서 처리되어야합니다.

  1. mTesR 기본 배지에 5배 보충 배지를 희석하여 1배 mTesR 줄기 세포 배양 배지를 준비한다.
  2. 얼음 에 DMEM / F12의 5 mLhESC 자격을 갖춘 5 mL을 희석하여 30 배 hESC 자격을 갖춘 Matrigel 배지를 준비하십시오. -20 °C에 보관하십시오.
  3. DMEM/F12의 1mL로 30x hESC 인증 된 Matrigel의 33.3 μL을 희석하여 1 x hESC 자격을 갖춘 마모젤 배지를 준비하십시오.
  4. 코팅 멸균 6 잘, 조직 배양 처리 플레이트 1 x hESC 자격을 갖춘 Matrigel의 1 mL을 사전에 저장하고 하룻밤 4 °C에 저장합니다. 사용하기 전에 실온(RT)에서 최소 30분 동안 그대로 둡니다.
  5. 37°C 수조에서 저온 보존 된 hESC를 흔들어서 3 분 동안 해동하십시오. 그런 다음 즉시 4mL 을 포함하는 15 mL 원심분리기 튜브로 피펫팅하여 세포를 37°C mTesR 배지로 이송하고, 2회 위아래....

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결과

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각 분화 단계의 HESC 유도 및 대표 밝은 필드 이미지의 HLC 유도의 회로도는 도 1에표시됩니다. 1단계에서, 액티빈 A와 CHIR99021은 줄기 세포를 형성하여 엔도름 세포를 형성하도록 유도하기 위해 3일 동안 첨가되었다. 단계 II에서, 엔데담 세포는 5 일 동안 분화 배지로 처리 된 후 간 선조 세포로 분화. 스테이지 III에서는 HGF 및 OSM(그림1A)에서10일 만에 초기 간세포가 성숙해 HLC로 분화되었습니다. 분화의 마지막 단계에서, 세포는 전형적인 간세포 표현형(세포는 다각형이고 고르고 정기적으로 분포됨)(도 1B)를보였다.

간 분화를 더욱 확인하기 위해 RT-qPCR, 면역형광 염색 및 서부 블로팅이 엔도름 세포, 간 선조 세포 및 성숙한 간세포(도2)의

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토론

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여기서는 hESC에서 HLC를 3단계로 유도하는 단계적 방법을 제시합니다. 첫 번째 단계에서액티빈 A와 CHIR99021은 hESC를 DE로 차별화하는 데 사용되었습니다. 두 번째 단계에서, KO-DMEM 및 DMSO는 간 선조 세포로 DE를 분화하기 위하여 이용되었습니다. 제 3 단계에서, HZM 플러스 HGF, OSM 및 하이드로 코르티손 21-hemisuccinate 나트륨 소금은 HLC로 간 선조 세포를 계속 분화하는 데 사용되었다.

프로토콜을 사용하는 동안 다음과 같은 중요한 단계를 고려해야 합니다. 세포의 초기 분화 밀도와 중간 변화의 정확한 타이밍은 성공적인 분화를 위한 중요한 요소입니다. 분화하기 시작할 때, 우리는 세포가 막 서로 접촉하기 시작할 때, 그리고 세포 간 공간이 비전의 필드 아래 네트워크에 균등하게 배열될 때, 대략 30-40%의 합류에서, 초기 파종 밀도가 적당하다는 것을 확인해야 합니다. 분화 하는 동안, 해당 분화 매체는 각 대체 단계의 첫 번째.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(X.L.Z.에 81870432 및 81570567)에 의해 지원되었다(81571994 P.N.S.; 중국 광동성 자연과학재단(2020A1515010054호P.N.S.), 리카싱산투대학 재단(No. L1111 2008 - P.N.S.). 샨투 대학 의과 대학의 스탠리 린 교수에게 유용한 조언을 구해 주셔서 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올시그마M7522간 전구 세포 분화
488 표지 염소
ZSGB-BIOZF-0516488 표지 염소, 두 번째 항체
AccutaseStem Cell Technologies7920세포 통로
Activin ApeproTech120-14E확정적인 내배엽 형성
안티-알부민 (ALB)시그마-알드리치A6684IF와 WB의 경우 1 차 항체
안티-인간 Oct4AbcamAb19587IF, 1 차 항체
안티-&알파; -태아 단백질 (AFP)Sigma-AldrichA8452IF 및 WB의 경우 1 차 항체
안티-SOX17Abcamab224637IF의 경우, 1차 항체
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α)Sigma-AldrichSAB1412164IF의 경우, 1차 항체
B-27 보충제Gibco17504-044최종 내배엽 형성
BSABeyotimeST023-200g세포 차단용
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046최종 내배엽 형성용
DAPIBeyotimeC1006핵 염색용
DEPC-waterBeyotimeR0021RNA 용해용
DM3189MCEHY-12071최종 내배엽 형성용
DMEM/F12Gibco11320-033세포 배양용
DMSO Sigma-AldrichD5879간 전구 세포 분화용
DPBSGibco14190-144세포 배양용
GlutaMAXGibco35050-061간 전구 세포 분화
H& BeyotimeC0105S; E 염색
간세포 성장 인자 (HGF)peproTech100-39간세포 분화를 위해
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021간세포 분화를 위해
Hydrocortisone-21-hemisuccinateSigma-AldrichH4881간세포 분화를 위해
IndocyanineSangon BiotechA606326Indocyanine 염색을 위해
Knock Out DMEMGibco10829-018간전구세포 분화용
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02간전구세포 분화용
Matrigel hESC 인증Corning354277세포 배양용
MEM NeAAGibco11140-050간전구세포 분화용
mTesR 5X 보충줄기 세포 기술85852세포 배양
mTesR 기초 매체줄기 세포 기술85851세포 배양
용 종양스타틴 (OSM)peproTech300-10간세포 분화
P450 - CYP3A4 (루시페린 - PFBE)PromegaV8901CYP450 활성
PAS 염색 키트SolarbioG1281PAS 염색용
Pen/StrepGibco15140-122세포 분화를 위한
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgGZSGB-BIOZB-2305WB용, 두 번째 항체
기본 항체 희석 완충액 for  웨스턴 블롯BeyotimeP02561차 항체 희석용
ReverTraAce qPCR RT 키트TOYOBOFSQ-101cDNA 합성용
RNAiso PlusTaKaRa9109RNA 분리용
RPMI 1640Gibco11875093최종 내배엽 형성용
탈지 우유Sangon BiotechA600669두 번째 항체 제제용
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742RT-PCR 분석용
Torin2MCEHY-13002확정적인 내배엽 형성용
TweenSigma-AldrichWXBB7485V세척 완충액 준비용
마우스 IgG ZSGB-BIO ZF-0512에 대한 IF, 토끼 IgG 에 대한 두 번째 항체 IF용 H&를 위한 E 염색 장비

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular....

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Hepatocyte Like CellsHuman Embryonic Stem CellsDirected DifferentiationDefinitive EndodermHepatic Progenitor CellsActivin ACHIR99021Stagewise DifferentiationCYP3A4 ActivityDisease Modeling

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