Drosophila에서,oocyte 핵은 oogenesis 도중 microtubule 의존적인 이주를 겪습니다. 여기서, 우리는 계란 챔버 전 vivo에라이브 이미징을 수행하여 마이그레이션을 따라 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 우리의 절차는 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 다중 위치 3D 타임 랩스 영화를 취득하기 위해 12 시간 동안 살아있는 계란 챔버를 유지합니다.
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이 논문에서
요약
초록
살아있는 세포 화상 진찰은 세포 내의 세포 운동, 세포 골격 재배열, 또는 극성 패터닝을 통제하는 세포 및 분자 기계장치를 이해하기 위하여 특히 필요합니다. 난소 핵 포지셔닝을 연구할 때, 라이브 이미징 기술은 이 과정의 역동적인 사건을 포착하는 데 필수적입니다. Drosophila 계란 챔버는 다세포 구조와 수많은 유전 도구의 큰 크기와 가용성 때문에이 현상을 연구 하는 우수한 모델 시스템. Drosophila 중간 oogenesis 도중, 핵은 microtubule 생성한 힘에 의해 중재된 비대칭 위치를 채택하기 위하여 oocyte 내의 중앙 위치에서 이동합니다. 핵의 이 이동 및 위치는 태아의 극성 축과 후속 성인 비행을 결정하기 위하여 필요합니다. 이 마이그레이션의 한 가지 특징은 3차원(3D)으로 발생하여 라이브 이미징이 필요하다는 것입니다. 따라서, 핵 이동을 규제하는 메커니즘을 연구하기 위해, 우리는 해부 된 계란 챔버를 배양하고 회전 디스크 공초점 현미경 을 사용하여 시간 경과 취득에 의해 12 시간 동안 라이브 이미징을 수행하는 프로토콜을 개발했습니다. 전반적으로, 우리의 조건은 우리가 오랜 시간 동안 Drosophila 계란 챔버를 보존 할 수 있습니다, 따라서 3D의 샘플의 많은 수에서 시각화 할 핵 마이그레이션의 완료를 가능하게.
서론
몇 년 동안 드로소필라 오키테는 핵 이주를 연구하는 모델 시스템으로 부상했습니다. Drosophila oocyte는 계란 챔버에게 불린 다세포 구조물에서 발전합니다. 계란 챔버는 여포 체 세포의 상피 층으로 둘러싸인 16 개의 생식 세포 (15 명의 간호사 세포 및 난미세포)를 포함합니다. 계란 챔버 개발은 14 단계로 세분화되었습니다(그림 1A),그 동안 oocyte 성장하고 배아의 초기 개발에 필요한 매장량을 축적할 것이다. 개발 중, 현미경 재구성 및 모계 결정요인의 비대칭 수송시, 난소세포는 안테로-등대 및 등류 복부를 따라 편광한다. 이 축은 배아의 후속 극성 축과 이 난미1의수정에서 발생하는 성인을 결정한다. oogenesis 동안, 핵은 oocyte에 비대칭 위치를 채택합니다. 6단계에서, 핵은 세포에 중심을 두고 있다. 난십체에 의해 수신되는 후방 여포 세포에 의해 방출되는 신호를 아직 확인되지 않은 후, 핵은 7단계(도 1B)2,3단계에서전방 및 측면 혈장 막 사이의 교차를 향해 이동한다. 이....
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프로토콜
1. 이미징 중간 준비
- 사용 당일 신선한 미디어를 준비하십시오. 슈나이더 배지의 파이펫 200 μL (L-글루타민과 0.40 g/L의 NaHCO3은 10% 열 불활성 태아 송아지 혈청, 페니실린 의 100 U/mL, 그리고 100 mg/mL의 연쇄상 구균)로 보완되었습니다.
- 인슐린 의 30 μL 와 보충 10 mg/mL.
- 열 불활성 태아 종아리 세럼 4 μL을 추가합니다.
2. 관측실 준비
- 파이펫 팁으로 천공슬라이드(도 4D)의아래쪽 구멍 주위에 소량의 실리콘 그리스를 발라주세요.
- 두께 0.13-0.16mm의 24 x 50mm 커버슬립을 배치합니다.
- 파이펫 팁의 넓은 끝으로 커버슬립을 밀봉하고슬라이드(도 4F,G)에실리콘 링 내부를 만들기 위해 실리콘을 평평하게 하기 위해 커버슬립에 압력을 가한다.
3. 난소 해부
- CO2 패드에서 원하는 표현형의 암컷 비행을 마취시화한다.
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결과
마이그레이션하기 전에 핵은 동적이며 사전 마이그레이션으로 정의된 기간 동안 중앙 위치 주위의 진동이 발생합니다. 이 작은 움직임은 난모세포의 중간에 평형을 유지하는 밀고 당기는 힘의 균형을 반영한다. 핵의 궤적을 정량화함으로써, 우리는 APM과 LPM 궤적이 비슷한 비율을 가지고 있음을 보여 주었다. 우리는 핵과 혈장 멤브레인6사이의 첫 번째 접촉에 의해 궤적의 본질을 정의한다. 따라서, 핵은 이를 따라 미끄러지기 전에 APM 또는 LPM에 도달하여 두 혈장 멤브레인의 교차점에 도달한다(도5,영화 1-2). 또한, 우리는 뚜렷한 단서가 각 궤적을 선호한다는 것을 보여주었습니다. 예를 들어, 난낭의 핵과 후방 막 사이에 클러스터된 중척추생물은 APM 궤적을 가능하게 한다. 반대로, 핵 봉투에 비대칭적으로 위치한 미세.......
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토론
다른 프로토콜은 실시간 이미징 분석12,13에대한 Drosophila 계란 챔버 전 vivo를 준비하고 문화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 참신은 중공 알루미늄 슬라이드, 커버슬립 및 O2/CO2 투과성 멤브레인을 사용하여 생성된 이미징 챔버의 사용입니다. 이 셋업의 주요 장점은 샘플에 압력을 가하지 않고 Z의 움직임을 제한하는 것입니다. 따라서, 난모세포는 여전히 자유롭게 움직일 수 있으며, 이것이 첫 번째, 40x 목표가 사용되고 둘째, z-스택이 40 μm을 따라 획득되는 반면, 난소는 6단계에서 약 20 μm 높이이다.
이 프로토콜은 비교적 간단하지만 각 단계는 분석에 중요합니다. 마이크로 챔버의 준비, 투과성 멤브레인 및 챔버의 밀봉은 가스 교환을 허용하고 이미징 매체의 건조를 방지하고, 따라서, 샘플. .......
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공개 사항
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 원래 프로토콜을 개발하고 우리와 함께 그림 3의 몇 가지 그래픽 요소를 공유 장 앙투안 레페산트와 니콜라스 티소트에 매우 감사드립니다. 그림 4의 사진을 찍은 패니 롤랜드 고셀린에게 감사드립니다. 우리는 또한이 기술의 개량에 기여 도움이 토론에 기여한 다른 실험실 구성원과 이 원고를 개선하는 데 도움이 그의 의견에 대한 나다니엘 Henneman에 감사드립니다. 우리는 프랑스 바이오 이미징 (ANR-10-INBS-04)의 회원 인 자크 모노드 연구소의 이마고세인 핵심 시설을 인정합니다. Maëlys Loh는 프랑스 연구부(MESRI)의 박사 학위 펠로우십의 지원을 받고 있습니다. 앙투안 구이체와 프레드 버나드는 ARC (그랜트 PJA20181208148), 협회 데 엔트레프리즈 콘트레 르 암 (그랜트 게플루크 2020 #221366)과 IdEx Université 드 파리 (ANR-18-IDEX-0001)의 출현 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마취 CO2 패드 | Dutscher | 789060 | 마취 파리 |
| 커버슬립 (24x50 mm) | 니트 유리 | VD12450Y100A | 관찰실 준비 |
| 겸자 Dumont # 5 | Carl Roth | K342.1 | 해부 |
| 스테인레스 스틸 바늘 | Entosphinx | 20 | 해부 |
| 열 비활성화 태아 송아지 혈청 | SIGMA-ALDRICH | F7524 | 이미징 매체 |
| 인슐린 용액 소 췌장 | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | 이미징 매체 |
| 페니실린/스트렙토마이신 용액 | SIGMA-ALDRICH | P0781 | 이미징 매체 |
| 투과성 멤브레인 | Leica | 11521746 | 관찰 챔버 준비 |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | 이미징 매체 |
| 실리콘 그리스 | BECKMAN COULTER | 335148 | 관측실 준비 |
| 스피닝 디스크 컨포칼 | Zeiss | CSU-X1 | 핵 이동 관측 |
| 볼탈 레프 오일 10S | VWR | 24627 - 188 | 관측 챔버 준비 |
참고문헌
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A.
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재인쇄 및 허가
