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방법 논문

미세중력에서 치과 및 호흡기 세포와 장기의 전파

2.2K 조회수

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DOI:

10.3791/62690

⸱

2021년 5월 25일

 ,  ,  ,  , 
1Center for Craniofacial Research and Diagnosis, Texas A&M College of Dentistry, 2Department of Stomatology, The Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, 3Key Laboratory of Oral Medicine, Guangzhou Insititute of Oral Disease, Stomatology Hospital of Guangzhou Medical University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 미세중력에서 아멜로모세포 유사 세포의 배양 및 3D 성장을 통해 길쭉하고 분극된 형태와 에나멜 특이적 단백질 발현을 유지하는 방법을 제시합니다. 미세 중력에서 치주 공학 구조물 및 폐 기관의 배양을위한 배양 조건도 설명됩니다.

초록

중력은 인간 세포 기능, 증식, 세포골격 구조 및 방향의 핵심 결정 요인 중 하나입니다. 회전식 생물 반응기 시스템 (RCCS)은 우주에서 발생하는 중력 손실을 모방하고 대신 배양 된 세포 또는 조직의 연속 회전을 통해 미세 중력 환경을 제공합니다. 이러한 RCCS는 영양소, 성장 및 전사 인자, 산소의 중단 없는 공급을 보장하고 움직이지 않는 2D(2차원) 세포 또는 장기 배양 접시에서 중력의 일부 단점을 해결합니다. 본 연구에서 우리는 RCCS를 사용하여 자궁 경부 루프 세포와 치수 세포를 공동 배양하여 ameloblasts가되고, 치주 전구 세포 / 스캐 폴드 상호 작용을 특성화하고, 폐 폐포에 대한 염증의 영향을 결정했습니다. RCCS 환경은 아멜로모세포 유사 세포의 성장을 촉진하고, 스캐폴드 코팅에 반응하여 치주 전구체 증식을 촉진했으며, 배양된 폐포에 대한 염증 변화의 영향을 평가할 수 있었습니다. 이 원고는 환경 조건, 재료 및 단계를 요약하고 중요한 측면과 실험 세부 사항을 강조합니다. 결론적으로, RCCS는 시험관 내 세포의 배양 및 3D(3차원) 성장을 마스터하고 기존의 2D 배양 환경에 적합하지 않은 세포 시스템 또는 상호 작용을 연구할 수 있는 혁신적인 도구입니다.

서론

중력은 개별 세포의 생물학과 유기체 내에서의 기능을 포함하여 지구상의 생명체의 모든 측면에 영향을 미칩니다. 세포는 기계 수용체를 통해 중력을 감지하고 세포 골격 구조를 재구성하고 세포 분열 1,2,3을 변경하여 중력 변화에 반응합니다. 미세 중력의 다른 영향으로는 유체로 채워진 소포의 정수압, 세포 기관의 침강, 흐름과 열의 부력 구동 대류4가 있습니다. 인간 세포와 기관에 대한 중력 손실의 영향에 대한 연구는 원래 우주 비행 임무 중 우주 비행사에 대한 우주의 무중력 환경을 시뮬레이션하기 위해 수행되었습니다5. 그러나 최근 몇 년 동안 NASA가 원래 미세 중력을 시뮬레이션하기 위해 개발 한 이러한 3D 생물 반응기 기술은 2D 배양 시스템에 적용 할 수없는 세포 집단의 배양을위한 새로운 접근 방식으로 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다.

3D 바이오리액터는 현탁액에서 세포를 성장시켜 일정한 "자유 낙하" 효과를 생성하여 미세 중력을 시뮬레이션합니다. 회전식 바이오리액터의 다른 장점으로는 장기 배양 시스템에서 발생하는 공기 노출 부족, 전단 응력 및 난류 감소, 변화하는 영양소 공급에 대한 지속적인 노출 등이 있습니다. 회전식 세포 배양 시스템(RCCS) 생물반응기가 제공하는 이러한 동적 조건은 공간 공동 국소화 및 단일 세포를 응집체로 3차원 조립하는 데유리합니다6,7.

이전 연구에서는 뼈 재생8, 치아 배아 배양9 및 인간 치용 여포 세포배양10을 위한 회전식 바이오리액터의 이점을 입증했습니다. RCCS가 EOE 세포 증식 및 ameloblasts11로의 분화를 향상시킨다는 보고도 있었다. 그러나, 분화된 세포는 그들의 길쭉한 형태 또는 편광된 세포 형태를 고려하지 않고 아멜로블라스틴 면역형광 및/또는 아멜로게닌 발현 단독11 에 기초한 아멜로모세포로 간주되었다.

NASA가 개발한 회전 벽 용기(RWV) 바이오리액터 외에도 세포에서 3D 응집체를 생성하는 다른 기술로는 자기 부상, 랜덤 포지셔닝 머신(RPM) 및 clinostat12가 있습니다. 자기 부상 달성을 달성하기 위해, 자성 나노 입자로 표지 된 세포는 외부 자기력을 사용하여 부상되고, 지방 세포 구조13,14,15의 생체 가공에 사용 된 스캐 폴드가없는 3D 구조의 형성을 초래한다. 미세중력을 시뮬레이션하기 위한 또 다른 접근법은 clinostat16이라는 장치의 중심에서 누적 중력 벡터의 상쇄를 초래하는 2개의 축에 대한 동시 회전을 제어함으로써 다방향 G 힘의 생성이다. 골수 줄기세포를 클리노스탯에서 배양하였을 때, 조골세포 분화의 억제를 통해 새로운 골형성이 억제되었으며, 이는 미세중력의 역분화 효과 중 하나를 예시한다16.

ameloblasts의 충실한 배양을 촉진하기위한 시험관 내 시스템은 치아 법랑질 조직 공학17을 향한 중요한 진전을 제공 할 것이다. 불행히도, 현재까지 ameloblasts의 문화는 도전적인 사업이었습니다18,19. 지금까지 마우스 아멜로모세포 계통 세포주(ALC), 래트 치과 상피 세포주(HAT-7), 마우스 LS8 세포주20, 돼지 PABSo-E 세포주 21 및 래트 SF2-24 세포주22를 포함하여 5개의 서로 다른 아멜로모세포 유사 세포주가 보고되었습니다. 그러나 이러한 세포의 대부분은 2D 배양에서 독특한 편광 세포 모양을 잃었습니다.

본 연구에서 우리는 중간엽 전구세포와 공동 배양된 자궁경부 루프 상피에서 아멜로모세포 유사 세포의 성장을 촉진하고 영양분의 흐름 감소 및 중력으로 인한 세포골격 변화를 포함한 2D 배양 시스템의 문제를 극복하기 위해 회전식 세포 배양 생물반응기 시스템(RCCS)으로 전환했습니다. 또한 RCCS는 치주 조직 공학과 관련된 세포/스캐폴드 상호작용을 연구하고 시험관 내에서 폐포 조직에 대한 염증 매개체의 효과를 조사하기 위한 새로운 방법을 제공했습니다. 함께, 이러한 연구의 결과는 분화된 상피의 전파 및 세포/스캐폴드 상호 작용 및 염증 상태에 대한 조직 반응을 포함하여 시험관 내에서 성장한 세포에 대한 환경 영향 평가를 위한 미세 중력 기반 회전 배양 시스템의 이점을 강조합니다.

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프로토콜

연구가 TAMU 기관 동물 관리 지침을 준수하는지 확인하기 위해 필요한 모든 기관 승인을 받았습니다.

1. 생물 반응기 조립 및 살균

  1. 바이오리액터를 위한 4개의 고종횡비 용기(HARV)를 플라스틱 기기 사이클의 오토클레이브에서 제조자가 권장하는 대로 121°C에서 20분 동안 멸균한다.
  2. 멸균 후, 바이오 리액터와 함께 제공된 나사를 조여 세포 배양 후드에 용기를 조립 한 후 용기를 사용할 준비가됩니다.

2. 생물반응기 공동배양 실험에 사용되는 스캐폴드

  1. 스캐폴드를 세포와 함께 인큐베이션하여 추가 성장에 필요한 세포 부착을 지지합니다.
  2. 공동 배양 연구를 위해 PGA 기반 스캐폴드, 하이드록시아파타이트 스캐폴드, 그래핀 시트, 젤라틴 디스크 및 콜라겐 기반 스캐폴드 중에서 선택하십시오.

3. 자궁 경부 루프 (CL) 해부 및 단일 세포 준비

  1. CO2 과량투여에 의한 호흡정지 후 참수로 마우스를 희생시킨다.
    참고: 모든 동물 연구는 TAMU 기관 동물 관리 지침을 준수합니다.
  2. 이전에 공개된 프로토콜23의 수정된 버전에 따라 출생 후 6일(DPN) 마우스에서 자궁 경부 루프를 해부합니다.
    참고 : 우리 연구에서는 이전에 발표 된 프로토콜에 표시되지 않은 자궁 경부 루프의 말단 부분이 포함됩니다 (그림 3).
    1. 37°C에서 30분 동안 콜라게나제로 소화하기 전에 해부된 조직을 차가운 멸균 PBS로 세척한다.
  3. 용액을 70μm 멸균 세포 스트레이너에 통과시키고 800 x g 에서 10분 동안 추가로 원심분리합니다.
  4. 상청액을 폐기하십시오. 펠릿을 원심분리하고 800 x g의 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 상청액을 폐기하십시오.
  5. 혈구 측정기를 사용하여 세포를 세고 용기 당 1 X 105 세포를 추가하십시오.

4. 치과용 치수 세포 배양 및 세포주 확장

  1. 치과용 치수 세포를 100 mm 조직 배양 플레이트에서 계대 4의 농도로 1 x 105의 농도로 플레이트화한다.
  2. 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제/항진균제(P/S)가 보충된 DMEM 고혈당 배지로 구성된 배양용 배지를 준비합니다.
  3. 세포가 85-90 % 합류에 도달하면 배지를 흡인하고 예열 된 PBS로 플레이트를 두 번 씻습니다.
  4. PBS 세척 후, 예열된 0.25% 트립신-EDTA 용액을 플레이트에 첨가하고, 치수 세포 함유 플레이트를 3분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
  5. 현미경을 사용한 육안 검사로 세포 분리를 확인하십시오.
  6. 배양 플레이트에서 세포와 함께 배지를 수집하고 25mL 피펫을 통해 50mL 멸균 코니컬 튜브로 옮깁니다.
  7. 세포를 800 x g 에서 8분 동안 원심분리하고 상청액을 버린다. 세포를 새로운 배지에 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 계수합니다.
  8. 자궁 경부 루프 세포와의 공동 배양을 위해, 치과 용 펄프 세포를 용기 당 1 x 104 의 농도로 생물 반응기에 시드하십시오.

5. RCCS 바이오리액터 내의 스캐폴드에서 경추 루프/치수 세포의 공동 배양

  1. 세포 유형, 자궁 경부 루프 및 치수 모두를 보충 성장 인자, 세포 외 기질 단백질 및 스캐폴드가 있는 각질 세포 SFM 배지가 포함된 배양 배지에 추가합니다.
    참고: 성장 인자는 0.03 μg/mL 골 형태 형성 단백질 2(BMP 2), 0.03 μg/mL 골 형태 형성 단백질 4(BMP-4), 10 ng/mL 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자(hFGF) 및 15 ng/mL 표피 성장 인자(hEGF)의 농도로 첨가되며, ECM 구성 요소에는 200μg/mL 마트리겔, 5μg/mL 라미닌 및 5μg/mL 피브로넥틴이 포함됩니다.
  2. 1mg의 LRAP(류신이 풍부한 아멜로게닌 펩타이드) 펩타이드, 1mg의 돼지 치아24, 5μg/mL 라미닌 및 5μg/mL의 피브로넥틴으로 제조된 동결건조된 초기 단계 에나멜 매트릭스 1mg이 풍부한 콜라겐 젤 500μL의 혼합물로 스캐폴드를 코팅합니다.
    참고 : 이것은 우리의 실험에 가장 효과적이었습니다.
  3. 스캐폴드 코팅 후, 세포와 스캐폴드를 모두 바이오리액터에 첨가하고, 바이오리액터를 용기당 10mL 배지로 채운다.
  4. 배지, 세포 및 스캐폴드를 추가한 후 생물반응기 용기의 충전 포트 캡을 닫습니다.
  5. 실험 시작시 멸균 밸브를 주사기 포트에 부착하고 실험이 끝날 때까지 덮개가있는 상태로 유지하십시오.
  6. 용기가 90% 채워지고 충전 포트 캡이 닫히고 조여지면 멸균 밸브를 엽니다.
  7. 배지 교체가 필요할 때마다 멸균 주사기 2개(3mL)를 사용하십시오. 한 주사기에 새 배지를 채우고 다른 주사기는 비워 둡니다.
  8. 두 주사기 밸브를 모두 열고 빈 주사기 포트를 향해 기포를 부드럽게 움직입니다.
  9. 전체 주사기의 새 배지가 용기에 조심스럽게 주입되면 빈 주사기 포트를 통해 기포를 제거합니다.
    알림: 이 절차는 모든 미세 기포가 혈관에서 제거될 때까지 수행됩니다.
  10. 캡으로 주사기 포트를 닫고 주사기를 날카로운 폐기물 용기에 버리십시오.
  11. 각 용기를 회전기베이스에 부착하고 회전 장치베이스를 5 % CO2 및 37 ° C 온도의 인큐베이터에 놓습니다.
  12. 전원을 켜고 회전 속도를 10.1rpm으로 설정합니다.
    알림: 비계가 용기 벽에 닿지 않고 매달려 있는지 확인하기 위해 속도를 조정하십시오.
  13. 배지 교체의 경우 세포가 바닥에 정착하도록 혈관을 똑바로 세웁니다. 주사기 포트를 열고 멸균 주사기를 포트에 연결합니다.
  14. 영양이 고갈된 배지의 75%를 흡인하고 다른 포트를 통해 새 배지를 주입하여 동일한 절차를 따르십시오.

6. 폐 기관 준비 및 생물 반응기 기반 배양

참고: E15 야생형 마우스 새끼는 폐 기관의 준비에 사용되었습니다.

  1. 임신한 암컷 마우스를CO2 질식으로 안락사시킨 후 폐 조직을 해부한다.
    1. 자궁 경부 탈구에 의한 질식 후 사망이 확인되면 메스를 사용하여 흉강을 노출시킵니다. 그 후, 자궁에서 새끼를 제거하고 참수로 안락사시킵니다.
  2. 안락사 후 폐를 찾기 위해 메스로 흉강을 열어 흉강을 준비하십시오. 멸균 PBS로 폐 조직의 작은 부분을 세척하고 5 %CO2 및 37 °C 온도를 포함하는 인큐베이터에서 장기 배양 배지로 2 시간 동안 사전 멸균 된 멤브레인에 놓습니다.
  3. 폐 조직이 2D 장기 배양 플레이트의 멤브레인에 부착되면 샘플을 생물 반응기 용기로 옮깁니다.
  4. 문화권에 맞게 미디어를 준비합니다.
    참고: 대조군 DMEM 고포도당 배지에는 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 항생제 용액(P/S)(페니실린, 100U/mL, 스트렙토마이신, 50μg/mL) 및 100μg/mL 아스코르브산(AA)이 포함되어 있으며 염증 상태의 유도를 위해 대조군 배지에는 5ng/mL IL-6 단백질이 보충됩니다.
  5. 상기와 같이 생물반응기에서 48시간마다 배지를 교체하여 10일 동안 폐배양 실험을 수행한다.

7. 인간 치주 인대(hPDL) 세포 배양으로 코팅된 스캐폴드

  1. 인간 치주 인대 세포를 배양하십시오.
    참고: 세포는 이전에 발표된 프로토콜25에 따라 우리 실험실에서 분리되고 배양됩니다.
  2. 콜라겐 스캐폴드 디스크를 대조군용 PBS 30 μL와 뉴로펩타이드 갈라닌(GAL)을 밤새 10-8 의 농도로 코팅합니다.
  3. 대조군 상에 인간 PDL 세포를 GAL 코팅된 스캐폴드 상에서 배양 플레이트에서 37°C에서 2시간 동안 하고, 세포 시드된 스캐폴드를 상기에서 언급한 바와 같은 생물반응기 용기로 옮긴다.
  4. 분석을 위해 스캐폴드를 수확하기 전에 생물반응기에서 14일 동안 세포 시드된 스캐폴드를 배양한다.

8. 생물 반응기 청소 및 유지 보수

  1. 스캐폴드/세포가 바이오리액터로부터 수확된 후, 용기로부터 주사기 포트를 제거한다.
    알림: 용기 주변의 나사를 제거하고 용기를 비눗물로 부드럽게 씻습니다.
  2. 깨끗한 물로 용기를 헹구고 나사를 한 번 더 조입니다.
  3. 다음 사용 때까지 오토 클레이브 후 용기를 보관하십시오.

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결과

생물 반응기의 내부 챔버는 세포가 증식 및 분화하거나 스캐 폴드에 부착되거나 집합체와 같은 조직을 형성하기 위해 모일 수있는 환경을 제공합니다. 각 HARV 용기는 최대 10 mL의 배지를 담을 수 있으며 영양소의 지속적인 순환을 촉진하여 각 세포가 생존할 수 있는 탁월한 기회를 제공합니다. 그림 1A 는 멸균 원스톱 밸브가 부착된 용기의 전면 플레이트에 주사기 포트를 부착하는 것을 보여줍니다. 이 밸브는 배양실의 문지기 역할을합니다. 매체를 변경하려면 새로운 매체가 들어있는 멸균 주사기를 쉽게 부착 할 수 있도록 스톱 콕 밸브를 열어야합니다. 바이오리액터 내의 미세중력 환경은 세포가 스캐폴드 상에 사전 시딩을 요구하지 않고 용기 내의 스캐폴드에 부착되도록 한다. 바이오리액터에 배치된 스캐폴드(그림 1B 및 1C)는 연속적으로 회전하여 세포가 스캐폴드 표면에 부착되어 세포골격 네트워크를 형성할...

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토론

미세중력에서 세포의 성장을 위한 프로토콜의 중요한 단계는 세포 분화를 유도하는 수단으로서 생물반응기, 스캐폴드, 3D 배양에 사용되는 세포, 및 스캐폴드 코팅을 포함한다. 우리 연구에 사용 된 생물 반응기의 유형은 시뮬레이션 된 미세 중력에서 세포를 성장시키기 위해 NASA가 개발 한 원래의 회전 세포 배양 시스템 (RCCS) 회전 원통형 조직 배양 장치의 최근 수정 인 RCCS-4 생물 반응기로 구성됩니다. 이 RCCS-4 환경은 매우 낮은 전단 응력을 제공하여 물질 전달을 향상시키고 배양 성능을 향상시킵니다. 이 버전의 생물 반응기는 동시에 4 개의 다른 실험을 위해 4 개의 용기를 동시에 사용할 수있었습니다. RCCS-4 바이오리액터에는 높은 종횡비(HARV) 용기가 장착되어 있어 연구를 위한 충분한 수의 세포로 간단하고 직접적인 배양 조건을 보장했습니다.

우리 접근 방식의 두 번째 중요한 구성 요소는 플로팅 셀이 어셈블리를 부착하고 형성할 수 있는 템플릿을 제공하는 스캐폴...

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공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

연구는 국립 치과 및 두개 안면 연구소 (UG3-DE028869 및 R01-DE027930)의 보조금으로 아낌없이 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항생제 - 항진균성 ThermoFisher Scientfic15240096
Ascorbic AcidSigma AldrichA4544
BGJb Fitton-Jackson Modification mediaThermoFisher Scientfic12591
BIOST PGA scaffoldSyntheconCustom맞춤 주문을 통해 회사에서 제공
BMP-2R & D 시스템355-BM
BMP-4R& D Systems314-BP
DMEM 미디어시그마 AldrichD6429-500mL
FBSThermoFisher Scientfic16140071
FibricolAdvanced Biomatrix5133-20mL
피브로넥틴Corning354008
GalaninSigma AldrichG-0278
젤라틴 디스크고급 BiomatrixCytoForm 500
그래핀 시트Advanced BiomatrixCytoForm 300
hEGFPeprotechAF-100-15
hFGFThermoFisher ScientficAA1-155
Hydroxyapatite discAdvanced BiomatrixCytoForm 200
Il-6 proteinPeproTech200-06
각질 세포 SFM 매체 (1X)ThermoFisher Scientfic17005042
라미닌코닝354259
LRAP 펩타이드펩타이드 2.0맞춤 제작 서열 : MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT
PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL< > PLEAWPATDKTKREEVD
MatrigelCorning354234
Millipore 니트로 셀룰로오스 멤브레인Merck Millipore
RCCS 생물 반응기SyntheconRCCS 4HD
SpongeColAdvanced Biomatrix5135-25EA
주사기 밸브 편도 스톱콕 w/스위블 남성 루어 잠금Smiths MedicalMX5-61L
바늘 포함 주사기 3ccMcKESSON16-SN3C211
트립신 EDTA (0.25%)ThermoFisher Scientfic
AABP0470025200056

참고문헌

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