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방법 논문

신경과 같은 조직을 위한 Murine 피질 성상 세포의 3D 생물 인쇄

6.4K 조회수

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DOI:

10.3791/62691

⸱

2021년 7월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

이 논문에서

요약

여기서 우리는 중추 신경계에 있는 성상세포의 기능 및 신경질 세포와 관련시키는 기계장치를 연구하기 위하여 신경같이 조직을 biofabricating을 위한 3D 생물 인쇄 murine 피질 성상 세포의 방법을 보고합니다.

초록

성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 필수적인 역할을하는 신경 교세포이며 신경 지원 및 기능을 포함합니다. 이 세포는 또한 신경 상해에 반응하고 퇴행성 사건에서 조직을 보호하기 위하여 행동합니다. 성상 세포 '기능의 체외 연구에서 이러한 이벤트에 관련 된 메커니즘을 해명 하 고 신경 장애를 치료 하는 치료 개발에 기여 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜은 3D 바이오프린팅 성상세포-라덴 바이오잉크에 의해 성상세포가 풍부한 신경과 같은 조직 구조를 바이오패브릭화하는 방법을 설명합니다. 압출 기반 3D 바이오 프린터는이 작업에 사용되었고, 성상 세포는 C57Bl/6 마우스 새끼의 뇌 코르티체에서 추출되었다. 바이오잉크는 3번 통로까지 피질 성상세포를 젤라틴, 젤라틴-메타크라이로일(GelMA), 피브리노겐으로 구성된 생체재료 용액에 혼합하여 최적의 생체 인쇄 조건을 제시하였다. 3D 바이오프린팅 조건은 세포 스트레스를 최소화하여, 74.08%± 세포가 생체 인쇄 직후 실행 가능했던 공정 중 성상세포의 높은 생존가능성에 기여했습니다. 인큐베이션 1주 후, 성상세포의 생존가능성은 3.00%± 83.54%로 크게 증가하여 3D 구조가 세포 성장에 적합한 미세환경을 나타낸다는 것을 나타낸다. 생체 물질 조성은 세포 부착을 허용하고 성상체 행동을 자극, 세포는 특정 성상 세포 마커 신경교 세동 산성 단백질을 표현 (GFAP) 전형적인 성상체 형태를 소유. 이 재현 가능한 프로토콜은 세포의 기본 미세 환경과 유사한 성상 세포가 풍부한 3D 신경과 유사한 조직을 생체 제작하는 귀중한 방법을 제공하며, 성상세포기능및 신경질환과 관련된 메커니즘과의 관계를 이해하는 것을 목표로 하는 연구자들에게 유용합니다.

서론

성상 세포는 중추 신경계에서 가장 풍부한 세포 유형 (CNS) 뇌 항상성에 중요한 역할을한다. 지속적인 신경 지원 이외에, 성상 세포는 신경 전달 물질 섭취량을 조절에 대 한 책임, 혈액-뇌 장벽 무결성유지,신경 시 냅 토 발생1,2조절. 성상 세포는 또한 CNS 염증에 필수적인 역할을, 점성 반응 성 반응성 점성구체3,4로이어지는 과정에서 뇌에 부상에반응,퇴행성 에이전트에 건강한 조직 박람회를 방지하는 신경교 흉터를 형성5. 이 이벤트는 성상세포의 유전자 발현, 형태학 및 기능6,7의변화를 초래한다. 따라서, 성상 세포 ' 기능을 관련 된 연구는 신경 질환을 치료 하는 치료의 개발에 대 한 도움이 됩니다.

체외 모델은 신경 상해와 관련된 메커니즘을 연구하는 데 매우 중요하며, 피질 성상세포의 성공적인 격리 및 2차원 (2D) 문화가 확립되었지만8,이 모델은 네이티브 세포 동작을 모방하고 뇌의 복잡성을 재현하는 현실적인 환경을 제공하지 못합니다9 . 2D 조건에서, 가난한 기계적 및 생화학적 지원, 낮은 세포 세포 및 세포 매트릭스 상호 작용 및 기저 -정격 극성의 부재로 이어지는 세포 평탄화, 세포 신호 역학 및 변경 된 세포 형태및 유전자 발현으로 이어지는 실험 결과에 영향을 미치며, 이는 치료10에대한 반응을 타협한다. 따라서 결과를 클리닉으로 변환하는 것을 목표로 보다 현실적인 신경 환경을 제공하는 대안을 개발하는 것이 중요합니다.

3차원(3D) 세포 배양은 CNS11을포함한 장기 및 조직의 충실도 특징이 증가함에 따라 재구성되는 고급 모델을 나타낸다. 신경교 배양에 관해서는, 3D 모델은 성상세포 형태, 세포 기저-정성 극성 및 세포 신호12,13의유지에 기여한다. 3D 바이오프린팅 기술은 세포와 생체 물질을 사용하여 토착 조직의 구조와 특성을 재현하여 3D 살아있는 조직을 통제방식으로 바이오 패브릭화하는 강력한 도구로 떠올랐습니다. 이 기술의 사용은 결과 예측의 실질적인 개선을 주도하고 CNS14,15,16에적용되는 재생 의학에 기여하고있다.

여기에 설명된 프로토콜은 피질 성상세포의 격리및 배양에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 글라틴/젤라틴 메타크라이로일(GelMA)/피브리노겐에 내장된 생체 인쇄 성상세포에 대한 재현 가능한 방법을 자세히 설명하며, 라미닌으로 보충된다. 이 작품에서, 압출 계 바이오프린터는 1 x 106 세포/mL의 밀도로 피질 성상세포를 포함하는 생체 재료 조성물을 인쇄하는 데 사용되었다. 생체 프린팅 전단 응력은 인쇄 속도를 제어하여 최소화되었고, 성상세포는 공정 후 높은 생존력을 보였다. 생체 인쇄 구조는 1주 동안 배양되었고, 성상세포는 하이드로겔 내에서 확산, 부착 및 생존할 수 있었고, 성상체 형태를 유지하고 특정 마커 신경교 세동산성 단백질(GFAP)4를발현하였다.

이 절차는 피스톤 중심의 압출 기반 바이오 프린터와 호환되며 다양한 소스에서 파생된 성상 세포에 사용할 수 있습니다. 여기에서 제안된 3D 생체 인쇄 모형은 건강한 조직에 있는 성상세포 기능에 관련되었던 기계장치의 연구 및 신경 병리학 및 처리 발달의 진행을 이해하는 것과 같은 신경 공학 응용의 넓은 범위에 적합합니다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 연구 (http://www.iclas.org)에서 동물 사용에 대한 국제 지침을 따랐으며 대학 연방 드 상파울루 (CEUA 2019 / 9292090519)의 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 마우스 뇌 해부

  1. 차가운 행크스 버퍼드 솔트 솔루션(HBSS)을 100mm 배양 접시에 10mL, 1mL을 1.5mL 마이크로튜브로 옮춥니다. 동물당 마이크로튜브 1개를 준비합니다.
    참고: 문화 접시와 마이크로튜브는 모두 얼음 위에 보관해야 합니다.
  2. DMEM F12 + 10% 태아 소 혈청(FBS), 2% 글루타민, 1% 페니실린-연쇄절제술(P/S)을 사용하여 성상세포 배양 배지를 준비한다. 0.2 μm 필터를 사용하여 필터링하여 매체를 살균합니다.
  3. C57Bl/6 마우스 새끼 (산후 일 1) 날카로운 작동 가위를 사용하여 참수하여 안락사. 집게를 사용하여 피부를 당기고 두개골을 노출시하십시오. 가위와 집게를 70% 에탄올로 살균할 수 있도록 하십시오.
  4. 날카로운 곡선 팁 가위를 사용하여 두개골을 머리 꼭대기로 잘라냅니다.
    참고: 뇌조직이 손상되지 않았는지 확인하십시오.
  5. 이전에 에탄올 70%로 살균된 주걱을 사용하여 두개골 구멍에서 뇌를 들어 올려 차가운 HBSS 10mL를 함유한 배양 접시에 놓습니다.
  6. 스테레오현미경 아래에 뇌를 함유한 배양 접시를 놓고, 두 개의 무딘 팁 포셉을 사용하여 뇌에서 수막을 제거한다(도1).
  7. 주걱을 사용하여 뇌의 중앙값에서 부드럽게 굴려 서 뇌의 나머지 부분에서 코르티스를 분리하십시오.
  8. 코르티체를 모두 수집하고 즉시 차가운 HBSS 1 mL을 포함하는 동일한 마이크로 튜브로 전송합니다.

2. 성상세포 고립과 문화

  1. 라미나르 의 흐름 아래에서, 곡선 마이크로 가위를 사용하여 작은 조각으로 피질 조직을 잘라, 위아래로 3 배 파이프하여 HBSS의 1 mL로 씻어. 조직이 정착 할 때까지 기다립니다. HBSS를 제거하고 신선한 HBSS를 추가하여 프로세스를 두 번 더 반복합니다.
  2. HBSS를 제거하고 5 분 동안 37 °C에서 0.05 % 트립신의 1 mL로 조직을 배양하십시오.
    참고: 이 시점에서트립신 소화만으로 충분합니다.
  3. 15배 위아래로 부드럽게 파이프를 사용하여 조직을 기계적으로 분리합니다.
    참고: 조직의 완전한 해리는 현탁도의 증가와 현탁액에 있는 조직의 큰 단편의 부재에 의해 관찰됩니다.
  4. 용액을 15mL 원추형 튜브로 옮기고, 동일한 양의 FBS를 추가하여 트립신 활성을 중화하고, 0.4 μm의 세포 스트레이너 필터에서 용액을 필터링하여 비해리된 단편을 제거한다.
  5. 성상 세포 배지의 1 mL로 필터를 세척하고, 여과기를 통과 한 세포 현탁액을 수집하고, 200 x g 및 25 °C에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 원심분리 후, 상체를 버리고 성상세포 배양 배지의 1mL에서 펠릿을 중단한다.
  6. 세포 현탁액을 T25 배양 플라스크로 옮기고, 배지의 부피를 3.5mL로 구성하고, 세포를 37°C 및 5% CO2로배양한다.
  7. 24시간 이후에 세포가 부착되어 있는지 확인합니다. 그런 다음, 매체를 교체하고 3 일마다 변경합니다.
  8. 7 일 후, 1 x PBS의 2 mL로 세포를 세척하여 배양에서 마이크로 글리아와 oligodendrocytes를 제거합니다.
  9. PBS 솔루션을 성상세포 배양 매체로 교체하고 하룻밤 사이에 180rpm의 궤도 셰이커에 배양 플라스크를 남깁니다.
    참고: 성상세포는 약 10-12일 의 문화에서 컨물류 단층을 형성합니다.

3. 젤라틴 메타크릴합성 (GelMA)

  1. 돼지 피부에서 얻은 젤라틴 10g의 무게를 측정하고 용액이 완전한 용해 될 때까지 240 rpm 및 50 °C에서 가열 판에 저어줌으로써 PBS의 100 mL에 용해하십시오.
  2. 후드 아래에는 낮은 정도의 기능화를 위해 2mL의 메타크릴 무수화물(MA)을 추가하고 젤라틴 에멀젼이 2시간 동안 240rpm 및 50°C에서 저어줍니다.
    주의: MA 위험 진술: H302 + H332 (삼키거나 흡입하는 경우 유해), H311 (피부와 접촉하는 독성), 314 (심한 피부 화상 및 눈 손상을 유발), 315 (피부 자극을 일으키는), H317 (알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수 있음), H318 (심각한 눈 손상을 일으킬 수 있음), 331 (흡입하는 경우 독성), H332 (흡입 시 유해), H335 (호흡 자극을 일으킬 수 있음). 취급 지침: P261 (먼지/ 연기/ 가스/미스트/증기/스프레이 호흡을 방지), P305 + P351 + P338 + P310 (눈 안에 있는 경우: 몇 분 동안 물로 조심스럽게 헹구십시오. 콘택트 렌즈를 제거, 존재하는 경우 쉽게 할 수 있습니다. 즉시 독 센터 / 의사를 호출, P301 + P312 + P330 (삼키는 경우 : 당신이 기분이 좋지 않은 경우 독 센터 / 의사에게 전화. 입을 헹구습니다).
    참고: MA를 매우 느리게 추가하고 드롭으로 드롭합니다.
  3. 젤라틴-MA 용액을 예열된 PBS(50°C)의 100mL로 희석하여 최종 부피 200mL를 얻고 용액이 10분 동안 240rpm 및 50°C에서 저어줍니다.
  4. 투석막 20cm(분자 컷오프 12-14kDa)를 자르고 부드러워질 때까지 탈이온물에 담급니다.
    참고: 막에 탈이온화된 물로 채워 구멍이나 결함이 없는지 확인합니다.
  5. 깔때기를 사용하여 젤라틴-MA 용액을 멤브레인으로 이송합니다.
    참고: 양면을 닫아 내부에 여분의 공간을 남겨 두어 혼합물을 허용합니다.
  6. 젤라틴-MA 용액이 함유된 멤브레인을 투석을 위해 증류수 2L가 있는 용기에 넣고 5일 동안 40°C(500rpm)로 저어줍니다.
    참고: 물 증발을 방지하기 위해 용기를 덮습니다.
  7. 증류수를 하루에 두 번 바꿉니다. 매번, 균질화를 위해 멤브레인을 거꾸로 뒤집습니다.
  8. 5일째에는 투석된 젤라틴-MA에 예열된 초순수(40°C)의 200mL를 섞어 40°C에서 15분 동안 저어줍니다.
  9. 젤라틴-MA 용액을 최대 25mL까지 50mL 원내 튜브로 옮기고 튜브가 -80°C에 2일 동안 유지하도록 한다.
    참고: 구균을 용이하게 하기 위해 튜브를 수평으로 저장합니다.
  10. 3-5 일 동안 냉동 된 용액을 lyophilize하고 습도로부터 보호 된 lyophilized GelMA를 저장합니다.

4. 바이오잉크 준비

참고: 바이오잉크 1mL를 얻기 위해서는 여과 중에 손실이 있을 수 있으므로 적어도 3mL의 생체 재료 용액을 제조하는 것이 좋습니다.

  1. 피브리노겐 용액 의 준비
    1. 식염수(NaCl 0.9%)를 준비시키고, 10 mg/mL의 농도를 얻기 위해 식염수의 1mL에 소 플라즈마로부터 10 mg의 피브리노겐을 용해한다.
      참고: 피브리노겐 을 유리에 담소를 사용 하 여, 피브리노겐 솔루션을 준비 하기 위해 유리 플라스크를 사용 하지 마십시오.
    2. 피브리노겐의 완전한 용해가 될 때까지 37°C의 교반 아래에 용액을 둡니다.
      참고: 피브리노겐 용해의 경우 오븐 내부에 37°C에 배치된 로터리 시스템을 사용합니다. 37°C에서 핫 플레이트에 피브리노겐의 자기 동요 (180 rpm)도 적합하다. 이 조건하에서, 10 mg/mL fibrinogen는 용해하는 약 40 분 걸립니다.
  2. 젤라틴/젤마 용액 의 준비
    1. 젤라틴 의 0.12 g의 무게와 4 % (w / v) 젤라틴의 최종 농도를 얻기 위해 예열 된 PBS (40 °C)의 1.9 mL에 추가합니다. 용해를 용이하게 하기 위해 소용돌이.
    2. 에멀젼을 40°C로 유지하여 용해가 완료될 때까지 보관하십시오.
    3. 용성 겔마의 무게 0.06 g와 젤라틴 용액으로 전송하여 2%(w/v) GelMA의 최종 농도를 얻습니다. 용해를 용이하게 하기 위해 소용돌이.
    4. 용액이 완전히 용해 될 때까지 40 °C로 유지하십시오.
  3. 성상 세포가 함유 된 젤라틴 / GelMA / 피브리노겐 바이오 잉크의 준비
    1. 파이펫 0.9 mL의 10 mg/mL 피브리노겐 용액및 젤라틴/GelMA 용액으로 이송하여 3 mg/mL의 최종 농도를 획득한다.
    2. 0.015 g의 광신염기(PI)를 계량하고 젤라틴/GelMA/fibrinogen 용액으로 이송하여 0.5%(w/v) PI의 최종 농도를 얻습니다. 튜브를 위아래로 뒤집어 서 용액을 혼합하고 PI 분해를 방지하기 위해 빛으로부터 보호된 40°C로 유지하십시오.
      참고: 바이오잉크를 최대 24시간 동안 4°C로 비축합니다.
    3. 라미나르 흐름 하에서 0.2 μm 필터를 사용하여 용액을 멸균 15mL 원문 튜브로 필터링합니다.
      참고: 생물 재료 용액은 여과를 허용하기 위해 37-40 °C에 있어야합니다.
    4. 생체 재료 용액의 980 μL을 15mL 원문 튜브로 이송합니다.
    5. 식염수 용액으로 라미닌을 희석하여 100 μg/mL의 스톡 솔루션을 얻습니다.
    6. 파이펫 20 μL의 라미닌과 바이오잉크를 함유하는 튜브로 이송하여 2 μg/mL 라미닌의 최종 농도를 얻었다.
    7. 거품을 피하고 위아래로 파이프를 통해 부드럽게 섞습니다. 거품이 지속되면 원심튜브를 200 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 바이오잉크를 세포와 혼합할 때까지 37°C로 유지합니다.
    8. 트립시니화 기본 성상 세포와 0.05% 트립신 5 분.
      참고: 1-3 구절의 성상세포를 사용합니다.
    9. 1:1의 비율로 FBS로 트립신 활성을 중화하고 세포를 15 mL 원추형 튜브로 이송한다. 원심 분리기는 5 분 동안 200 x g에서 분리됩니다.
    10. 세포를 계산하고 1 x 106 세포를 다른 원문 튜브로 옮길 수 있습니다. 원심 분리기는 5 분 동안 200 x g에서 분리됩니다.
    11. 원물 튜브의 바닥을 부드럽게 눌러 셀 펠릿을 일시 중단하기 위해 작은 부피 (~200 μL)를 남기는 상체를 제거합니다.
    12. 젤라틴/GelMA/fibrinogen 용액 1mL을 세포를 포함하는 튜브로 옮기고 부드럽게 피펫을 위아래로 피펫하여 균질화하여 1 x 106 셀/mL의 최종 농도를 얻습니다.

5. 크로스링커 용액 의 준비

  1. 트롬빈 재구성
    1. 15mL 원추형 튜브에서 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)으로 살균 제열수에 혈전 100 U/mL의 스톡 솔루션을 준비한다. -20 °C에서 마이크로 튜브에 재고.
      참고: 트롬빈 애드소스가 유리에 사용되므로 유리 플라스크를 사용하여 스톡 솔루션을 준비하거나 알리쿼트를 보관하지 마십시오.
  2. 혈소판-CaCl2 용액 의 준비
    1. Pipette 100 μL 의 혈전 스톡 용액및 멸균 분수 의 8.9 mL을 포함하는 50 mL 원추형 튜브로 전송하여 1 U/mL thrombin의 최종 농도를 얻습니다.
    2. 10% (w/v) CaCl2 용액을 탈온화된 물에 준비하고 0.2 μm 필터를 사용하여 살균합니다.
    3. 1.9(CaCl2 ~ thrombin)의 최종 비율을 얻기 위해, 혈전을 포함하는 원색 튜브에 10% CaCl2 용액의 1.1mL을 전송한다.
      참고: 실험에서 사용할 볼륨에서 크로스링커 솔루션을 준비하여 저장을 피합니다.

6. 압출 기반 바이오 프린터를 사용하여 생체 인쇄 성상 세포가 함유 된 바이오 잉크

  1. 신경 조직의 설계
    1. G-코드 사용: X축과 Y축의 각 생체 인쇄 선 사이의 거리 가 1mm, Z축(각 선 간 0.2mm)의 6층으로 6x 6mm(제곱 된 모양)의 그리드를 구성합니다. 압출(E)을 0.01 mm로 설정하고 Z축의 각 새 레이어에서 0.001mm를 증가시면 됩니다. 인쇄 속도(F)를 400mm/min(보충정보)으로설정합니다.
  2. 바이오 프린터 설정
    1. 15분 동안 UV 광에 기기를 노출한 다음 에탄올 70%로 닦아냅니다.
    2. 전원 스위치를 사용하여 바이오 프린터를 켭니다. USB 케이블을 통해 컴퓨터에 컴퓨터를 연결합니다. 제어 소프트웨어를 열어 바이오 프린터에 연결하고 파일 디자인을 로드합니다.
  3. 바이오 프린팅 주사기 의 준비
    1. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 성상 세포가 함유된 젤라틴/GelMA/fibrinogen 바이오잉크를 5mL 플라스틱 주사기로 옮킨다.
      참고: 거품 형성을 피하기 위해 천천히 이동합니다.
    2. 멸균 22 G 무딘 바늘을 주사기에 연결합니다.
      참고: 주사기를 4°C에서 2분 동안 그대로 둡니다.
    3. 주사기를 바이오 프린터 인쇄헤드에 연결하고 생체 잉크를 수동으로 플러시하여 나머지 거품을 제거합니다.
  4. 바이오 프린팅
    참고: 바이오프린팅은 라미나르 후드 외부에서 수행되었습니다.
    1. 35mm 배양 접시를 바이오 프린터 테이블에 놓고 바늘을 움직일 수 있도록 배양 접시 표면에서 0.1 mm 떨어진 곳에 바늘을 배치합니다.
      참고: 각 바이오 프린팅에 대해 35mm 배양 접시 하나를 사용하십시오.
    2. 인쇄 버튼을 누릅니다.
    3. 바이오 프린팅을 통해 주사기가 접시에서 멀리 이동있는지 확인하십시오. 그런 다음 문화 요리를 닫고 교차 연결 과정을 준비하십시오.
      참고: 한 구조물의 생체 인쇄는 약 1분 10초가 소요됩니다.
  5. 생체 인쇄 구조 와 문화를 교차 연결
    1. 컬처 디쉬를 2mW/cm2에 2 x 60s(위아래)에 올려놓습니다.
    2. 라미나르 의 흐름 하에서, 멸균 주걱을 사용하여 24웰 플레이트로 생체 인쇄 구조를 전송한다.
    3. 500 μL의 트롬빈/CaCl2 용액을 추가하고 30분 동안 방치하여 피브린 의 교차 연결을 허용합니다.
    4. 교차 연결 용액을 제거하고 PBS 1x의 2mL로 구조를 세척합니다. 이어서, PBS를 성상세포 배양 배지의 1mL로 대체하고 37°C 및 5% CO2에서배양한다. 3일마다 매체를 변경합니다.

7. 성상세포 생존가능성 평가

  1. 생체 인쇄 성상 세포의 생존력
    1. 주걱을 사용하여 35mm 배양 접시에 생체 인쇄 구조를 전송합니다.
    2. 1x PBS1mL로 컨스트럭쳐를 세척합니다.
    3. 라이브/데드 시약의 100μL를 구성 위에 보관하고 37°C에서 30분 동안 보관하여 빛으로부터 보호합니다.
    4. 라이브/데드 시약을 제거하고 1x PBS1mL로 구인을 세척합니다.
    5. 주걱을 이용하여 공초점 접시에 샘플을 전송하고, 이미지 획득을 위해 488 및 570 nm 여기를 사용하여 공초점 현미경하에서 구문 내의 세포를 관찰한다.
      참고: 구문 내의 셀의 전체 시각화에 10배율을 사용합니다.
    6. 샘플이 평평하게 앉아 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 평탄도를 높이기 위해 샘플 위에 덮개 슬립을 놓습니다.
      참고: 이미징 중에 시료가 건조되는 것을 방지하기 위해 공초점 요리가 잘 밀봉되었는지 확인합니다.
    7. 계산 소프트웨어를 사용하여 실행 가능한(녹색) 및 죽은(빨간색) 수를 계산합니다.
  2. 2D 성상세포 문화의 생존가능성
    1. 35mm 공초점 접시에 0.5 x 106 성상세포 (통로 1-3)를 넣고 성상 세포 매체를 추가하고 37 ° C 및 5 % CO2에서배양합니다.
    2. 세포가 컨실루블되면 배양 배지를 제거하고 1x PBS1mL로 세척하십시오.
    3. 라이브/데드 시약의 200 μL을 보관하고, 37°C에서 30분 동안 접시를 유지하여 빛으로부터 보호합니다.
    4. 라이브/데드 시약을 제거하고 1x PBS1mL로 셀을 세척합니다.
    5. 디지털 카메라와 결합 된 공초점 현미경으로 요리를 가져 와서 이미지 획득을 위해 488 및 570 nm 여기를 사용합니다.
    6. 계산 소프트웨어를 사용하여 실행 가능한(녹색) 및 죽은(빨간색) 수를 계산합니다.

8. 성상 세포의 면역 염색

  1. 3D 생체 인쇄 성상 세포의 글리아 세동 산 성 단백질 (GFAP) 염색
    참고: 다른 세포 마커의 존재를 조사하려면 1 차 항체를 그에 따라 변경하십시오.
    1. 우물에서 매체를 제거하고 3x PBS의 1mL로 구조를 세척합니다.
    2. PBS에 4% 파라포름데히드(PFA)를 추가하여 컨스가 완전히 덮여 4°C에서 2시간 동안 그대로 둡니다.
    3. PFA를 제거하고 3x PBS의 1mL로 구조를 세척합니다.
      참고: PBS의 4°C에 저장하면 이 절차를 몇 달 동안 일시 중지할 수 있습니다. PBS 증발을 피하기 위해 웰 플레이트가 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
    4. 글리신 0.1 mol/L로 샘플을 5분 동안 치료합니다.
    5. 5 분 동안 1 x PBS의 1 mL로 씻어.
    6. 0.1% 트리톤 X-100 및 10% FBS를 포함하는 PBS로 시료를 궤도 동요 하에서 25°C에서 1시간 동안 과미로 처리한다.
    7. 하룻밤 사이에 4°C에서 닭 항 GFAP(1차 항체 희석 1:500)로 구비한다.
    8. 1차 항체를 흡인시키고 5분 3회 PBS 1mL로 시료를 세척한다.
      참고: 1차 항체는 4°C에 저장될 때 여러 번 재사용할 수 있다.
    9. 알렉사 플루오 488-공주 항닭고기(이차 항체 희석 1:500) 및 1 μg/mL DAPI를 25°C에서 25°C로 배양한다.
      참고: 샘플이 빛으로부터 보호되는 상태로 유지합니다.
    10. 5 분, 3 시간 동안 PBS의 1 mL로 샘플을 세척합니다.
    11. 컨스트럭트를 35mm 공초점 접시로 옮는다.
      참고: 샘플이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시가 잘 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
  2. 2D 성상세포 배양의 글리아 피성 산성 단백질 (GFAP) 염색
    1. 35mm 공초점 접시에 0.5 x 106 성상세포 (통로 1-3)를 넣고 성상 세포 매체를 추가하고 37 ° C 및 5 % CO2에서배양합니다.
    2. 세포가 컨실수있을 때 배양 배지를 제거하고 1 x PBS의 1 mL로 세척하십시오.
    3. 8.1.2-8.1.10 단계를 반복합니다.
  3. 성상 세포 세포 골격 염색
    1. 8.1.1-8.1.6 단계를 반복합니다.
    2. PBS에 형광 공주 용액 50 μg/mL의 200 μL과 DAPI의 1 μg/mL을 컨스트럭트 위에 추가합니다.
    3. 궤도 교반 하에서 25°C에서 1시간 동안 배양하여 샘플이 빛으로부터 보호됩니다.
    4. 샘플을 PBS 1mL로 5분 3회 세척하고 주걱을 사용하여 공초점 요리로 시료를 옮김합니다.
      참고: 샘플이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시가 잘 밀봉되어 있는지 확인하십시오.

9. 공초점 이미징

  1. 영상을 위한 디지털 카메라(359, 488, 570 nm 흥분)와 함께 공초점 현미경으로 요리를 가져가십시오.
  2. 전체 시각화에 10배, 셀의 확대 이미지에 40또는 63배배율을 사용합니다.
    참고: 샘플이 평평하게 앉아 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 평탄도를 높이기 위해 샘플 위에 덮개 슬립을 놓습니다.

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결과

이 작품은 3D 바이오 프린팅 기술을 사용하여 층별 1차 성상세포-라덴 젤라틴/GelMA/fibrinogen bioink를 증착하는 것을 목표로 했습니다. 성상세포는 생생물성분에 첨가된 마우스새끼(도 1)의대뇌 피질으로부터 추출및 분리되어 살아있는 3D 구조의 생체 제작을 가능하게 하였다.

컴퓨터 지원 설계(CAD)는 G-code(보충파일)를1mm의 기공을 가진 정사각형 모양(0.6 x 0.6 mm)의 상호 연결된 프레임으로 개발되었으며, 영양분과 산소의 확산을 용이하게 하는 것을 목표로 하였다. 프레임은 6개의 레이어로 구성되어 모든 레이어에서 90°의 각도로 변경되었습니다(그림2A i). 설계 된 구조는 조직 조작을 허용 , 높은 약 5mm(그림 2A

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토론

3D 바이오프린팅 기술은 구조적으로 생리적으로뇌(23)를포함한 토착조직(22)과유사한 정제 된 구조의 엔지니어링을 허용하는 생체 제작 대안으로 부상했습니다. 신경과 같은 조직의 생체 제조는 CNS 11에영향을 미치는 많은 질병의 개발 및 치료와 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 중요한 도구인 체외 네이티브 미세 환경 모델링을 허용합니다. 신경 기능에서 신경교 세포의 중요한 역할로 인해, 피질 성상세포는 뇌발달(24),생체 분자 수송25,중성염 아웃growth26,뇌와 같은 조직 생체 제조14와같은 많은 연구에서 사용되어 왔다.

성상세포의 3D 배양공학을 위한 방...

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공개 사항

저자는 공개 할 충돌이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 상파울루 연구 재단 (FAPESP), 교부금 번호 2018/23039-3 및 2018/12605-8에 의해 지원되었다; 국가 과학 기술 개발 위원회 (CNPq), 465656/2014-5 및 309679/2018-4를 부여; 및 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES), 금융 코드 001.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3D 바이오 프린터3D 생명 공학 솔루션압출 기반 바이오 프린터
무딘 팁 집게Integra Miltex6--30뇌 해부를위한 집게 이전에 살균
된 소 혈청 알부민Sigma-Aldrich9048-46-8프로테아제 무료, 지방산 무료, 본질적으로 글로불린 무료
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
세포 배양 플라스크Fisher Scientific156340배양 플라스크 T25
세포 여과기Corning Incorporated352340세포 여과기 40 µ m
컨포칼 현미경라이카컨포칼 TCS SP8 현미경과 Olympus FluoView 300 컨포칼 시스템
코니컬 튜브Thermo Scientific339651, 33965215 mL 및 50 mL DAPI의 멸균 튜브
Abcamab224589DAPI 염색 용액
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco의 Mod. L-글루타민 다이알리시스 튜빙을 사용한 Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix)
Sigma-AldrichD9527분자량 컷오프 = 14 kDa
에탄올Fisher Scientific64-15-5시약 등급
소 태아 혈청Gibco; Life Technologies Corporation12657011연구 등급
피브리노겐시그마-알드리치9001-32-5소 플라즈마의 피브리노겐 크리스탈린 분말
젤라틴시그마-알드리치9000-70-8돼지 껍질의 젤라틴 분말
글리신시그마-알드리치56-40-6글리신 분말
행크 완충염 용액(HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드
없음 L-글루타민시그마-알드리치56-85-9L-글루타민 결정성 분말
라미닌시그마-알드리치114956-81-950mM 트리스-HCl
라이브 데드 키트 세포 이미징 키트Thermo ScientificR37601살아있는 세포의 녹색 형광(ex/em 488 nm/515 nm). 죽은 세포의 적색 형광(ex/em 570 nm/602 nm)
메타크릴 무수물Sigma-Aldrich760-93-0GelMA 준비용
마이크로튜브Corning IncorporatedMCT-150-C1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
바늘 22GFisher ScientificNC1362045멸균 무딘 바늘
작동 가위Integra Miltex05--02이전에 살균된 뇌 박리용 날카로운 가위
파라포름알데히드시그마-알드리치30525-89-4파라포름알데히드 분말
페니실린/스트렙토마이신Gibco; Life Technologies Corporation15070063펜 스트렙 (5,000 단위/mL 페니실린, 5,000 ug/mL 스트렙토마이신)
페트리 접시Corning Incorporated430591, 43058835 및 100 mm
팔로이딘Abcamab176753iFluor 488 시약
광개시Sigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2- 메틸프로피오페논
인산염 완충액 식염수(PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023 PBS 1 x, 배양 등급, 칼슘 없음, 마그네슘 없음
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobodyAbcamab4674Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-chicken
주걱MiltexV973-70Number 24 시멘트 주걱 이전에 멸균
된 실체 현미경Fisherbrand3000038뇌 해부
현미경 주사기 5 mLBD1222C84멸균 주사기
주사기 필터 2 µ mFisher Scientific09-740-105살균용 폴리프로필렌 필터
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4소 플라즈마의 트롬빈 크리스탈린 분말
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1실험실 등급
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsin no phenol red 1 x PBS
Versene 용액Gibco에 희석; Life Technologies CorporationPBS1리터당 0.2g EDTA(Na4)로 제조된 15040066 Versene Solution(0.48mM)
Thermo Scientific144530멸균 24웰 플레이트
, 의 멸균 페트리 접시 제 용 웰 플레이트

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