여기서 우리는 중추 신경계에 있는 성상세포의 기능 및 신경질 세포와 관련시키는 기계장치를 연구하기 위하여 신경같이 조직을 biofabricating을 위한 3D 생물 인쇄 murine 피질 성상 세포의 방법을 보고합니다.
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이 논문에서
요약
초록
성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 필수적인 역할을하는 신경 교세포이며 신경 지원 및 기능을 포함합니다. 이 세포는 또한 신경 상해에 반응하고 퇴행성 사건에서 조직을 보호하기 위하여 행동합니다. 성상 세포 '기능의 체외 연구에서 이러한 이벤트에 관련 된 메커니즘을 해명 하 고 신경 장애를 치료 하는 치료 개발에 기여 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜은 3D 바이오프린팅 성상세포-라덴 바이오잉크에 의해 성상세포가 풍부한 신경과 같은 조직 구조를 바이오패브릭화하는 방법을 설명합니다. 압출 기반 3D 바이오 프린터는이 작업에 사용되었고, 성상 세포는 C57Bl/6 마우스 새끼의 뇌 코르티체에서 추출되었다. 바이오잉크는 3번 통로까지 피질 성상세포를 젤라틴, 젤라틴-메타크라이로일(GelMA), 피브리노겐으로 구성된 생체재료 용액에 혼합하여 최적의 생체 인쇄 조건을 제시하였다. 3D 바이오프린팅 조건은 세포 스트레스를 최소화하여, 74.08%± 세포가 생체 인쇄 직후 실행 가능했던 공정 중 성상세포의 높은 생존가능성에 기여했습니다. 인큐베이션 1주 후, 성상세포의 생존가능성은 3.00%± 83.54%로 크게 증가하여 3D 구조가 세포 성장에 적합한 미세환경을 나타낸다는 것을 나타낸다. 생체 물질 조성은 세포 부착을 허용하고 성상체 행동을 자극, 세포는 특정 성상 세포 마커 신경교 세동 산성 단백질을 표현 (GFAP) 전형적인 성상체 형태를 소유. 이 재현 가능한 프로토콜은 세포의 기본 미세 환경과 유사한 성상 세포가 풍부한 3D 신경과 유사한 조직을 생체 제작하는 귀중한 방법을 제공하며, 성상세포기능및 신경질환과 관련된 메커니즘과의 관계를 이해하는 것을 목표로 하는 연구자들에게 유용합니다.
서론
성상 세포는 중추 신경계에서 가장 풍부한 세포 유형 (CNS) 뇌 항상성에 중요한 역할을한다. 지속적인 신경 지원 이외에, 성상 세포는 신경 전달 물질 섭취량을 조절에 대 한 책임, 혈액-뇌 장벽 무결성유지,신경 시 냅 토 발생1,2조절. 성상 세포는 또한 CNS 염증에 필수적인 역할을, 점성 반응 성 반응성 점성구체3,4로이어지는 과정에서 뇌에 부상에반응,퇴행성 에이전트에 건강한 조직 박람회를 방지하는 신경교 흉터를 형성5. 이 이벤트는 성상세포의 유전자 발현, 형태학 및 기능6,7의변화를 초래한다. 따라서, 성상 세포 ' 기능을 관련 된 연구는 신경 질환을 치료 하는 치료의 개발에 대 한 도움이 됩니다.
체외 모델은 신경 상해와 관련된 메커니즘을 연구하는 데 매우 중요하며, 피질 성상세포의 성공적인 격리 및 2차원 (2D) 문화가 확립되었지만
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프로토콜
동물과 관련된 모든 절차는 연구 (http://www.iclas.org)에서 동물 사용에 대한 국제 지침을 따랐으며 대학 연방 드 상파울루 (CEUA 2019 / 9292090519)의 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 마우스 뇌 해부
- 차가운 행크스 버퍼드 솔트 솔루션(HBSS)을 100mm 배양 접시에 10mL, 1mL을 1.5mL 마이크로튜브로 옮춥니다. 동물당 마이크로튜브 1개를 준비합니다.
참고: 문화 접시와 마이크로튜브는 모두 얼음 위에 보관해야 합니다. - DMEM F12 + 10% 태아 소 혈청(FBS), 2% 글루타민, 1% 페니실린-연쇄절제술(P/S)을 사용하여 성상세포 배양 배지를 준비한다. 0.2 μm 필터를 사용하여 필터링하여 매체를 살균합니다.
- C57Bl/6 마우스 새끼 (산후 일 1) 날카로운 작동 가위를 사용하여 참수하여 안락사. 집게를 사용하여 피부를 당기고 두개골을 노출시하십시오. 가위와 집게를 70% 에탄올로 살균할 수 있도록 하십시오.
- 날카로운 곡선 팁 가위를 사용하여 두개골을 머리 꼭대기로 잘라냅니다.
참고: 뇌조직이 손상되지 않았는지 확인하십시오. - 이전에 에탄올 70%로 살균된 주걱을 사용하여 두개골 ....
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결과
이 작품은 3D 바이오 프린팅 기술을 사용하여 층별 1차 성상세포-라덴 젤라틴/GelMA/fibrinogen bioink를 증착하는 것을 목표로 했습니다. 성상세포는 생생물성분에 첨가된 마우스새끼(도 1)의대뇌 피질으로부터 추출및 분리되어 살아있는 3D 구조의 생체 제작을 가능하게 하였다.
컴퓨터 지원 설계(CAD)는 G-code(보충파일)를1mm의 기공을 가진 정사각형 모양(0.6 x 0.6 mm)의 상호 연결된 프레임으로 개발되었으며, 영양분과 산소의 확산을 용이하게 하는 것을 목표로 하였다. 프레임은 6개의 레이어로 구성되어 모든 레이어에서 90°의 각도로 변경되었습니다(그림2A i). 설계 된 구조는 조직 조작을 허용 , 높은 약 5mm(그림 2A
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토론
3D 바이오프린팅 기술은 구조적으로 생리적으로뇌(23)를포함한 토착조직(22)과유사한 정제 된 구조의 엔지니어링을 허용하는 생체 제작 대안으로 부상했습니다. 신경과 같은 조직의 생체 제조는 CNS 11에영향을 미치는 많은 질병의 개발 및 치료와 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 중요한 도구인 체외 네이티브 미세 환경 모델링을 허용합니다. 신경 기능에서 신경교 세포의 중요한 역할로 인해, 피질 성상세포는 뇌발달(24),생체 분자 수송25,중성염 아웃growth26,뇌와 같은 조직 생체 제조14와같은 많은 연구에서 사용되어 왔다.
성상세포의 3D 배양공학을 위한 방.......
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공개 사항
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 상파울루 연구 재단 (FAPESP), 교부금 번호 2018/23039-3 및 2018/12605-8에 의해 지원되었다; 국가 과학 기술 개발 위원회 (CNPq), 465656/2014-5 및 309679/2018-4를 부여; 및 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES), 금융 코드 001.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3D 바이오 프린터 | 3D 생명 공학 솔루션 | 압출 기반 바이오 프린터 | |
| 무딘 팁 집게 | Integra Miltex | 6--30 | 뇌 해부를위한 집게 이전에 살균 |
| 된 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | 프로테아제 무료, 지방산 무료, 본질적으로 글로불린 무료 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| 세포 배양 플라스크 | Fisher Scientific | 156340 | 배양 플라스크 T25 |
| 세포 여과기 | Corning Incorporated | 352340 | 세포 여과기 40 µ m |
| 컨포칼 현미경 | 라이카 | 컨포칼 TCS SP8 현미경과 Olympus FluoView 300 컨포칼 시스템 | |
| 코니컬 튜브 | Thermo Scientific | 339651, 339652 | 15 mL 및 50 mL DAPI의 멸균 튜브 |
| Abcam | ab224589 | DAPI 염색 용액 | |
| DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco의 Mod. L-글루타민 다이알리시스 튜빙을 사용한 Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) |
| Sigma-Aldrich | D9527 | 분자량 컷오프 = 14 kDa | |
| 에탄올 | Fisher Scientific | 64-15-5 | 시약 등급 |
| 소 태아 혈청 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | 연구 등급 |
| 피브리노겐 | 시그마-알드리치 | 9001-32-5 | 소 플라즈마의 피브리노겐 크리스탈린 분말 |
| 젤라틴 | 시그마-알드리치 | 9000-70-8 | 돼지 껍질의 젤라틴 분말 |
| 글리신 | 시그마-알드리치 | 56-40-6 | 글리신 분말 |
| 행크 완충염 용액(HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 | |
| 없음 L-글루타민 | 시그마-알드리치 | 56-85-9 | L-글루타민 결정성 분말 |
| 라미닌 | 시그마-알드리치 | 114956-81-9 | 50mM 트리스-HCl |
| 라이브 데드 키트 세포 이미징 키트 | Thermo Scientific | R37601 | 살아있는 세포의 녹색 형광(ex/em 488 nm/515 nm). 죽은 세포의 적색 형광(ex/em 570 nm/602 nm) |
| 메타크릴 무수물 | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | GelMA 준비용 |
| 마이크로튜브 | Corning Incorporated | MCT-150-C | 1,5 mL |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 바늘 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | 멸균 무딘 바늘 |
| 작동 가위 | Integra Miltex | 05--02 | 이전에 살균된 뇌 박리용 날카로운 가위 |
| 파라포름알데히드 | 시그마-알드리치 | 30525-89-4 | 파라포름알데히드 분말 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | 펜 스트렙 (5,000 단위/mL 페니실린, 5,000 ug/mL 스트렙토마이신) |
| 페트리 접시 | Corning Incorporated | 430591, 430588 | 35 및 100 mm |
| 팔로이딘 | Abcam | ab176753 | iFluor 488 시약 |
| 광개시 | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2- 메틸프로피오페논 |
| 인산염 완충액 식염수(PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 PBS 1 x, 배양 등급, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
| Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
| Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
| 주걱 | Miltex | V973-70 | Number 24 시멘트 주걱 이전에 멸균 |
| 된 실체 현미경 | Fisherbrand | 3000038 | 뇌 해부 |
| 현미경 주사기 5 mL | BD | 1222C84 | 멸균 주사기 |
| 주사기 필터 2 µ m | Fisher Scientific | 09-740-105 | 살균용 폴리프로필렌 필터 |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002--04-4 | 소 플라즈마의 트롬빈 크리스탈린 분말 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | 실험실 등급 |
| Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x PBS |
| Versene 용액 | Gibco에 희석; Life Technologies Corporation | PBS | 1리터당 0.2g EDTA(Na4)로 제조된 15040066 Versene Solution(0.48mM) |
| Thermo Scientific | 144530 | 멸균 24웰 플레이트 |
참고문헌
- Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114(2019).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7
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