상세한 단계별 프로토콜은 다성 성 O9-1 신경 문장 세포및 다양한 강성의 폴리 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 시험관 내 기계적 신호를 연구하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.
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방법 논문
신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경 문장 세포 (NCC)는 다양한 장기와 조직을 초래하는 세포 모형의 넓은 배열로 이동하고 분화할 수 있는 척추동물 배아 다능성 세포입니다. 조직 강성은 NCC 분화에서 중요한 역할을 하는 물리적 인 단서인 기계적 힘을 생성합니다. 그러나 메커니즘은 불분명합니다. 여기에 설명된 방법은 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 최적화된 생성, 이러한 강성의 정확한 측정, 그리고 생체 내 를 모방하는 NCC 라인인 O9-1 셀에서 기계적 신호의 영향 평가를 위한 상세한 정보를 제공한다.
하이드로겔 강성은 원자력 현미경검사(AFM)를 사용하여 측정되었으며 그에 따라 상이한 강성 수준을 나타냈다. 다양한 강성의 하이드로겔에 배양된 O9-1 NcC는 기계적 신호 변화로 인한 다양한 생물학적 효과를 나타내는 스트레스 섬유의 세포 형태와 유전자 발현을 상이하게 나타냈다. 더욱이, 하이드로겔 강성을 변화시켜 젤 강성을 변경하고 NcC의 분자 및 유전적 규제를 분석함으로써 기계적 신호를 조작하는 효율적인 체외 계통이 발생한다는 것을 확립했습니다. O9-1 NcC는 해당 분화 매체의 영향으로 광범위한 세포 유형으로 분화할 수 있으며, 생체 내에서화학 신호를 조작하는 것이 편리하다. 따라서, 이 체외 시스템은 NNC에서 기계 신호의 역할과 화학 신호와의 상호 작용을 연구하는 강력한 도구이며, 이는 연구원이 신경 문장 발달 및 질병의 분자 및 유전 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이됩니다.
서론
신경 문장 세포 (NCC)는 다양한 장기및 조직의 개발에 기여하고 마이그레이션하고 기여하는 놀라운 능력을 가진 척추 동물 배아 발생 시 줄기 세포의 그룹입니다. NCC는 감각 뉴런, 연골, 뼈, 멜라닌세포 및 원활한 근육 세포를 포함한 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있으며, 축 기원의 위치와 NCC1,2의 국소 환경 지침에 따라 분화할 수있다. 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력으로, 신경 문장(NC) 발달단계에서 난독증을 유발하는 유전적 이상이 수많은 선천성 질환으로 이어질 수있다 2. 예를 들어, NcC의 형성, 이동 및 발달 중 의 혼란은 신경근증증1,3로통칭되는 발달 장애로 이어진다. 이러한 질병은 트리처 콜린스 증후군과 같은 NCC 형성의 실패로 인한 두개골 면결에서 부터 흑색종3,4,5,6에서볼 수 있듯이 NCC 전이성 철새 능력으로 인한....
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프로토콜
1. 하이드로겔 준비
참고: 모든 단계는 멸균을 유지하기 위해 사용하기 전에 에탄올과 자외선(UV)에 소독된 세포 배양 후드에서 수행해야 합니다. 핀셋과 파이펫과 같은 도구는 에탄올로 분사되어야 합니다. 버퍼 솔루션도 멸균 필터링되어야 합니다.
- 아미노살란 코팅 유리 커버립의 준비
- 원하는 수의 유리 커버립을 실험실 닦아 조각에 놓습니다.
참고: 3-4 커버립을 추가로 준비하여 쉽게 파손될 때 충분한 백업 소모품을 보장합니다. 유리 커버의 다른 재료는 세포 시딩과 부착의 다른 호환성을 얻을 것이다. 실험을 시작하기 전에 실험에 가장 적합한 유형을 결정하는 것이 좋습니다(재료 표참조). - 알코올 버너 또는 분젠 버너를 사용하여 불꽃을 앞뒤로 통과하여 각 커버슬립을 살균하십시오(단백질 분석 실험용 30s). 각 유리 커버슬립을 실험실 닦아에 놓아 식힙니다.
- 유리 커버를 식히면 파막이 늘어선 페트리 접시에 옮겨 미끄러짐을 방지합니다.
참고: 커버립이 충분히 식지 않으면 잔류 열이 파라필름을 슬립에 녹여 사용할 수 없게 됩니다. - 커버립은 각각 약 200 μL 및 800 μL및 0.1 M NaOH800 μL로 커버하여 각각 1....
- 원하는 수의 유리 커버립을 실험실 닦아 조각에 놓습니다.
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결과
AFM 및 Hertz 모델을 통한 하이드로겔 제제 및 강성 평가
여기서, 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드의 비율을 조절함으로써 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 생성하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다. 그러나, 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 ECM 단백질의 부족으로 인한 세포의 접착을 위한 준비가 되어 있지 않다. 따라서, 설포-SANPAH는, 링커로서 작용하는, 하이드로겔에 동적으로 결합하고 UV 활성화 후 설포-산파H에서 N-하이드록시슈니미드 에스테르를 통해 하이드로겔의 표면에 ECM 단백질의 접착을 허용하기 위해 ECM 단백질의 1차 아민과 반응한다. 콜라겐 타입 I는 O9-1 세포 부착을 효과적으로 촉진하기 위해 선택한 ECM 단백질로 사용되었습니다. 다양한 하이드로겔의 정확한 강성 값을 보장하기 위해 탄성 계수를 묘사하는 잘 알려진 기술인 AFM을 사용하여 강성 평가를 수행했습니다.
유리 커버슬립에 폴리아크릴.......
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토론
현재 연구의 목표는 NNC에서 기계적 신호의 영향을 더 잘 이해하기 위해 효과적이고 효율적인 체외 시스템을 제공하는 것입니다. 위에서 언급한 단계별 프로토콜을 따르는 것 외에도, 연구자들은 O9-1 NcC의 세포 배양이 하이드로겔을 준비하는 데 사용되는 유리 커버립의 유형에 의해 영향을 받는다는 것을 명심해야 합니다. 예를 들어, 특정 유형의 유리 커버슬립(재료 표 참조)에 시드된 세포가 생존하고 잘 확산되는 반면, 다른 유형의유리 커버립에 시드된 배양 세포가 더 많은 세포 사명을 보였다는 점에 주목했습니다. 더욱이, O9-1 NCC38에대한 정확한 세포 배양 조건을 엄격히 따르는 것이 중요하다. 하이드로겔을 가능한 한 빨리 사용하거나 멸균 37°C 인큐베이터에 최대 2일 동안 저장될 때 세포 배양의 품질이 최적입니다.
프로토콜의 각 구성 요소의 감도로 인해 탄성 모둘리는 실험마다 다를 수 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는 이 프로젝트에서 AFM에 기여한 전문 지식을 위해 텍사스 대학 건강 과학 센터의 원자력 현미경-UT 코어 시설의 운영자인 아나 마리아 자스케 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 건강의 국가 학회 (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704, 및 R01HL142704에서 J. Wang)의 자금 출처에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% 비스-아크릴아미드 | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24웰 플레이트 | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4웰 세포 배양 플레이트 | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% 파라포름알데히드 | 시그마 알드리치 | J61899-AP | |
| 40% 아크릴아미드 | 시그마 알드리치 | A4058 | |
| 50% 글루타르알데히드 | 시그마 알드리치 | G7651 | |
| 6웰 세포 배양 플레이트 | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM 캔틸레버 (구형 비드) | Novascan | ||
| AFM 소프트웨어 | 촉매 나노 스코프 | 모델 : 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| 과황산 암모늄 (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | 분말 |
| 안티 AP-2 α 항체 | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin 항체 | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 디클로로메틸실란(DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| 형광 현미경 | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting 매체 | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | 시그마 Aldrich | H3375 | 분말 |
| 호스 세럼 | Corning | 35-030-CI | |
| iScript 역전사 Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 항생제 | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy 마이크로 키트 | Qiagen | 74004 | |
| 멸균 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| 멸균 탈이온수 | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| 트윈 20 | 시그마 알드리치 | P9416 |
참고문헌
- Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
- Liu, J. A., Cheung, M.
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재인쇄 및 허가
