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방법 논문

간 재생 전략으로 3차원 콜라겐 매트릭스 스캐폴드 이식

3K 조회수

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DOI:

10.3791/62697

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2021년 6월 29일

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1Liver, Pancreas and Motility Laboratory; Unit of Experimental Medicine; School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Department of Surgery, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 3Department of Cells and Tissue Biology, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 4Department of Pathology, Hospital General de Mexico, 5Materials Research Institute, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

이 논문에서

요약

간 질환은 섬유증이나 간경변증을 촉진하는 많은 원인에 의해 유도됩니다. 이식은 건강을 회복하기위한 유일한 옵션입니다. 그러나 이식 가능한 장기의 희소성을 감안할 때 대안을 모색해야합니다. 우리의 연구는 동물 모델에서 간 조직에 콜라겐 비계의 이식을 제안한다.

초록

간 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인입니다. 과도한 알콜 소비, 고지방 규정식 및 C형 간염 바이러스 감염은 섬유증, 간경변 및/또는 간세포 암종을 승진시합니다. 간 이식은 고급 질병 단계에서 환자의 수명을 개선하고 연장하기 위해 임상적으로 권장되는 절차입니다. 그러나 이식의 10%만이 장기 가용성, 외과 전 및 수술 후 수술 및 높은 비용과 직접 상관 관계가 있습니다. 세포 외 매트릭스 (ECM) 비계조직 복원을위한 대안으로 등장했다. 생체 적합성 및 접목 수용은 이러한 생체 재료의 주요 유익한 특성입니다. 간 의 크기와 정확한 기능을 복원하는 능력은 간 간 절제술 모델에서 평가되었지만, 스캐폴드 또는 멸종 된 간 질량의 부피를 대체하기 위한 일종의 지원의 사용은 평가되지 않았습니다.

부분 적인 간 절제술은 소 콘딜로부터 콜라겐 매트릭스 스캐폴드 (CMS)의 이노 삽입을 가진 쥐 간에서 수행되었다. 좌간 엽 조직을 제거 (약 40%), CMS의 동등한 비율은 수술로 이식되었다. 간 기능 테스트는 외과 수술 전후에 평가되었다. 3일, 14일, 21일 후, 동물들은 안락사되었고, 거시적 및 점학적 평가를 수행했다. 3일과 14일에, 지방 조직은 21일째에 혈관 신형성 및 CMS 재흡수와 같이 거부 또는 감염의 임상적인 증거가 없는 CMS를 둘러싸고 관찰되었습니다. CMS에 인접한 세포의 사소한 염증 과정 및 이동의 히스토릭 증거가 있었다, 헤마톡시린과 eosin으로 관찰 (H&E) 및 마슨의 삼색 얼룩. CMS는 간 조직에서 잘 수행 하 고 조직 재생 및 만성 간 질환에서 복구를 공부 하기 위한 유용한 대안 이 될 수 있습니다.

서론

간은 항상성 및 단백질 생산1을유지하는 데 관여하는 가장 중요한 기관 중 하나입니다. 불행히도, 간 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인입니다. 간경변과 간세포 암종을 포함하는 간 손상의 고급 단계에서 간 이식은 임상적으로 권장되는 절차입니다. 그러나, 기증자의 희소성과 성공적인 이식의 낮은 비율로 인해 조직 공학 (TE) 및 재생 의학 (RM)에 있는 새로운 기술이2,3개발되었습니다.

TE는 염증, 섬유성 및 부종 장기 및 조직의 복원을 촉진하기 위해 줄기 세포, 비계 및 성장 인자4의 사용을포함1,5,6. 스캐폴드에 사용되는 생체 재료는 기본 ECM을 모방하여 유도 된 세포 리모델링7에대한 물리적, 화학적 및 생물학적 단서를 제공합니다. 콜라겐은 진피, 힘줄, 장 및 구심8,9로부터얻은 가장 풍부한 단백질 중 하나입니다. 더욱이, 콜라겐은 바이오프린팅 또는 전기방사(10,11)을통해 2차원 및 3차원 스캐폴드를 생성하는 바이오 폴리머로서 수득될 수 있다. 이 그룹은 간 조직의 재생을 위한 뼈 근원에서 콜라겐의 사용을 보고하는 첫번째입니다. 또 다른 연구는 소 콜라겐에서 합성 된 비계의 사용을보고, 이는 피부에서 얻은, 균질적이고 밀접하게 위치 모공을, 그들 사이의 통신없이12.

탈세포화는 네이티브 ECM을 보존하여 줄기 세포 전위13,14를가진 세포의 후속 편입을 허용한다. 그러나, 이 절차는 마우스, 쥐, 토끼, 돼지, 양, 가축 및 말3,14에서간, 심장, 신장, 소장 및 오줌 방광에 있는 실험 단계에 아직도 있습니다. 현재, 절제된 간 질량 량은 동물 간 절제술 모델 중 어느 모델에서도 대체되지 않는다. 그러나, 세포 증식 및 혈관 신생을 가능하게 하는 추가 지원 또는 네트워크(생체 재료)의 사용은 간 완구기능의 신속한 복원을 위해 필수적일 수 있었다. 따라서, 스캐폴드는 만성 간 질환에서 조직을 재생하거나 복구하는 대체 접근법으로 사용될 수 있으며, 차례로 간 이식의 기증 및 임상 합병증으로 인한 제한을 제거합니다.

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프로토콜

본 연구는 유니버시다드 나시오날 오토노마 데 멕시코(UNAM)와 멕시코 병원 총독(CI/314/15)의 윤리위원회(DI/115/2015)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 이 기관은 실험실 동물의 생산, 관리 및 사용에 대한 모든 기술 사양을 충족하며 국가 법 (NOM-062-ZOO-1999)에 의해 합법적으로 인증됩니다. 이 연구를 위해 150-250g(6-8주 된) 수컷 위스타 쥐는 UNAM 의과 대학의 실험실 동물 시설에서 수득되었다.

1. 소 대퇴골에서 콜라겐 매트릭스 비계 를 얻기

  1. 멕시코의 보건 및 농업 당국에 의해 인증 된 도살장에서 소 대퇴골에서 condyle을 가져옵니다.
    1. 정결 지방, 근육 및 연골을 외과 기기로 조심스럽게 해부합니다. 콘딜 조각을 톱 커터를 사용하여 3cm x3cm 조각으로 자르고 수건으로 지방과 혈액을 청소하십시오. 콘딜 조각을 물로 씻으시다.
    2. 30분 동안 애니오닉 세제(10g/L)의 1L로 조각을 끓입니다(92°C). 콘딜 조각을 두 번 세척하여 음이온 세제의 잔재를 제거하십시오.
    3. 필터 용지(0.5mm)를 사용하여 콘딜 조각을 3시간 동안 건조시다.
  2. 1.1단계(도1A)에언급된 조각으로부터 0.5cm의 삼각형(1cm x1cm x1cm)의 CMS를 준비한다.
    1. 일정한 동요로 10 분 동안 0.5 M HCl의 100 mL에서 조각을 탈염. HCl을 제거합니다.
      참고: 수산화나트륨(10M)으로 HCl을 중화한다.
    2. 조각조각을 증류수 100mL, 매번 15분씩 일정한 동요로 세 번 헹구는 다. 1 시간 동안 필터 용지 (0.5mm)로 CMS를 건조시다.
    3. 스테레오현미경(15)을 사용하여 CMS(모공 의 크기, 모공 형성 및 다공성 상호 연결)의 구조적 특성을 분석한다(도1B).
    4. CMS trabeculae(도 1C)의거친 표면을 분석하기 위해 스캐닝 전자현미경(16)을 사용합니다.
    5. CMS(도1D)의기계적 변화(가소성 및 유연성)를 평가하기 위해 해부 계측기를 사용하여 블렌딩 및 스트레칭을 한다.
    6. CMS를 살균 파우치에 넣고 과산화수소 플라즈마로 38분 간 살균합니다. 멸균 CMS를 원래 팩에 20-25°C의 건조 부위에 보관하여 사용까지 보관하십시오.

2. 수술 부위의 준비 및 동물 모델의 취급 및 준비

  1. 수술 부위, 작업성, 미세 수술 현미경 및 시트를 2% 클로르헨시딘 용액으로 소독합니다. 열 살균을 통해 모든 수술 기구, 수술 용 스폰지, 면봉 및 일회용 수술 커튼을 살균 (121 ° C / 30 분 / 100 kPa)
  2. 개쥐(n=5)를 그룹당 5마리의 쥐로 3개 그룹으로 할당합니다: 1. sham, 2. hepatectomy 및 3. hepatectomy 플러스 CMS, 그리고 일 3, 14 및 21 일에 모든 그룹을 따릅니다.
    1. 케타민 (35 mg/kg) 및 자일라진 (2.5 mg/kg) 뒷사지에 근육질 관리.
      참고: 진정제 기간은 일반적으로 30-40분 동안 지속됩니다.
    2. 수술용 비누와 양날 블레이드를 사용하여 복부 피부(5cm x 2cm)를 면도하고, 국소 10% 포비도요오드 용액을3라운드 17번으로사용하여 피부를 소독한다.
    3. 투과성 기도를 유지하기 위해 목을 과도하게 확장한 데큐비투스 등쪽 위치에 따뜻한 접시에 동물을 놓습니다(그림2).
    4. 호흡 패턴과 사지의 철수 반사의 손실을 통해 마취의 깊이를 평가합니다.
    5. 면도된 피부 주위에 일회용 수술 커튼을 놓고 메스가 있는 알부스 라인에 절개(2.5cm)를 만들어 시포이드 공정을 기준점으로 사용한다. 출혈을 방지하기 위해 복부 벽 혈관을 피하십시오.
    6. 복부 리트랙터를 제자리에 놓고 복강을 관찰하십시오. 해부 집게를 사용하여 왼쪽 간 엽을 추출하여 금속 판에 놓습니다(도3A).
      참고 : 가짜 그룹에서, 단지 왼쪽 간 엽을 추출한 다음 복강에 간을 반환합니다. 3-0 나일론 봉합사복벽과 피부를 봉합합니다.
    7. CMS가 없는 실험 군에서는 메스 블레이드와 멸균 메스 블레이드(#15)를 사용하여 두 컷으로 간 절제술(약 40%)을 수행합니다. 삼각형 금속 템플릿(1cm x 1cm x 1cm)을 사용하여 간절제술(도 3B)을수행합니다.
    8. 간 출혈을 방지하기 위해 간 가장자리에 면봉으로 수술 압축을 5 분 동안 유지하십시오.
    9. 수술 전에 20 분 동안 멸균 식염수 용액으로 CMS를 수분하십시오. 간 조직과 CMS 사이에 4개의 바늘 봉합사를 사용하여 간 절제술 부위에 CMS를 이식하여 생체 재료의 변위를 방지합니다. 7-0 흡수성 폴리프로필렌 봉합사(도3C)를사용하십시오.
      참고: 두 번째 수술에서 봉합사를 제거하지 마십시오. 봉합사는 CMS 이식 부위를 식별하는 참조로 사용할 수 있습니다.
    10. 간을 복강으로 되돌리고 3-0 나일론 봉합사로 복벽과 피부를 봉합합니다. 수술요오드에 젖은 스폰지로 수술 절개를 두 라운드로 청소하십시오. 동물의 활력 징후를 관찰하고 모니터링합니다.

3. 수술 후 치료

  1. 메글루민 플루신을 관리 (2.5 mg/kg) 뒷다리에 근육질. 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받은 진통을 관리한다.
  2. 마취 복구를 위해, 온도 조절 (23 °C)이있는 소음없는 지역에 실험실 동물 침구가있는 개별 폴리 카보네이트 상자에 동물을 놓습니다.
  3. 동물의 회복을 관찰하고 2 시간 동안 물과 음식 소비를 모니터링하십시오. 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수술 후 동물을 모니터링합니다.

4. 혈청에서 간 기능의 평가

  1. 수술 전 마취동물의 측면 꼬리 정맥(500 μL)과 평가일 3, 14 및 21에서 혈액 샘플(500 μL)을 수집한다.
  2. 실온에서 850 × g/10분에서 혈액 샘플을 원심분리합니다(23°C); 세럼을 분리하고 사용할 때까지 -80 °C에 보관하십시오.
  3. 간 기능 테스트의 패널수행: 혈청 알부민 (ALB), 알칼리 인스파타제 (ALP), 알라닌 아미노 트랜스퍼라제 (ALT), 아스파르타테 아미노 트랜스퍼라제 (AST), 총 빌리루빈 (TB), 직접 빌리루빈 (DB)(표 1).

5. 안락사 및 조직 관리

  1. 전술한 프로토콜을 따라 각 평가(일 3, 14 및 21일)에 대해 동물을 마취한다.
  2. 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 통해 안락사.
  3. 복강의 장기를 관찰하고 CMS의 유무에 관계없이 샴과 실험군의 간절제술 영역의 사진을 찍을 수 있도록 메스와 함께 알부 라인에 절개(5-6cm)를 수행한다.
  4. 간 샘플 (2cm x 2cm; 0.40-0.45 g) 모든 연구 그룹 동물에서 하 고 후속 조직 평가를 위한 24 시간 대 한 4% 포름알데히드 용액에 배치.

6. 조직학적 분석

  1. 간 조직을 4% 포름알데히드로 보존하고 일련의 알코올 농도(60%, 70%, 80%, 90%, 100%)를 사용하여 조직을 탈수합니다. 자일렌 (1h)에 배치하고 파라핀16에내장 .
  2. 8개의 슬라이드를 준비하기 위해 마이크로토메로 파라핀 블록을 4 μm 두께섹션으로 잘라냅니다.
  3. H&E와 마슨의 삼색 염색16을수행합니다.
  4. CMS의 유무에 관계없이 간의 대표적인 영역을 선택하기 위해 가벼운 현미경으로 얼룩진 부분을 관찰하십시오. 4배, 10배, 40배율로 포토마이크로그래프를 얻고 적절한소프트웨어(18)를 사용하여 이미지를 처리합니다(재료표참조).

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결과

뼈 탈염은 모공의 원래 모양이나 상호 연결을 변경하지 않고 CMS의 기계적 특성에 영향을미칩니다. CMS는 임의의 형상을 가질 수 있으며, 따라서 선택된 장기 또는조직(19)의크기 및 형상으로 조절될 수 있다. 본 프로토콜에서는 삼각형 CMS(도1A-D)를사용하였다. 쥐 모델은 간에서 CMS 제노임플란트의 재생 능력을 평가하기 위해 사용되었다. 간은 경화되고 연약한 기관이더라도, 이 프로토콜에서 수행된 외과 적 절차는 CMS가 제자리에 남아 있는지 확인했습니다(그림 2 및 도 3A-C). 왼쪽 엽의 40%의 부분 적인 간 절제술은 임플란트와 토착 p...

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토론

장기 이식은 간 섬유증 또는 간경변 환자에서 치료의 주류입니다. 몇몇 환자는 이 절차에서 유익합니다, 대기자 명단에 있는 환자를 위한 치료 대안을 제공하는 것을 필요하게 하는. 조직 공학은 재생 잠재력2,4,13을가진 발판 및 세포를 사용하는 유망한 전략입니다. 간 부분의 제거는 이 혈관화된 기관의 경질 출혈 때문에 이 절차에서 중요한 단계입니다. 따라서 수술용 침대의 혈안이 이러한 합병증을 방지하기 위해 수행해야 합니다. 더욱이, 조직-생체 물질 상호 작용을 보장하기 위해 필수적인 CMS에 간 조직의 결합은 봉합사의 사용을 통해 촉진됩니다. 그러나, 그것은 간 찢 고 나중에 출혈을 일으키는 것을 피하기 위해 신중 하 게 수행 해야 합니다.

본 원에 제안된 생체 물질은 소 기원(xenogenic)이지만, 쥐에 생체...

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공개 사항

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다. 벤자민 레온-만실라는 미타 드 닥터라도 엔 시엔시아스 바이오메디카, 유니버시다드 나시오날 아우토노마 데 멕시코(UNAM)의 박사 과정 학생으로, DGAPA-UNAM 펠로우십을 받았다.

감사의 글

저자는 실험 의학 단위의 실험실 동물 시설의 직원, 기술 및 외과 지원을위한 간호사 캐롤라이나 Baños G., 마이크로 사진지원을 위한 마르코 E. Gudiño Z. 및 간 조직학 지원을 위한 에릭 아포에게 감사를 표하고자 합니다. 국가위원회는과학기술(CONACyT),교부금 수 SALUD-2016-272579 및 PAPIIT-UNAM TA200515에 대한 연구를 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
음이온성 세제AlconoxZ273228
생검 카세트Leica3802453
Camera DMXNikonDXM1200F
CentrifugeEppendorf5424
클로르헥시딘 글루코네이트 4%BD372412
커버 안경 25 mm x 40 mmCorning2980-224
EosinSigma-Aldrich200-MCAS 17372-87-1
에틸 알코올, 순수Sigma-Aldrich459836CAS 64-17-5
Flunixine meglumideMSDQ-0273-035
유리 슬라이드 75 mm x 25 mmCorning101081022
HematoxylinMerckH9627CAS 571-28-2
염산 37%Merck339253CAS 7647-01-0
케타민Pisa agropecuariaQ-7833-028
광학 현미경NikonMicrophoto-FXA
Microsurgery 실체 현미경ZeissOPMI F170
Microtainer 노란색 케이프Beckton Dickinson365967
MicrotomeLeicaRM2125
모델 동물: Wistar 쥐Universidad Nacional Autó Mé xico
Nylon 3-0 (Dermalon)Covidien1750-41
폴리프로필렌 7-0AtramatSE867/2-60
포비돈-요오드10% 피부 용액Diafra SA de CV1.37E+86
스캐닝 전자 현미경ZeissDSM-950
수산화나트륨, 펠릿J. T. Baker3722-01CAS 1310-73-2
소프트웨어 ACT-1NikonVer 2.70
실체 현미경LeicaEZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100SJohnson and Johnson99970
Surgipath paraplastLeica39601006
바늘 (27G x 13mm)이있는 1 mL의 SynringeSensiMedicalLAN-078-077
조직 처리기 ( Histokinette)LeicaTP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder)Sakura Finetek USA5229
Trichrome stain kitSigma-AldrichHT15
Unicell DxC600 AnalyzerBeckman CoulterBC 200-10
XylazinePisa agropecuariaQ-7833-099
XyleneSigma-Aldrich534056CAS 1330-20-7
년

참고문헌

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  16. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).
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  19. León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
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