이 프로토콜은 담수 플라나리아( Schmidtea mediterranea )에서 난소를 해부하기 위해 취한 단계를 제시합니다.절개된 난소는 난모세포와 체세포의 세포 생물학을 연구하기 위해 투과 전자 현미경을 사용한 항체 면역염색 및 초구조 분석에 적합하며, 이전에는 접근할 수 없었던 이미징 깊이와 품질을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
생식 세포에 대한 접근성은 생식 세포 발달, 감수분열 및 재조합을 연구할 수 있도록 합니다. 담수 플라나리아의 성적 생물형인 Schmidtea mediterranea 는 생식 세포의 후성유전학적 사양을 연구하기 위한 강력한 무척추동물 모델입니다. 많은 수의 고환 및 남성 생식 세포와 달리 플라나리아 난모세포는 각각 5-20개의 난모세포가 있는 두 개의 난소만 있기 때문에 찾고 검사하기가 상대적으로 어렵습니다. 플라나리아의 몸체 내의 더 깊은 국소화와 보호 상피 조직의 부족은 또한 플라나리아의 난소를 직접 해부하는 것을 어렵게 만듭니다.
이 프로토콜은 이러한 어려움을 극복하기 위해 다운스트림 분석을 위해 플라나리아 난소의 국소화 및 절개를 용이하게 하기 위해 간단한 고정 단계를 사용합니다. 절제된 난소는 투과 전자 현미경(TEM) 및 항체 면역염색에 의한 초미세 구조 검사에 적합합니다. 이 프로토콜에 설명된 절개 기술은 또한 다양한 RNA 간섭(RNAi) 조건에서 난소를 검사하는 유전자 섭동 실험을 허용합니다. 이 프로토콜에 의해 달성된 난소의 온전한 생식 세포에 직접 접근하면 이미징 깊이와 품질이 크게 향상되고 난모세포 생물학의 세포 및 세포 내 조사가 가능합니다.
서론
플라나리아 해부학은 많은 조직 1,2,3,4,5,6에서 TEM을 사용하여 조사되었습니다. 그러나 난소나 난모세포에 대해서는 거의 주목을 받지 못했습니다. 난모세포에 대한 문헌이 부족한 것은 부분적으로는 이러한 세포에 접근하기 어렵기 때문이며, 이로 인해 플라나리아 난모세포의 생물학은 대부분 탐구되지 않은 채로 남아 있습니다. 분자 도구는 광학 또는 형광 현미경을 사용하여 플라나리아에서 난소 발달의 많은 조절 메커니즘을 밝혀냈습니다 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20
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프로토콜
1. 준비
- 벌레 준비: 성적 성숙을 달성하기 위해 일주일에 두 번 유기농 간 페이스트를 성적 플라나리아에게 먹이십시오.
참고 : 일반적으로 이러한 벌레는 길이가 1cm 이상이며 인두 입구 뒤쪽에 임질이 있습니다. - 솔루션을 준비합니다.
- 다음 시약을 준비하십시오 : 16 % 파라 포름 알데히드 (PFA); 50% 글루타르알데히드(GA) 수용액; N-아세틸-L-시스테인(NAC); 1x 인산염 완충 식염수 (PBS) : 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8mM Na2HPO4 및 2mM KH2PO4.
- 50% GA 및 16% PFA를 PBS로 희석하여 2.5% GA 및 2% PFA의 최종 혼합물로 만듭니다. 16% PFA를 PBS로 희석하여 최종 농도 4% PFA로 만듭니다.
- NAC 5g을 PBS 100mL에 녹여 5% 작동하는 용액을 만듭니다.
2. 난소 수집
- 성적으로 성숙한 벌레를 5% NAC로 실온의 접시에 담아 5분 동안 처리합니다.
알림: 큰 벌레가 말릴 수 있습니다. 브러시 또는 피펫 팁을 사용하여 웜을 평평하....
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결과
여기에 제시된 방법은 Guo et al.21에 의해 설명되었습니다. 성공적인 절개의 핵심은 난소 색소 침착을 식별하고 가이드를 올바르게 배치하는 것입니다. 이 방법의 전략은 넓은 위치에서 특정 위치로 이동하는 것입니다. 첫째, 이를 달성하기 위해 등쪽 및 배쪽 색소 침착 패턴에 의존합니다(그림 1A,B). 난소가 위치한 복부 색소 침착은 5%의 NAC 치료와 4%의 PFA 고정 후 하얗게 변합니다. 사용된 웜이 색소 침착을 명확하게 구분하지 못하는 경우 다른 웜을 사용하는 것이 좋습니다.
그런 다음 관련 없는 조직을 단계적으로 잘라냅니다(그림 1C-E). 난소가 노출되면(그림 1E) 주변 .......
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토론
플라나리아 난소를 해부하기 위한 이러한 고정 기반 절차는 난자 감수분열과 난소 발달 및 재생에 대한 이해를 용이하게 합니다. 난모세포와 체세포 지지 세포의 크기는 20μm에서 50μm까지 다양합니다. 절제 기반 방법은 절편 또는 전체 마운트 기반 방법으로는 달성할 수 없는 온전한 단일 난소 세포에 대한 접근성을 제공합니다. 이 프로토콜은 세포 및 세포 내 해상도에서 온전한 플라나리아 난소 해부학 및 난모세포 세포 생물학의 연구를 용이하게 할 것입니다.
이러한 절차에는 고정이 필요하며, 이로 인해 PFA 기반 실험에 대한 적용이 제한됩니다. 다른 비-PFA 고정 방법(예를 들어, 메탄올)도 난소 박리를 허용할 수 있다. 주어진 벌레가 유전자 섭동 실험에서 적당한 크기의 난소를 발달시키지 않는다면, 전통적인 전체 벌레 방법이 선호될 가능성이 높다.
프로토콜에.......
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 하워드 휴즈 의학 연구소(Howard Hughes Medical Institute, LK 및 ASA)와 헬렌 헤이 휘트니 재단(Helen Hay Whitney Foundation, LHG)의 지원을 받았습니다.
이 원고의 기반이 되는 원본 데이터는 http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628 의 Stowers Original Data Repository에서 액세스할 수 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 16% 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15710 | EM 등급 |
| 2% 수성 OsO4 | 전자 현미경 과학 | 19152 | |
| 50% 글루타르알데히드 | 전자 현미경 과학 | 16320 | EM 등급 |
| 디지털 현미경 사진 | Gatan Inc. | 버전 2.33.97.1, TEM 데이터 수집 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Sciences | 14120 | Embed 812 Kit, liquid, epoxy resin |
| Ethanol | Ted Pella | 19207 | Denatured |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Horse serum | Sigma | H1138 | |
| Lead Acetate | Electron Microscopy Sciences | ||
| MilliQ 물 | 역삼투압 처리수 | ||
| N-아세틸-L-시스테인 | Sigma | A7250 | |
| Parafilm | sigma | P7793 | |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | |
| 프로필렌 옥사이드 | 전자 현미경 과학 | 75569 | EM grade |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Toluidine blue O | 전자 현미경 과학 | 92319 | |
| 투과 전자 현미경 | FEI | Tecnai G2 Spirit BioTWIN | |
| 우라닐 아세테이트 | 전자 현미경 과학 | 541093 |
참고문헌
- Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy. Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).
- Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B.
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재인쇄 및 허가
