여기서 는 세포 스택 및 친화성 크로마토그래피 정제에서 자란 부착 된 HEK 293 세포를 사용하여 연구 급 AAV 벡터의 대규모 생산을위한 상세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 지속적으로 >1 x10 13 벡터 게놈/mL을 산출하여 대규모 동물 연구에 적합한 벡터 양을 제공합니다.
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방법 논문
대형 동물 모델의 전임상 연구를 위한 세포 스택에 있는 아데노 관련 바이러스 벡터의 생산
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터는 인간을 위해 승인된 3개의 AAV 유전자 치료와 함께 가장 임상적으로 진보된 유전자 치료 벡터 중 하나입니다. AAV에 대한 새로운 응용 프로그램의 임상 발전은 개, 양 및 비인간 영장류를 포함한 더 큰 동물 모델로 마우스와 같은 작은 동물 모델에서 전환하는 것을 포함합니다. 더 큰 동물에 AAV를 투여의 한계 중 하나는 하이 티터 바이러스의 대량에 대한 요구 사항입니다. 서스펜션 세포 배양은 AAV 벡터 생산을 위한 확장 가능한 방법이지만, 장비(예를 들어, 생물반응기)가 있거나 이러한 방식으로 AAV를 생산하는 방법을 아는 연구실이 거의 없습니다. 더욱이, AAV 티터는 부착된 HEK293 세포에 비해 현탁액 HEK 293 세포에서 생산될 때 현저히 낮습니다. 여기에 설명된 셀 스택을 사용하여 다량의 하이티터 AAV를 생산하는 방법이다. AAV를 적발하기 위한 자세한 프로토콜과 벡터 순도 유효성을 검사하는 방법도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 양 모델에서 AAV 매개 된 유전자 발현의 대표적인 결과가 제시된다. 부착 된 세포에서 AAV 벡터의 대규모 생산을위한이 최적화 된 프로토콜은 분자 생물학 실험실이 더 큰 동물 모델에서 새로운 AAV 치료의 테스트를 진행할 수 있게합니다.
서론
아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 이용한 유전자 치료는 지난 3년간1,2에걸쳐 큰 진전을 이루었다. 선천성 실명, 혈우병, 근골격계 및 중추 신경계의 질병을 포함한 다양한 유전질환의 개선을 입증하여 임상 연구3,4의최전선에 AAV 유전자 요법을 도입했다. 2012년, 유럽의약품청(EMA)은 LPL 결핍 의 치료를 위해 지단백질 리파아제(LPL)를 발현하는 AAV1 벡터인 글리베라를 승인하여 유럽 또는 미국에서 유전자 치료 치료를 위한 최초의 마케팅 승인을5. 그 이후, 2개의 추가 AAV 유전자 치료, Luxturna6 및 Zolgensma7는FDA 승인을 수신하고, 시장은 2025년까지 예상되는 10-20의 유전자 치료로 향후 5년 동안 빨리 확장될 것으로 예상됩니다8. 사용 가능한 임상 데이터는 AAV 유전자 치료가 안전하고 잘 용납되며 효과적인 양식으로 가장 유망한 바이러스 벡터 중 하나이며 AAV가 Cli....
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프로토콜
1. 세포 스택에 HEK293 세포의 이중 플라스미드 형질
- 37°C에서 설정된 구슬 목욕에서 HEK293 세포의 저온병을 해동한다.
참고: 세포가 해동하는 동안 37°C로 완전 DMEM을 완전히 따뜻하게 하여 도금시 세포에 충격이 되지 않도록 합니다. 최적의 성장과 트랜스페션 효율을 보장하기 위해 세포가 20개 미만의 낮은 통로 수를 확보하도록 보장합니다. 세포가 마이코플라즈마가 없는 것으로 인증되었는지 확인합니다. - 저온 유리병의 내용을 10mL의 사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM을 포함하는 15 mL 원판 튜브로 옮기고 5 분 동안 500 x g의 세포원심분리를 전달합니다.
- 미디어를 흡인한 다음, 사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM의 20 mL에서 HEK293 세포를 재중단합니다. 세포를 15cm 플레이트로 시드하고 37°C에서 배양하고 5% CO2를 구사합니다.
- 세포 배양실에서 파종하기 위해 15cm 플레이트에서 세포를 3개로 나눕다.
- 일단 세포가 80% 컨실릭되면, 미디어를 흡인하고 단층층을 방해하지 않도록 PBS3mL로 접시를 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 PBS를 흡인하고 트립신 3 mL를 추가합니다.
- 세포가 플레이트에서 들어올 때까지 ....
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결과
작은 설치류 모델에서 더 큰 동물 모델로 의번역및 최종 임상 응용 프로그램은 더 큰 동물을 트랜스포유하고 치료 효과를 달성하는 데 필요한 많은 양의 AAV로 인해 중요한 과제를 제시합니다. 합리적으로 설계된 AAV6.2FF 캡시드의 트랜스듀션 효율을 비교하기 위해, 이전에는 AAV63,마우스, 햄스터 및 양에 비해 뮤린 근육 세포에서 의 연도 효율이 101배 증가하여 인간 단클론 항체(hIgG)를 발현하는 AAV6.2FF를 투여하였다. AAV6.2FF-hIgG 발현 벡터는 CASI 프로모터4,우드척 간염 바이러스 후 조절 원소(WPRE) 및 SV40 폴리아 서열을 포함하였다. 6주 된 암컷 BALB/c(n=4) 마우스는 근육내(IM)를 투여하여 40 μL에서 AAV6.2FF-hIgG의 1 x10 11 vg을 투여하였으며, 혈액은 hIgG 모니터링을 위한 AAV 투여 후 0, 7, 14, 21 및 28일에 수집되었다. 4주된 .......
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토론
이 논문에 기재된 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 생산은 분자 생물학 연구 실험실 및 시설의 대부분에서 발견되는 일반적인 재료, 시약 및 장비를 사용합니다. 이 논문은 높은 품질의 시험관 내 및 생체 내 등급 rAAV를 독자에 의해 생성 할 수 있습니다. 무엇보다도, rAAV 생산을 위한 이 프로토콜은 세슘 염화 정제와 관련된 보다 지루한 프로토콜에 비해 효율적이며 초원심분리의 사용을 방지한다. HEK293 세포가 전염되면 정제 된 AAV는 5 근무 일 이내에 사용할 준비가되어 있습니다.
rAAV 생산 및 정화 공정 동안, 많은 단계는 벡터의 순도와 최종 티터에 영향을 미칠 수 있습니다. 첫 번째 및 가장 중요한 단계는 벡터 티터에 직접적인 영향을 미치는 HEK293 세포의 상태입니다. HEK293T 세포와 같은 다른 세포 유형 또는 시스템과 는 달리 HEK293 세포의 사용은 HEK293 세포가 지속적인 세포 성장을 위한 견고한 세포 네트워크를 .......
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공개 사항
사라 K. 우튼은 AAV6.2FF 캡시드에 대한 미국 특허 US10806802B2의 발명가입니다.
감사의 글
아미라 D. Rghei, 브레나 A. Y. 스티븐스, 실비아 P. 토마스, 제이콥 지 이 예이츠는 온타리오 수의대 학생 스티펜스와 온타리오 대학원 장학금을 받았다. 아미라 D. Rghei는 미탁스 가속 학생의 수혜자였다. 이 연구는 건강 연구를위한 캐나다 연구소 (CIHR) 프로젝트 보조금 (#66009)과 SKW에 공동 건강 연구 프로젝트 (NSERC 파트너) 보조금 (#433339)에 의해 투자되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.22 &무; m 필터 | Millipore Sigma | S2GPU05RE | |
| 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | SM2001C | |
| 1-Butanol | Thermo Fisher Scientific | A399-4 | 주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 |
| 착용 10 챔버 셀스택 | Corning | 3271 | |
| 1L PETG 병 | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | |
| 30% 아크릴아미드/비스 솔루션 | Bio-Rad | 1610158 | |
| 96웰 스커트 플레이트 | FroggaBio | FS-96 | |
| 접착 플레이트 씰 | Thermo Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| 과황산암모늄(APS) | Bio-Rad | 161-0700 | 주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용 |
| 혈액 및 조직 청소 키트 | Qiagen | 69506 | 의 섹션 4.6에서 DNA 청소에 사용합니다 |
| . 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용 | |||
| 세포 배양 접시 | Greiner bio-one | 7000232 | 15cm 플레이트 |
| 배양 원뿔형 튜브 | Thermo Fisher Scientific | 339650 | 15mL 원뿔형 튜브 |
| 배양 원뿔형 튜브 | Fisher Scientific | 14955240 50mL 원뿔형 튜브 | |
| 1000mg/L D-포도당, L-글루타민 | Cytiva 생명 과학 | SH30022.01 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Fisher Scientific | 32209 | |
| 에탄올 | 그린필드 | P016EA95 | 에틸 알코올(95% vol)을 섹션 3.7.4의 경우 20%, 섹션 6.1.1.1의 경우 70%로 희석 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30396.03 | |
| 빙초산 | Fisher Scientific | A38-500 | 주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용 |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| HBSS with Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH302268.02 | |
| HBSS without Mg2+ and Ca2+ | Thermo Fisher Scientific | SH30588.02 | |
| HEK293 세포 | American Tissue Culture Collection | CRL-1573 | 수령 즉시 제조업체에 설명된 대로 세포와 배양을 해동합니다. s 프로토콜. 세포가 최소한으로 계대형성되고 잘 자라면, 분취액에서 미래를 위해 분획을 동결하고 액체 질소에 저장합니다. 항상 통로 번호 30 아래의 셀을 사용하십시오. 배양된 세포가 30회 이상 계대측정된 후에는 저장된 분취액 |
| HEK293 숙주 세포 단백질 ELISA 키트 | Cygnus Technologies | F650S | Follow manufacturer에서 배양을 다시 시작하는 것이 좋습니다. s 지침 |
| 헤파린 황산염 칼럼 | Cytiva Life Sciences | 17040703 | |
| Kimwipe | Thermo Fisher Scientific | KC34120 | |
| L-글루타민 (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | |
| 대용량 원심분리기 튜브 지지 쿠션 | Corning | CLS431124 | 지지 쿠션은 반드시 대용량 원심분리기 튜브와 함께 사용해야 하며, 원심분리기 로터에 적절한 V-바닥 쿠션이 있어야 합니다. |
| 대용량 원심분리기 튜브 | Corning | CLS431123-6EA | 500 mL 원심분리기 튜브 |
| MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 05-408-129 | 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브, 사용 전 살균 |
| Molecular Grade Water | Cytiva Life Sciences | SH30538.03 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma Aldrich | L5125 | 주의. 장갑 착용 |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific | BP35810 | |
| Optimem, 감소 혈청 매체 | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-20D | 사용 전 멸균 |
| PBS (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | 세포에 사용하기 위해 1x로 희석 |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Cytiva Life Sciences | SV30010 | |
| pHelper plasmid | De novo design or obtained from plasmid | repository NA | |
| Pipet basin | Thermo Fisher Scientific | 13-681-502 | 멸균 피펫 분지 |
| 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100) | Thermo Fisher Scientific | 9002-93-1 | 주의. 장갑 |
| 착용 폴리에틸렌이민(PEI) | Polyscience | 24765-1 | 제조사 따르기' 1L 솔루션을 생산하기 위한 지침. 0.22&뮤; M 여과하고 4°C에 저장하십시오; C |
| 폴리 프로필렌 반 스커트 PCR 플레이트 | FroggaBio | WS-96 | |
| 폴리 소르 베이트 20 (트윈 20) | Thermo Fisher Scientific | BP337-100 | 주의. 장갑을 착용 |
| 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 | Cytiva Life Sciences | 10600023 | 집게를 사용하여 조작하십시오. 장갑을 착용하십시오. |
| Primary Antibody | Progen | 65158 | |
| Protein Ladder | FroggaBio | PM008-0500 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| pTrangene plasmid | De novo design or obtained from plasmid repository | NA | 의 AAV 적정과 호환되려면 게놈에 SV40 polyA를 포함해야 합니다 |
| RK-96440-14 | 분획 E1-E5 | ||
| RQ1, Dnase 10, 반응 완충액 | Promega | M6101 | |
| 샘플 희석제 | Cygnus Technologies | I700 | HEK293 숙주 세포 단백질 ELISA 키트 |
| 와 함께 사용하려면 별도로 구매해야 합니다.2차 항체, HRP | Thermo Fisher Scientific | G-21040 | |
| 탈지 분유 | 옥소이드 | LP0033B | |
| 도데실황산나트륨(SDS) | Thermo Fisher Scientific | 28312 | 주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용 |
| 수산화나트륨(NaOH) | Thermo Fisher Scientific | SS266-4 | |
| SV40 폴리A 프라이머 프로브 | IDT | 합성을 위한 IDT 인용을 위해 표 X의 순서를 사용하십시오 | |
| 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) | Thermo Fisher Scientific | 15524010 | 주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 1450021 | |
| Ultra-Filter | Millipore Sigma | UFC810024 | Ultra-4 Centrifugal 10K 장치는 10000 분자량 컷오프가 있으므로 사용해야 합니다 |
| 세포 용해를 위한 범용 뉴클레아제 | Thermo Fisher Scientific | 88702 | |
| 범용 qPCR 마스터 믹스 | NEB | M3003L | |
| Whatman Paper | Millipore Sigma | WHA1001325 | |
| β-메르캅토에탄올 | Fisher Scientific | 21985023 | 주의. 층류 후드 아래에서 사용하십시오. 장갑 착용 |
| 주의: 위험한 화학 물질 사용에 대한 지침은 재료 표를 참조하십시오. |
참고문헌
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G.
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재인쇄 및 허가
