여기서 우리는 체외 DC 분화에 대한 안정적인 녹다운 세포주를 얻기 위해 shRNA의 렌즈바이러스 트랜스듀션을 사용하여 수지상 세포(DC)의 개발에 관여하는 잠재적 전사 인자를 선별하기 위한 프로토콜을 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구
이 논문에서
요약
초록
수지상 세포 (DC)는 선천적이고 적응성 면역 반응을 연결하는 중요한 항원 제시 세포입니다. DC는 이질적이며 기존의 DC(cDC) 및 플라즈마 사이토이드 DC(pDC)로 나눌 수 있습니다. cDC는 순진한 T 세포를 위한 항원 제시를 전문으로 합니다. 한편, pDC는 바이러스 감염 시 다량의 타입 I 인터페론(IFN-I)을 생성할 수 있다. DC의 사양은 골수(BM)의 DC 전구체의 초기 단계에서 발생하며 전사 인자(TFs)의 네트워크에 의해 정의됩니다. 예를 들어, cDC는 높은 표현 ID2, PC는 높은 표현 E2-2 동안. 점점 더 많은 DC 하위 집합이 식별되고 있기 때문에 DC 개발을 제어하는 특정 TF를 이해하는 데 관심이 증가하고 있습니다. 여기서, 우리는 짧은 머리핀 RNA (shRNA)를 불멸의 조혈 줄기 및 선조 세포 (iHSPC) 라인으로 운반하는 렌즈 바이러스를 전달하여 시험관 내에서 DC 분화에 중요한 TFs를 선별하는 방법을 확립합니다. 안정적인 녹다운 세포 주 cDC 및 pDC 전위는 셀토메트리에 의해 분석된다. 이 접근은 시험관내선에서 선조에게서 DC 운명을 잠재적으로 지배하는 유전자를 확인하는 플랫폼을 제공합니다.
서론
DC는 선천적이고 적응형 면역의 주요 레귤레이터입니다1. DC는 주로 두 개의 기능적으로 구별되는 인구, 즉 pDC 및 cDC로 분류됩니다. 또한 cDC는 각각 I 형 및 유형 II cDC 또는 cDC1 및 cDC2의 두 개의 하위 집합을 포함합니다2. pDC, 발현 BST2, Siglec-H, 및 mice3,4에서 CD11c의 중간 수준은 염증 및 바이러스 감염 동안 많은 양의 IFN-I를 분비할 수 있는 세포입니다5. 그들의 강력한 IFN-I 생산 능력 때문에, 그(것)들은 또한 전신 루푸스 홍반성 (SLE)6를 포함하여 자기 면역 질병의 진행에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 의심됩니다. cDC1s는 XCR1, CD8a, CLEC9A 및 CD103의 표면 발현에 의해 정의된 마우스7, 항원 교차 프레젠테이션을 통해 세포독성 CD8+ T 세포(CTL)의 활성화 및 편광에 전문화되어, 세포내 병원체 및 암에
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
렌티바이러스의 취급은 국립 대만 대학 의과 대학의 환경 보건 및 안전학과의 규정에 따라 수행됩니다.
1. 불멸의 조혈 줄기 및 선조 세포주 준비 (iHSPC)
- 100 ng/mL FL 및 1 μM β-estradiol을 포함하는 완전한 RPMI 1640 배지에서 iHSPC 세포줄을 유지합니다.
- 3일마다 1:10의 비율로 세포를 통과합니다.
참고: 10% 태아 소 혈청(FBS), 5 x 10-5M β-메르카포에탄올, 10 μg/mL 젠타미신으로 보충하여 완전한 RPMI 1640 배지를 만듭니다. 재조합 뮤린 FL도 시판됩니다.
2. 렌티바이러스 트랜스듀션
- 플레이트 iHSPC는 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol 및 8 μg/mL 폴리브레인을 포함하는 완전한 배지의 1mL에서 12웰 플레이트에서 1 x 105 셀/웰의 밀도로.
참고: 폴리브레인의 농도는 세포 유형에 따라 다르며 일반적으로 4-8 μg/mL 범위에 있습니다. - 100의 감염 (MOI)의 복합성에 각 우물에 shRNA 운반 렌티 바이러스를 추가합니다.
참고: 렌티바이러스 벡터는 푸오....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
렌티바이러스 벡터 pLKO.1-Puro의 지도가 표시됩니다(도 1). lacZ에 대한 shRNA를 발현하는 렌즈바이러스(비표적 제어), Tcf4 및 iHSPCPc에서 IHSPCC에서 확인된 녹다운 효율은 tcf4의 발현이 shLacZ iHSPCPC(그림 2A)에 비해 shTcf4 iHSPC에서 감소된 것으로 나타났습니다. 한편, id2의 감소된 발현은 shLacZ iHSPC 제어(도 2B)에 비해 shId2 iHSPC에서도 관찰되었다. shLacZ, shTcf4 및 shId2 iHSPC 세포주 FL을 가진 시험관내 pDC 및 cDC로 분화되었다. shLac.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
Lentivirus 기반 shRNA 벡터는 종종 세포로 바이러스 성 변환에 의해 유전자 침묵에 사용되며 숙주 게놈으로 안정적인 통합을 허용합니다. 그러나, 상이한 세포 모형에 있는 각종 감과 효율을 고려해야 하고, 이 문제점을 극복하기 위하여 접근의 다수가 취해졌습니다.
폴리브레인은 세포막상에서 전하를 중화시킬 수 있는 다정화 폴리머로, 이를 통해 배관20 동안 세포에 대한 비리온의 결합을 강화한다. 그것은 트랜스듀션 속도를 증가 시키는 효과적인 방법이지만, 또한 과도 한 금액을 추가할 때 일부 세포 유형에 독성. 이 경우 폴리브레인의 독성을 테스트하고 상이한 세포에서 농도를 최적화하는 것이 요구된다. 프로타민 황산염, 양이온 화합물, 어쩌면 세포 생존을 증가 시키기 위해 다른 접근 21. 더욱이, 감염 당일에 완전한 매체를 새로 고침하면 트랜스듀션 후 생존율을 나타낼 수 있다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
Tz-Ling Chen 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 shRNA 렌즈바이러스 (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw)를 제공하는 국립 RNAi 코어 시설 (학계 시니카, 대만)에 감사드립니다. 이 작품은 대만 과학기술부(대부분 108-2320-B-002-037-MY3 및 MOST 109-2320-B-002-002-054-MY3)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (클론: N418) |
| FITC 안티-마우스/human CD11b 항체 | Biolegend | 101206 | (클론: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL 마이크로 튜브 | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS 버퍼 | 홈메이드 | 포뮬러: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 리간드 (FL) | 홈메이드 | ||
| 폴리브렌 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | RNAi 컨소시엄 (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | RNAi 컨소시엄 (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | RNAi 컨소시엄 (TRC) |
참고문헌
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
