중고심 노드 발사 속도의 마이크로 전극 어레이 기록으로 마우스의 본질적인 심장 페이스메이킹 결함을 식별합니다.

요약

이 프로토콜은 마우스의 페이스메이킹 결함을 식별하기 위해 전체 시노어심 노드 조직의 미세 전극 어레이 기록을 사용하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 설명하는 것을 목표로합니다. 약리학 에이전트는 또한 본질적인 페이스 메이킹에 그들의 효력을 공부하기 위하여 이 방법에 소개될 수 있습니다.

초록

오른쪽 심방 노드 (SAN)는 심장의 심박 동기 세포를 포함하고 있으며이 지역의 기능 장애는 빈맥이나 서맥을 유발할 수 있습니다. 심장 페이스 메이킹 결함의 신뢰할 수 있는 식별은 속도 적자를 마스크 할 수있는 자율 신경계의 영향을 크게 방지하여 본질적인 심박수의 측정을 필요로한다. 본질적인 심장 맥박조정기 기능을 분석하는 전통적인 방법은 생체 내 심박수에서 측정하기 위하여 약물 유도한 자율 봉쇄, 본질적인 심박수를 측정하기 위하여 고립된 심혼 기록, 및 sinoatrial 심박동기 세포의 sinoatrial 스트립 또는 단세포 패치 클램프 기록을 포함합니다 자발적인 행동 잠재적인 발사 비율을 측정하기 위하여. 그러나 이러한 보다 전통적인 기술은 기술적으로 어렵고 수행하기 어려울 수 있습니다. 여기에서, 우리는 마우스에서 전체 마운트 시노어 노드 제제의 마이크로 전극 어레이 (MEA) 기록을 수행하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 제시합니다. MEA는 체외 외 세포 필드 잠재력을 기록하기 위해 그리드와 같은 패턴으로 배열된 여러 미세 전극으로 구성됩니다. 본 원에 기재된 방법은 본질적인 심박수를 기록하기 위한 이전 접근법보다 상대적으로 빠르고 간단하며 더 정밀해지는 동시에 간편한 약리학적 심문을 가능하게 하는 결합된 이점이 있다.

서론

심장은 뇌에서 유래하는 것과 같은 심장 본질적인 및 외신 영향 모두에 의해 지배되는 복잡한 기관입니다. 시노아심 노드(SAN)는 포유류 심장 박동^1,2의개시 및 영속에 대한 심장 박동세포(sinoatrial 세포, 또는 SA 세포라고도 함)를 수용하는 심장의 정의된 영역이다. 본질적인 심박수는 그밖 심장 또는 신경 유머 영향에 의해 영향 없이 심박동기 세포에 의해 구동되는 비율입니다, 그러나 심전도와 같은 인간과 살아있는 동물에 있는 심박수의 전통적인 측정은, 심장에 있는 심박동기 및 신경 영향 둘 다 반영합니다. SA 세포에 가장 주목할 만한 신경 영향은 신체의 생리적 요구 사항을 충족하기 위해 발사 패턴을 지속적으로 조절하는 자율 신경계에서^3입니다. 이 아이디어를 지원, 모두 동정과 부교감 투영 SAN⁴근처에서 찾을 수 있습니다. 본질적인 심장 신경계(ICNS)는 특히 오른쪽 아리아에서 신경절플시가 SAN^5,6의활동을 조절하는 또 다른 중요한 신경 영향이다.

기능 장애는 많은 심장 장애를 기초할 수 있고, 그밖 합병증의 리스크에 기여할 수 있기 때문에, 페이스 메이킹 적자를 이해하는 것은 임상적으로 중요합니다. 아픈 부비동 증후군 (SSS)은 적절한 페이스 메이킹^7,8을방해하는 부상 절의 기능 장애를 특징으로하는 질병의 범주입니다. SSS는 부비동 서맥, 부비동 정지, 부비동 정지, 부비동 정지, 부비동 정지, 부도심 출구 블록, 번갈아 기다림 과 tachyarrhythmias^9로 제시할 수 있고, 색전성 치기및 갑작스런 죽음의 증가한 리스크를 포함하여 합병증으로 이끌어 낼 수 있습니다^8,10. 브루가다 증후군을 가진 사람들은, 급격한 심장 죽음의 증가한 리스크를 가진 심실 세동에 의해 표시된 심장 무질서, 또한 comorbid SAN 기능 장애^11,12가있는 경우에 부정맥 사건에 대한 더 중대한^리스크에있습니다. 시노온 임상 장애는 또한 심장 을 넘어 생리적인 결과가 있을 수 있습니다. 예를 들어, SSS는 대뇌^{저구혈(13)으로}인해 환자에서 발작을 유발하는 것으로 관찰되었다.

시노어심 페이스 메이킹 적자를 식별하려면, 본질적인 심박수는 자율 신경계 또는 유머 요인의 영향 없이 SAN의 활동을 측정하여 결정되어야 합니다. 임상적으로, 이것은 약리학적 자율^{봉쇄(14)에}의해 근사될 수 있다, 그러나 이 같은 기술은 또한 본질적인 심장 기능을 연구하기 위하여 포유류 모형에 적용될 수 있다^(15,16). 이 접근법은 신경 영향 기여의 큰 부분을 차단하고 생체 내 심장 검사에서 허용하는 동안, 그것은 완전히 심장에 대한 모든 외외적 인 영향을 제거하지 않습니다. 동물 모델에서 본질적인 심장 기능을 연구하는 데 사용되는 또 다른 연구 기술은 일반적으로 전기그램, 속도 또는 상심 다중 전자 화물 배열^{17,18, 19,20을}사용하여 측정을 포함하는 Langendorff-perfused 된 심혼을 사용하여 고립된 심장 기록이다. 이 기술은 신체에서 심장을 제거하는 것을 포함하기 때문에 심장 기능에 더 구체적이지만, 측정은 여전히 본질적인 심박수 측정^21에영향을 미칠 수있는 메카노 전기 자동 조절 메커니즘에 의해 영향을받을 수 있습니다. 고립 된 심장 기록은 또한 여전히^ICNS를통해 자율 조절에 의해 영향을받을 수있다^5,6,22,23. 더욱이, 심장 기능 측정에 중요한 심장의 생리학적으로 관련된 온도를 유지하는 것은 고립된 심장 접근법^20에서어려울 수 있다. SAN 기능을 연구하는 보다 직접적인 방법은 SAN 조직을 구체적으로 분리하고 활동을 측정하는 것입니다. 이는 SAN 스트립(절연 SAN 조직) 또는 고립된 SAN 맥박조정기^세포(24,25)를 통해 달성될 수^있다. SAN은 매우 작고 고도로 정의된 영역이므로 둘 다 높은 수준의 기술 적 교육이 필요하며, 세포 격리는 해리가 올바르게 수행되지 않으면 세포의 전반적인 상태를 손상시킬 수 있으므로 더 큰 도전을 제기합니다. 더욱이, 이러한 기술은 개별 기록 마이크로 전극을 사용하여 조직 또는 세포로부터 성공적으로 기록하기 위해 전문가 전기 생리학적 기술이 필요합니다.

이 프로토콜에서, 우리는 본질적인 심박수 측정을 얻기 위하여 마이크로 전극 배열 (MEA)를 사용하여 시험관 내SAN을 기록하는 기술을 기술합니다. 이 접근은 집중적인 전기 생리기술 세트가 결여된 연구원에 접근하기 위하여 높게 특정 한 전기 생리학 기록을 만드는 이점이 있습니다. MEA는 이전에 1 차 심근 세포^{배양26,27,28,29,30,31,32,}심장 시트^{33,34,35,36,37,38,39}및 조직 전체 탈산^40에서심근세포 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. ^41,42, 43^{,44,45,46, 47}. 이전 작업은 또한 SAN 조직^41,42에서필드 잠재력을 검사하기 위하여 행해졌습니다. 여기에서는 MEA를 사용하여 뮤린 내성 SAN 발사 속도를 기록하고 분석하는 방법론을 제공합니다. 우리는 또한 이 기술이 4-aminopyridine (4-AP), 전압 게이트 K⁺ 채널 차단제의 효력을 보여주는 견본 실험을 제공함으로써 SAN 본질적인 발사 비율에 약리학 효력을 시험하기 위하여 어떻게 이용될 수 있는지 설명합니다. 정의된 해부학 적 랜드 마크를 사용하여, 우리는 정확하게 다른 방법에 필요한 광범위한 조직 해부 또는 세포 격리를 수행하지 않고 SAN을 기록 할 수 있습니다. MEA는 비용 금지 될 수 있지만, 기록은 임상 및 생리 연구 응용 프로그램의 광대 한 배열에 사용할 수있는 페이스 메이킹의 매우 구체적이고 신뢰할 수있는 측정을 제공합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 실험 절차는 남부 감리교 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인된 바와 같이, 건강의 국가 학회 (NIH)의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 기록을 위한 다중 전극 어레이(MEA)를 코팅

1. 25m 붕산 완충제.
   1. 나₂B₄O_7의0.953 g를 녹여 , 증류수 80mL에 10 H₂O.
   2. HCl을 사용하여 pH를 8.4로 조정한 다음 증류수를 100mL의 최종 부피에 추가합니다.
2. 폴리에틸렌네민(PEI)의 0.1% 재고 용액을 만드십시오.
   1. 1% PEI 용액을 만들기 위해 증류수 4.9mL에 50%(w/v) PEI100 μL을 추가합니다.
   2. 1% PEI 용액을 25m borate 버퍼의 9mL에 1% PEI 용액의 1mL을 추가하여 borate 버퍼에서 0.1%로 희석합니다.
3. 파이펫 ~1mL의 0.1% PEI 용액을 마이크로 전극 어레이(MEA) 접시에 내세하여 전극이 완전히 덮여있다(도 1A 및 1B).
   참고: MEA의 미세 전극은 전형적으로 백금 블랙 또는 카본 나노튜브로 구성되며 폴리이미드(또는 아크릴)로 절연되어 있습니다. 두 물질 모두 소수성입니다. MEA를 PEI와 같은 양이온 폴리머로 코팅함으로써, 소수성 MEA 표면은 더 많은 친성성으로 만들어지며, 조직 샘플이 MEA표면(도 1A1)과더 잘 접촉할 수 있도록 한다.
4. 증발을 줄이고 실온(도 1C)에서하룻밤 MEA를 떠나열 가소성 필름으로 MEA 접시를 덮어.
5. 파이펫을 사용하여 MEA 접시에서 PEI 용액을 흡인시키고, 전극을 손상시킬 수 있는 전극 그리드를 만지지 않도록 주의한 다음, 증류수로 ≥4회 헹구는 데 주의한다(도1D).
6. PEI 코팅 MEA를 초순수 1-2mL 아래에 저장하고 필요할 때까지 열가소성 필름으로 밀봉합니다. 또는, 초순수수(도1E)로채워진 비커에 잠기어 코팅된 MEA를 보관한다.
   참고: PEI 코팅 공정은 첫 사용 전에 MEA에 대해 한 번만 수행해야 하며, 각 녹음 세션 이후에 MEA는 초순수수에 침수된 채 보관해야 합니다.

2. 조직 해부에 대한 완전한 티로드의 용액 준비

1. 1,000mL의 완전한 Tyrode 용액을 해부로 만드십시오. 먼저 8.1816 g의 NaCl을 800mL의 초순수수에 추가합니다.
2. 솔루션에 다음과 같은 양의 화학 물질을 추가하십시오: KCl의 0.4025 g; 0.1633 g 의 KH₂PO_4; 1.1915 g의 HEPES; 포도당 0.9999 g; MgCl_2의0.0952 g; 0.2646 g의 CaCl₂·2H₂O.
3. PH를 NaOH로 7.4로 조정한 다음 총 부피가 1,000mL가 될 때까지 초순수수를 추가합니다.
   참고: 완전 티로드용 액의 최종 구성은 다음(mM) 140NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH₂PO_4,5 HEPES, 5.55 포도당, 1 MgCl_2,1.8 CaCl_2입니다.

3. 녹음을 위한 산소티로드의 솔루션 준비

1. 티로드의 솔루션 500mL를 만드세요. 4.003 g의 NaCl을 400mL의 초순수수에 추가합니다.
2. 솔루션에 다음과 같은 양의 화학 물질을 추가하십시오: NaHCO_3의0.651 g; 0.042 g 의 NaH₂PO_4; 0.132 g의 CaCl₂·2H₂O; KCl 0.149 g; MgCl_2의0.0476 g; 포도당 0.999 g.
3. PH를 HCl로 7.4로 조정한 다음 총 부피가 500mL가 될 때까지 초순수수를 추가합니다.
4. 기록을 시작하기 전에 실온에서 적어도 30 분 동안 카보겐으로 용액을 산소화하십시오.
   참고: Tyrode의 용액의 최종 조성물은 다음 (mM) 137 NaCl, 15.5 NaHCO_3,0.7 NaH₂PO_4,1.8 CaCl_2,4 KCl, 1 MgCl_2,11.1 포도당입니다. 이 Tyrode의 솔루션은 해부에 사용되는 완전 티로드솔루션과 약간 다른 구성을 가지고 있습니다.

4. 약리학 변조를 위한 4-아미노피리딘(4-AP) 용액 준비

1. 4-AP의 1mM 작업 솔루션을 확인하십시오. 3단계에서 티로드의 용액의 4-AP ~ 200mL의 18.82 mg을 추가합니다.
2. 실험 전에 적어도 30 분 동안 4-AP 용액을 산소화하십시오.

5. 해부페트리 접시 준비

1. 실리콘 엘라스토머 성분을 베이스의 10:1 비율(중량별)에 경화제에 혼합합니다.
2. 실리콘 엘라스토머 혼합물의 ~15mL을 직경 60mm 페트리 접시에 붓습니다.
3. 엘라스토머가 사용하기 전에 48시간 동안 실온에서 치료할 수 있도록 허용합니다.
   참고: 실리콘 페트리 접시는 향후 해부를 위해 재사용할 수 있습니다.

6. 시노어심 노드(SAN)를 해부

1. SAN 해부에 대한 고분리 된 완전 티로드의 솔루션을 준비하십시오.
   1. 400 μL(1,000USP/mL)을 40mL의 완전 티로드 용액에 넣고 37°C 수조에서 따뜻하게 드실 수 있습니다.
2. 헤파린(1000 USP/mL)의 200-300 μL(1000 USP/mL)으로 마우스를 복렬히 주입하고 동물이 10분 동안 앉을 수 있도록 합니다.
3. 이소플루란 과다 복용에 의해 분리 된 마우스를 안락사.
   1. 공포플라스틱 튜브 내부의 필터 용지에 액체 이소플루란 200-300 μL을 추가하여 생성된 이소플루란 증기가 들어 있는 작은 유리 챔버에 마우스를 놓습니다.
      참고: 이소플루란은 피부 자극을 유발할 수 있고 피부를 통해 흡수될 수 있기 때문에 액체가 마우스에 직접 접촉해서는 안 됩니다. 따라서 이소플루란에 담근 와이프는 투여를 위해 천포튜브에 배치된다.
   2. 움직임과 호흡 노력의 중단과 발가락 핀치 반사의 부재에 의해 죽음을 확인합니다. 죽음은 일반적으로 챔버에 배치 다음 약 1-2 분 걸립니다.
      참고: 죽음은 일반적으로 배뇨를 동반합니다.
4. 마우스를 해부 보드에 배치하고 발을 뻗어 1 인치 길이, 23 게이지 주사기 바늘을 사용하여 보드에 발을 고정합니다. 그런 다음 외과 가위를 사용하고 뿌리에서 털을 절단하여 늑골 케이지 바닥 부근의 털을 제거합니다.
   참고: 해부 보드의 경우 폴리스티렌 쿨러 뚜껑을 사용할 수 있습니다.
5. hemostat로 피부를 잡고있는 동안, 오른쪽 코스트 아치(그림 3A)에왼쪽 코스트 아치의 오른쪽 코스파에서 갈비뼈의 아래 피부의 횡반 절개를 만들기 위해 외과 가위를 사용합니다.
6. 외과 가위로 회중을 열고 간을 다이어프램에서 조심스럽게 분리하여 간을 닉하지 않도록 주의하여 과도한출혈(도 3B)을유발합니다. 흉부 를 따라 다이어프램을 절개하여 흉부 구멍을 노출시합니다(도3C-D).
7. 외과 가위를 사용하여, 심장을 손상시키지 않도록주의하여 심장을 노출하기 위해, 쇄골까지 코스트 아치의 가장자리에서 늑골 케이지의 측면 벽을 잘라(도 3D). 그런 다음 23 게이지 주사기 바늘을 사용하여 갈비뼈를 어깨에 고정시키고 수술장 의 방해를 제자리에 고정시하십시오.
8. 이송 파이펫을 사용하여 따뜻한 물방울(37°C)을 심장에 완전히 티로드의 용액을 떨어뜨리면 촉촉함을 유지하십시오.
   참고: 심장이 건조되는 것을 허용하지 마십시오.
9. 여분의 미세 Graefe 집게로 그들을 잡고 수술 가위로 기관을 분리하여 폐를 제거(그림 3E).
10. 여분의 미세 Graefe 집게와 마음의 정점을 잡고 수술 가위로 대오르타와 베네 카바를 절단하여 제거합니다. 경화 실리콘 엘라스토머(그림4A)를함유한 페트리 접시에 하트를 옮기고, 2-3mL의 따뜻한(37°C)로 심장을 목욕시키는 이송 파이펫을 사용하여 완전 티로드의 용액을 분리한다.
    참고: SAN이 포함된 오른쪽 아리아의 섬세한 후방 벽과 연결된 오른쪽 심방 정맥을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 완전한 Tyrode의 용액으로 심장을 목욕시키는 것은 심장이 건조해지는 것을 유지하지만 해부 중에 가시성을 손상시키기 때문에 심장을 완전히 용액에 담지 못합니다.
11. 실험자의 오른쪽 아트리움과 실험자의 왼쪽 아트리움으로 심장을 방향을 지정합니다.
    참고: SAN 조직의 해부는 허혈 관련 상해를 방지하기 위하여 빨리 행해져야 합니다.
12. 해부 핀으로 하트 의 정점을 접시에 부착합니다. 그런 다음, 두몬트 #2 라미네절제술 집게로 열등한 베나 카바를 들고 있는 동안, 22 G 주사기 바늘을 열등하고 우수한 베나 카바를 통해 오른쪽 아트리움에서 자신의 위치를 찾아내고, 이는 또한 SAN(열등기와 우수한 벤라4B사이의 조직의 패치에 위치)의 대략적인 위치를 식별한다.
13. 작은 해부 핀을 사용하여 왼쪽및 오른쪽 심방 부속물을 접시에 고정시하십시오.
    1. Dumont #2 라미네절 집약으로 왼쪽 심방 부속물을 들고 있는 동안, 왼쪽 심방 부속기를 통해 해부 핀을 넣어 제자리에 고정하십시오.
    2. Dumont #55 집게로 올바른 심방 부속물을 들고있는 동안, 장소에 그것을 유지하기 위해 오른쪽 심방 부속기를 통해 해부 핀을 넣어.
       참고: 동일한 유형의 집게를 사용하여 원하는 경우 왼쪽 및 오른쪽 심방 부속물을 잡을 수 있습니다.
14. 베네 카베이에 걸쳐 주사기 바늘을 제거합니다.
15. 심장에서 혈액을 방출하려면, 심실을 가로 질러 횡절개를함으로써 심장의 정점 (즉, 아래 절반)을 제거하기 위해 카스트로 비에호 가위를 사용합니다(도 4C). 그런 다음, 따뜻한 (37 °C)를 추가하여 심장을 씻어 전달 파이펫으로 완전 티로드의 용액을 분리합니다.
16. 카스트로비에호 가위를 사용하여 대실 중격을 따라 절단하여 아리아보다 심실에 가까운 절개를 유지합니다. 동맥이 심실에서 분리 될 때까지 상실 중격을 따라 절단을 계속합니다.
17. 좌심절 중격을 따라 잘라 왼쪽 아트리움을 제거합니다.
18. 해부 핀을 오른쪽 아트리움 주변에 배치하여 평평하게 놓습니다(그림4D). 카스트로비에호 가위를 사용하여 아트리움에서 남은 지방, 혈관 또는 조직을 제거합니다.
19. 오른쪽 아트리움에서 SAN을 찾으면, 이 방향은 우수한 베나 카바(상단), 열등한 베나 카바(아래쪽), 크리스테 말단(왼쪽)에 의해 대략 경계된다(그림4D).
    참고 : 크리스타 말기는 오른쪽 심방 부속기와 SAN 사이의 어두운 근육 능선으로 나타납니다. 종종 SAN 동맥은 SAN(도 4D)을통해 coursing볼 수 있습니다.

7. 녹음을 위한 MEA 시스템 준비

1. 티로데의 용액(3단계에서)을 입력 용액병(도 5C)에추가하고 시스템에 카보젠가스(도 5A)의흐름을 켜서 산소를 공급한다.
   참고: 레코딩에 사용되는 Tyrode의 솔루션은 해부에 사용되는 완전 티로드 솔루션과 약간 다릅니다.
2. 가스(도 5B)와입력 용액 병(도5C)을가습하는 데 사용되는 원추형 플라스크에서 기포를 관찰하여 카보겐의 흐름을 확인한다.
3. 연동 펌프 유입튜브(도 5D)를티로드의 레코딩 솔루션(도5C)에삽입합니다. 이어서, 연동 펌프 유출 튜브를 수집병(도 5I)에삽입한다.
4. 연동 펌프를 25rpm으로 설정하여 유량 2mL/min의 유량을 제공하고 펌프를 시작합니다. 버퍼 누설 또는 오버플로가 있는지 시스템에 확인합니다.
5. 온도 조절기를 37°C로 설정하여 마우스의 생리적온도(도 5E)를설정합니다.

8. MEA 그리드에 심장 조직을 배치

1. 해부된 SAN 조직을 해부된 페트리 접시로부터 MEA그리드(도1A1)로전달한다.
   1. 반전 된 현미경 아래를 보면서 SAN 영역이 전극 그리드를 오버레이 할 수 있도록 부드러운 페인트 브러시로 조직을 부드럽게 배치합니다.
   2. 전극 그리드에 평평하게 배치되어 전극과 잘 접촉할 수 있도록 조직을 필요에 따라 재배치합니다.
      참고: 전극 그리드를 손상시키지 않도록 조직을 이동하려면 부드러운 페인트 브러시가 필요합니다.
2. 조직이 올바르게 배치되면 뼈 집게(또는 임의의 곡면 집게)를 사용하여 메쉬를 조직 위에 배치한다(도6A). 그런 다음 뼈 집게를 사용하여 하프앵커(도 6A)를메쉬에 배치하여 모든 것을 제자리에 고정시합니다(도6B).
3. 개별 전극의 활동이 기록 하는 동안 그들의 해부학 적 위치와 상관 될 수 있도록 MEA에 조직의 위치의 사진을 촬영. 이는 반전된 현미경 목표까지 스마트폰을 들고 있거나 연결된 현미경 카메라를 사용하여 수행할 수 있습니다.
   참고: 사진을 찍은 후 MEA의 방향이 변경되지 않으면 왼쪽 상단 전극이 녹화 중에 첫 번째 채널(Ch1)으로 나타납니다.
4. 커넥터플레이트(도 5F 및 6C)에MEA 접시를 놓고 하프 슬라이스 앵커를 방해하지 않고 MEA 접시에 관류 캡(도6C)을조심스럽게 놓습니다. 관류 캡은 실험실테이프(도 6C)를사용하여 더욱 고정될 수 있다.
   참고: 조절 가능한 솔루션 유입 및 유출 파이프외에도 캡에는 가스 전달을 위한포트(도 6C)가있습니다. 또한, 기준 전극 링은캡(도 6C)을통해 실행됩니다.
5. 조직이 처리에서 회복하고 기록하기 전에 15-20 분 동안 챔버에 적응할 수 있도록 하십시오.

9. 기록을 위한 데이터 수집 프로토콜 설정

참고: 다음 단계는 자발적인 비트 녹화 및 기록 조건을 정의하기 위한 소프트웨어 프로토콜을 여는 것을 설명합니다. 이러한 단계의 세부 사항은 사용 중인 특정 소프트웨어에 따라 다를 수 있지만 일반 개요는 동일하게 유지되어야 합니다.

1. 앰프(도5G)를켜고 컴퓨터의 소프트웨어에서 레코딩을 위한 워크플로우(그림5H)를설정합니다.
   1. 소프트웨어를 열고 워크플로를클릭합니다.
   2. 새 폴더열기를 선택합니다.
   3. 템플릿 폴더를 엽니다.
   4. 64MD1-1920X1080(데스크톱 해상도에 따라 다름)을 선택합니다.
   5. QT 폴더를 엽니다.
   6. 자발적녹음 폴더를 엽니다.
   7. Beat_recording.moflo 템플릿을 선택하고엽니다(그림 7A).
2. 원하는 기록 조건에 따라 추적, 추적 지속 시간, 추적 간격, 입력 전압, 샘플링 속도 등을 지정하도록 기록 매개 변수를 설정합니다(그림7B).
   참고: 비트 주파수 및 인터스파이크 데이터 수집의 경우 일반적으로 2.9mV의 입력 범위 전압, 1Hz 하이 패스 필터, 1000Hz 로우 패스 필터 및 20kHz의 샘플링 속도를 사용합니다.
3. 약물 투여 전후와 같은 실험의 상이한 위상 또는 조건을 표시하려면 주석 탭을 클릭하여 원하는 표기표(도7C)를추가합니다.
4. 수집할 데이터에 대한 파일 대상을 지정하려면 저장소 사용 상자를 선택하고 파일 이름 수정자 상자에 원하는 파일 이름을 입력합니다.

10. 기록 및 수집 데이터 수행

1. 획득 소프트웨어의 맨 위 메뉴 모음에서 녹음 및 재생 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 추적 사이에 2분 간격으로 1분 동안 의 10개의 추적에 대한 데이터를 수집합니다.
2. 이러한 초기 추적에서, 기록된 파형이 정상 및 고품질 조직 제제와 일치하는지 확인함으로써 대부분의 기록 채널이 ≥ 0.5mV및 동일한 스파이크 간 간격의 신호 진폭을 나타낸다는 것을 확인함으로써(도8).
   참고: 해부학적 위치에 대응하는 개별 미세 전조의 활성 및 파형의 초기 평가는 MEA에 조직을 배치한 후 획득한 그림을 참조하여 수행될 수 있다.
3. 조직에 약물의 효과를 측정하려면 맨 위 메뉴 모음의 일시 중지 버튼을 클릭하여 초기 기준 데이터를 획득한 후 기록을 일시 중지합니다.
   참고: 실험의 약물 반응 단계는 주석 탭을 클릭하고 위에서 설명한 대로 원하는 표기서를 추가하여 기록에 유표화될 수 있다(도7C).
4. 펌프를 일시 중지하고 펌프 유입 튜브를 일반 레코딩 솔루션에서 원하는 약물이 포함된 Tyrode의 솔루션으로 전환합니다.
   참고: 예제 실험에서 Tyrode의 용액은 1mM 4-aminopyridine (4-AP)와 함께 사용되었습니다.
5. 펌프를 다시 시작하고 레코딩을 일시 중지해제하여 데이터 수집을 다시 시작합니다.
6. 일단 약물 주입 Tyrode의 용액이 조직에 도달하면, 기록 10 기준선 기록에 대한 이전과 같은 방식으로 흔적.
   참고: 약물이 녹음실에 주입됨에 따라 흔적이 안정화되는 데 시간이 걸릴 것입니다. 약물의 작용 메커니즘은 기록 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 행동의 가역 메커니즘을 가지고 약물에 대한, 세척 기간은 또한 건강한 조직의 지표인 기준선 수준으로 활동의 복원을 확인하기 위해 기록되어야한다.
7. 녹화를 마무리하려면 중지를 클릭합니다.
8. 조직이 초기 기록 설정 절차에 따라 이동 한 경우에 현미경에서 MEA에 조직의 위치의 최종 사진을 찍습니다.

11. 녹화 후 설정 청소

1. MEA를 청소하십시오.
   1. 레코딩을 마친 후 1mL 마이크로피펫을 사용하여 MEA 접시에서 레코딩 용액을 부드럽게 제거합니다.
      참고: 손상될 수 있는 MEA 전극에 연락하지 않도록 주의하십시오.
   2. 뼈 집게(또는 곡선된 집게)로 메시및 하프 앵커를 제거합니다. 그런 다음 페인트 브러시를 사용하여 MEA 표면에서 조직을 제거하는 것은 항상 개별 미세 전극을 만지지 않도록주의하십시오.
   3. 워시 보틀을 사용하여 MEA 접시를 초순수물로 약 3~4회 헹구십시오.
   4. 4 °C에서 초순수에 담근 청소 된 MEA를 저장합니다.
2. 연동 펌프의 최대 속도 설정을 사용하여 최소 5 분 동안 초순수 물을 실행하여 시스템 튜브를 헹구는 다.
   참고: 곰팡이 의 성장을 방지하기 위해 청소 후 튜브 내부에 물이나 완충액을 남겨두면안됩니다.

12. SAN 비트 주파수를 측정하기 위해 MEA 녹음 분석

1. 분석 소프트웨어의 "Beat_frequency_analysis" 템플릿에서 저장된 기록된 데이터 파일을 엽니다(그림9)
2. 재생 버튼을 클릭하고 전체 레코딩을 실행하여 데이터 집합을 시각화하고 적절한 분석 매개 변수를 할당할 수 있습니다.
   1. 추적당 평균또는 시간당 평균으로 표시되는지여부(그림 10A)에대한 데이터 표시 형식에 대한 비닝 창을 선택합니다.
   2. 분석에 포함될 채널을 선택하고 자동 파형 피크 식별을 위해 원하는 진폭 최대값 또는 진폭 미니마 임계값을 설정합니다(그림10B).
      참고: 개별 채널, 채널 의 조합 또는 64개 채널 모두를 이 단계에서 분석을 위해 선택할 수있습니다(그림 9). 선택한 임계값이 파형의 최대값과 미니마 값에 너무 가까우면 분석 소프트웨어에서 일부 파형 피크를 식별하지 못할 수 있습니다.
   3. 분석에 포함될 사전 스파이크 및 후스파이크 시간을 설정합니다.
      참고 : 50 ms 사전 스파이크와 100 ms 포스트 스파이크의 설정은 일반적으로 잘 작동(그림 10B).
3. 분석 조건을 설정한 후 Play 버튼을 다시 클릭하여 데이터 집합을 다시 실행하고 분석 매개 변수가 스파이크 추출에 적합한지 확인합니다.
4. 분석을 위해, 실험의 기준 기간 동안 및 약물 노출 기간 동안 또 다른 3개의 연속 안정된 추적 동안 각 추적에 대해 안정적인 구타율을 나타내는 3개의 가장 안정적인 연속 흔적을 식별한다(도10A).
5. 분석을 위해 시작 및 끝 추적을 지정하고 분석할 각 추적의 시간 기간을 입력합니다(그림9).
6. 분석을 시작하기 전에 분당 비트 저장 및 저장 인터스파이크 간격(그림 10B)에대한 사용 가능 상자를 선택합니다.
7. 파일 이름 수정기 상자(그림10B)에원하는 파일 이름을 입력합니다. 비트 주파수 및 인터스파이크 간격에 대한 분석된 데이터는 ASCII(텍스트) 형식의 형태로 저장됩니다.
   참고: 다른 조건(예: 기준선 및 약물 반응)을 분석하려면 각 조건에 대해 분석을 별도로 실행해야 합니다.
8. 상단 탭 모음의 재생 및 기록 버튼을 클릭하여 분석을 시작합니다.
9. 다른 응용 프로그램에 대한 데이터를 내보내려면 분당 비트 저장 및 저장 인터스파이크 간격(그림 10B)에대한 상자를 선택합니다. 파일 이름 수정자 상자(그림10B)에원하는 파일 이름을 입력하고 저장을 클릭하여 선택한 폴더에 ASCII 텍스트 형식으로 분석된 데이터를 저장합니다.

결과

조직이 15 분 동안 접시에 적응하도록 허용 한 후, 10 1 분 흔적이 기록됩니다. 현재 프로토콜은 한 시간 이상 활동을 기록하지만 여기에 표시되지 않은 게시되지 않은 데이터에서 ≥4 h에 대한 안정적인 발사 패턴을 기록했습니다. 실험 적 준비가 데이터 수집에 좋은 경우, 각 기록 채널은 주어진 채널(그림 11D)에대한 균일 한 모양의 일관되고 균등하게 간격 반복 파형 (즉, 스파이크)을 전시해야합니다. 이 파형은 본질적인 심장 페이스 메이킹 활동을 반영하는 개별 적인 심박동에 해당합니다. 인터스파이크 간격은 탈극화 개시 부위에 비해 위치의 작은 차이로 인해 채널 간에 완벽하게 정렬되지 않을 수 있더라도 모든 채널에 대해 동일해야한다(그림 8). 주어진 채널에 대한 파형의 모양은 일관성이 있어야하지만, 파형의 모양은 조직내 전극의 위치에 따라 채널마다달라집니다(도 8).

토론

조직이 깨지기 쉽고 건강한 조직이 성공적인 기록을 위해 필요하기 때문에 SAN 해부 과정을 연습하고 마스터하는 것이 필수적입니다. SAN 해부 동안 올바른 방향은 조직의 적절한 영역을 얻기 위해 필수적입니다. 그러나, 심혼의 원래 방향은 이 노력을 복잡하게 하는 해부 과정에서 쉽게 분실될 수 있습니다. 따라서 적절한 좌우 방향을 보장하기 위해 아리아를 시각적으로 검사해야 합니다. 일반적으로 오른쪽 아트리움은 더 투명해지는 경향이 있는 반면 왼쪽 아트리움은 일반적으로 색상^25,48에서더 어둡고 빨간색이 더 강합니다. 더욱이, 조직들이 쉽게 기계적으로^손상되기때문에, 그것으로 작업하거나 전극 그리드에 장착하는 동안 SAN 조직을 스트레칭하거나 전극 그리드에 장착하지 않는 것이 필수적이다. 건강하고 제대로 해부 된 SAN 조직을 확인하는 팁은 조직이 구타하고 있는지 확인하기 위해 현미경의 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4-아미노피리딘	시그마	A78403-25G
22 게이지 주사기 바늘	Fisher Scientific	14-826-5A	해부에 사용
23 게이지 주사기 바늘	Fisher Scientific	14-826-6C	해부에 사용
60mm 페트리 접시	Genesee Scientific	32-105G
500mL 파이렉스 병	Fisher Scientific	06-414-1C	용액 보관에 사용
1000 mL Pyrex Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D	용액 보관에 사용
뼈 집게	Fine Science Tools	16060-11
염화칼슘 이수화물 (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Carbogen(95% O2, 5% CO2)
Castroviejo 가위, 4"	Fine Science Tools	15024-10
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
데이터 수집 PC			CPU: Intel Xeon 또는 Intel Core i7, 메모리: 8GB, HDD: 1TB, 그래픽 카드: NVIDIA 또는 On-board, 화면: 1920x1080
해부 현미경	Jenco
해부 핀	Fine Science Tools	26002-20
Dumont #2 Laminectomy Junps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
엑스트라 파인 그레이프 펜치	파인 사이언스 도구	11152-10
유리 챔버	그레인저	49WF30	마우스 안락사에 사용됨
하프 앵커 키트	워너 인스트루먼트	SHD-22CL / 15 WI 64-0247
HCl	Fisher Chemicals	SA48-4	pH 밸런싱에 사용
Hemostat	Fine Science Tools	13013-14
Heparin	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
도립 현미경	Motic	AE2000
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
랩 테이프	Fisher Scientific	15-950
해부 현미경 용 광	Dolan-Jenner	MI150DG 660000391014
염화 마그네슘 (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337-100G
MED64 헤드 앰프	MED64	MED-A64HE1S
MED64 메인 앰프	MED64	MED-A64MD1A
MED64 관류 캡	MED64	MED-KCAP01
MED64 관류 파이프 홀더 키트	MED64	MED-KPK02
MED64 ThermoConnector	MED64	MED-CP04
메시	워너 인스트루먼트	640246
미세 전극 어레이 (MEA)	알파 메드 사이언티픽	MED-R515A
Mobius 소프트웨어	WitWerx Inc.		MED64
NaOH	Fisher Chemicals	S320-500
Normal Saline	Ultigiene	NDC 50989-885-17
페인트 브러시	Fisher Scientific	NC1751733
Parafilm	Genesee Scientific	PM-996
연동 펌프	Gilson	F155009
연동 펌프 튜빙	Fisher Scientific	14-171-298	1/8'' 내경
폴리에틸렌이민	시그마	P3143
염화칼륨(KCl)	시그마-알드리치	P9333-500G
인산칼륨 일염기성(KH2PO4)	시그마-알드리치	P5655-500G
나트륨 중탄산염	시그마	S6297
염화나트륨 (NaCl)	Fisher Scientific	S671-3
실그뤼드 엘라스토머 키트	다우 코닝	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
인산나트륨 일염기	성 시그마	S6566
사붕산나트륨	시그마	S9640
수술용 가위	정밀 과학 도구	14074-09
트랜스퍼 피펫 (3mL 졸업)	Samco Scientific	225