방법 논문

중고심 노드 발사 속도의 마이크로 전극 어레이 기록으로 마우스의 본질적인 심장 페이스메이킹 결함을 식별합니다.

DOI:

10.3791/62735

⸱

2021년 7월 5일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Southern Methodist University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 마우스의 페이스메이킹 결함을 식별하기 위해 전체 시노어심 노드 조직의 미세 전극 어레이 기록을 사용하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 설명하는 것을 목표로합니다. 약리학 에이전트는 또한 본질적인 페이스 메이킹에 그들의 효력을 공부하기 위하여 이 방법에 소개될 수 있습니다.

초록

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오른쪽 심방 노드 (SAN)는 심장의 심박 동기 세포를 포함하고 있으며이 지역의 기능 장애는 빈맥이나 서맥을 유발할 수 있습니다. 심장 페이스 메이킹 결함의 신뢰할 수 있는 식별은 속도 적자를 마스크 할 수있는 자율 신경계의 영향을 크게 방지하여 본질적인 심박수의 측정을 필요로한다. 본질적인 심장 맥박조정기 기능을 분석하는 전통적인 방법은 생체 내 심박수에서 측정하기 위하여 약물 유도한 자율 봉쇄, 본질적인 심박수를 측정하기 위하여 고립된 심혼 기록, 및 sinoatrial 심박동기 세포의 sinoatrial 스트립 또는 단세포 패치 클램프 기록을 포함합니다 자발적인 행동 잠재적인 발사 비율을 측정하기 위하여. 그러나 이러한 보다 전통적인 기술은 기술적으로 어렵고 수행하기 어려울 수 있습니다. 여기에서, 우리는 마우스에서 전체 마운트 시노어 노드 제제의 마이크로 전극 어레이 (MEA) 기록을 수행하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 제시합니다. MEA는 체외 외 세포 필드 잠재력을 기록하기 위해 그리드와 같은 패턴으로 배열된 여러 미세 전극으로 구성됩니다. 본 원에 기재된 방법은 본질적인 심박수를 기록하기 위한 이전 접근법보다 상대적으로 빠르고 간단하며 더 정밀해지는 동시에 간편한 약리학적 심문을 가능하게 하는 결합된 이점이 있다.

서론

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심장은 뇌에서 유래하는 것과 같은 심장 본질적인 및 외신 영향 모두에 의해 지배되는 복잡한 기관입니다. 시노아심 노드(SAN)는 포유류 심장 박동1,2의개시 및 영속에 대한 심장 박동세포(sinoatrial 세포, 또는 SA 세포라고도 함)를 수용하는 심장의 정의된 영역이다. 본질적인 심박수는 그밖 심장 또는 신경 유머 영향에 의해 영향 없이 심박동기 세포에 의해 구동되는 비율입니다, 그러나 심전도와 같은 인간과 살아있는 동물에 있는 심박수의 전통적인 측정은, 심장에 있는 심박동기 및 신경 영향 둘 다 반영합니다. SA 세포에 가장 주목할 만한 신경 영향은 신체의 생리적 요구 사항을 충족하기 위해 발사 패턴을 지속적으로 조절하는 자율 신경계에서3입니다. 이 아이디어를 지원, 모두 동정과 부교감 투영 SAN4근처에서 찾을 수 있습니다. 본질적인 심장 신경계(ICNS)는 특히 오른쪽 아리아에서 신경절플시가 SAN5,6의활동을 조절하는 또 다른 중요한 신경 영향이다.

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프로토콜

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여기에 설명된 모든 실험 절차는 남부 감리교 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인된 바와 같이, 건강의 국가 학회 (NIH)의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 기록을 위한 다중 전극 어레이(MEA)를 코팅

  1. 25m 붕산 완충제.
    1. 나2B4O7의0.953 g를 녹여 , 증류수 80mL에 10 H2O.
    2. HCl을 사용하여 pH를 8.4로 조정한 다음 증류수를 100mL의 최종 부피에 추가합니다.
  2. 폴리에틸렌네민(PEI)의 0.1% 재고 용액을 만드십시오.
    1. 1% PEI 용액을 만들기 위해 증류수 4.9mL에 50%(w/v) PEI100 μL을 추가합니다.
    2. 1% PEI 용액을 25m borate 버퍼의 9mL에 1% PEI 용액의 1mL을 추가하여 borate 버퍼에서 0.1%로 희석합니다.
  3. 파이펫 ~1mL의 0.1% PEI 용액을 마이크로 전극 어레이(MEA) 접시에 내세하여 전극이 완전히 덮여있다(도 1A 및 1B....

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결과

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조직이 15 분 동안 접시에 적응하도록 허용 한 후, 10 1 분 흔적이 기록됩니다. 현재 프로토콜은 한 시간 이상 활동을 기록하지만 여기에 표시되지 않은 게시되지 않은 데이터에서 ≥4 h에 대한 안정적인 발사 패턴을 기록했습니다. 실험 적 준비가 데이터 수집에 좋은 경우, 각 기록 채널은 주어진 채널(그림 11D)에대한 균일 한 모양의 일관되고 균등하게 간격 반복 파형 (즉, 스파이크)을 전시해야합니다. 이 파형은 본질적인 심장 페이스 메이킹 활동을 반영하는 개별 적인 심박동에 해당합니다. 인터스파이크 간격은 탈극화 개시 부위에 비해 위치의 작은 차이로 인해 채널 간에 완벽하게 정렬되지 않을 수 있더라도 모든 채널에 대해 동일해야한다(그림 8). 주어진 채널에 대한 파형의 모양은 일관성이 있어야하지만, 파형의 모양은 조직내 전극의 위치에 따라 채널마다달라집니다(도 8).

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토론

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조직이 깨지기 쉽고 건강한 조직이 성공적인 기록을 위해 필요하기 때문에 SAN 해부 과정을 연습하고 마스터하는 것이 필수적입니다. SAN 해부 동안 올바른 방향은 조직의 적절한 영역을 얻기 위해 필수적입니다. 그러나, 심혼의 원래 방향은 이 노력을 복잡하게 하는 해부 과정에서 쉽게 분실될 수 있습니다. 따라서 적절한 좌우 방향을 보장하기 위해 아리아를 시각적으로 검사해야 합니다. 일반적으로 오른쪽 아트리움은 더 투명해지는 경향이 있는 반면 왼쪽 아트리움은 일반적으로 색상25,48에서더 어둡고 빨간색이 더 강합니다. 더욱이, 조직들이 쉽게 기계적으로손상되기때문에, 그것으로 작업하거나 전극 그리드에 장착하는 동안 SAN 조직을 스트레칭하거나 전극 그리드에 장착하지 않는 것이 필수적이다. 건강하고 제대로 해부 된 SAN 조직을 확인하는 팁은 조직이 구타하고 있는지 확인하기 위해 현미경의 .......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 투자되었다, 보조금 번호 R01NS100954 및 R01NS099188.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-아미노피리딘시그마A78403-25G
22 게이지 주사기 바늘Fisher Scientific14-826-5A해부에 사용
23 게이지 주사기 바늘Fisher Scientific14-826-6C해부에 사용
60mm 페트리 접시Genesee Scientific32-105G
500mL 파이렉스 병Fisher Scientific06-414-1C용액 보관에 사용
1000 mL Pyrex BottleFisher Scientific06-414-1D용액 보관에 사용
뼈 집게Fine Science Tools16060-11
염화칼슘 이수화물 (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC5080-500G
Carbogen(95% O2, 5% CO2)
Castroviejo 가위, 4"Fine Science Tools15024-10
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
데이터 수집 PCCPU: Intel Xeon 또는 Intel Core i7, 메모리: 8GB, HDD: 1TB, 그래픽 카드: NVIDIA 또는 On-board, 화면: 1920x1080
해부 현미경Jenco
해부 핀Fine Science Tools26002-20
Dumont #2 Laminectomy JunpsFine Science Tools11223-20
Dumont #55 ForcepsFine Science Tools11295-51
  엑스트라 파인 그레이프 펜치파인 사이언스 도구11152-10
유리 챔버그레인저49WF30마우스 안락사에 사용됨
하프 앵커 키트워너 인스트루먼트  SHD-22CL / 15 WI 64-0247
HClFisher ChemicalsSA48-4pH 밸런싱에 사용
HemostatFine Science Tools13013-14
HeparinAurobindo Pharma Limited IDA, PashamylaramNDC 63739-953-25
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
도립 현미경MoticAE2000
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
랩 테이프Fisher Scientific15-950
해부 현미경 용 광Dolan-JennerMI150DG 660000391014
염화 마그네슘 (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
MED64 헤드 앰프MED64MED-A64HE1S
MED64 메인 앰프MED64MED-A64MD1A
MED64 관류 캡MED64MED-KCAP01
MED64 관류 파이프 홀더 키트MED64MED-KPK02
MED64 ThermoConnectorMED64MED-CP04
메시  워너 인스트루먼트640246
미세 전극 어레이 (MEA)알파 메드 사이언티픽MED-R515A
Mobius 소프트웨어WitWerx Inc.MED64
NaOHFisher ChemicalsS320-500
Normal SalineUltigieneNDC 50989-885-17
페인트 브러시Fisher ScientificNC1751733
ParafilmGenesee ScientificPM-996
연동 펌프GilsonF155009
연동 펌프 튜빙Fisher Scientific14-171-2981/8'' 내경
폴리에틸렌이민시그마P3143
염화칼륨(KCl)시그마-알드리치P9333-500G
인산칼륨 일염기성(KH2PO4)시그마-알드리치P5655-500G
나트륨 중탄산염시그마S6297
염화나트륨 (NaCl)Fisher ScientificS671-3
실그뤼드 엘라스토머 키트다우 코닝184 SIL ELAST KIT 0.5KG
인산나트륨 일염기성 시그마S6566
사붕산나트륨시그마S9640
수술용 가위정밀 과학 도구14074-09
트랜스퍼 피펫 (3mL 졸업)Samco Scientific225
pH 밸런싱에 사용되는 용 특정 소프트웨어

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
  2. Josea, A. D., Collison, D. The normal ran....

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Microelectrode Array RecordingSinoatrial NodeCardiac PacemakingIntrinsic Heart RateMouse Heart PreparationPacemaker CellsExtracellular Field PotentialsPharmacological InterrogationBeat Frequency AnalysisElectrophysiology Techniques

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