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방법 논문

세균 세포 없는 Lysate의 신속하고 저렴하며 단순한 생산

4.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62753

⸱

2021년 10월 29일

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 세포 없는 유전자 발현을 위한 세균성 용해를 생성하는 신속하고 간단한 방법을 설명하며, 대장균의 엔지니어링 된 균주를 사용하고 표준 실험실 장비만 필요합니다.

초록

세포 없는 유전자 발현은 살아있는 유기체의 합병증 없이 생물학의 힘을 제공합니다. 많은 이러한 유전자 발현 시스템이 존재하지만, 대부분은 구매 및 / 또는 효과적으로 생산하기 위해 특수 장비와 미세하게 연마 전문 지식이 필요합니다 매우 비싸다. 이 프로토콜은 표준 실험실 장비만을 사용하고 최소한의 처리를 요구하는 높은 수준의 유전자 발현을 지원하는 세균세포 없는 용액을 생산하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 성장에 영향을 미치지 않는 내성용균을 생성하는 대장균 균주를 사용하지만, 간단한 동결 해동 사이클에 따라 수확된 세포 펠릿을 효율적으로 리스합니다. 필요한 유일한 추가 처리는 세포 파편의 자동 lylysate를 취소하는 원심 분리 다음 간단한 인큐베이션입니다. 동적 유전자 회로는 수확하기 전에 세포에서 ClpX protease의 이종 발현을 통해 달성될 수 있다. lacZ 유전자가 결여된 대장균 균주는 착색 또는 형광 판독을 사용하여 고감도, 세포 없는 생체 감지 애플리케이션에 사용될 수 있다. 전체 프로토콜은 8-9시간 만큼 필요하며, 접종부터 완료까지 1-2시간의 실습 노동만 필요합니다. 세포 없는 용액을 얻기 위한 비용과 시간을 줄임으로써, 이 방법은 다양한 응용에 대한 세포 없는 유전자 발현의 경제성을 높여야 한다.

서론

세포없는 용해에서의 유전자 발현은 살아있는 세포1,2,3,4를사용하는 데 비해 몇 가지 장점이 있다. Lysates는 쉽게 생화학적으로 변형될 수 있고 살아있는 세포에서 달성하기 위하여 해롭거나 불가능할 수 있는 조건에서 이용될 수 있습니다. 유전자 발현 회로는 호스트 생물학 프로세스와 경쟁하거나 경쟁할 필요가 없으며, 새로운 유전 회로를 테스트하는 것은 DNA를 추가하는 것과 같이 간단합니다. 이러한 이유로, 세포없는 유전자 발현은 바이오 센서5,6에서 합성 유전자 회로7,8을 인공 세포 개발에 빠르게 프로토타이핑하는 것까지 다양한 응용 을발견했다. 대부분의 세포 없는 유전자 발현은 고도로 처리된 세포 용액을 이용하며, 일반적으로 길고 복잡한 프로토콜, 특수 장비 및/또는 민감한 단계를 요구하여 사용자와 배치10,11사이에 상당한 변화를 초래할 수 있다.

본 백서는 최소한의 처리 및 전문 지식이 필요한 세포 없는 용액을 제조하기 위한 간단하고 효율적인 방법을설명한다(그림 1A)12. 이 방법은 간단한 동결 해동 주기에 따라 lyse하도록 설계된 대장균 세포에 의존합니다. 세포는 세포 벽을 저하파 람다에서 endolysin을 표현합니다. 세포가 성장함에 따라, 이 내용신은 세포벽에서 격리된 세포질에 남아 있습니다. 그러나, 간단한 동결 해동 주기는 세포질 막을 방해하고, 세포벽을 저하시키는 주변으로 내실신을 풀어, 급속한 세포 용해의 결과로. 프로토콜은 몇 시간 동안 실습작업으로 완료할 수 있으며 30,000g의 × 수 있는 원심분리기(최적의 결과를 위해; 더 낮은 속도)만 필요하며, 더 낮은 속도는 펠릿을 방해하지 않도록 더 많은 주의를 기울여 사용할 수 있으며, 소용돌이 믹서 및 간단한 버퍼 솔루션이 필요합니다. 기능성 용액은 세포를 동결 건조시키고 현장에서재수화하여 생산될 수도 있습니다. 그러나,이 방법은 낮은 활성으로 lysates를 생성, 아마도 나머지 세포 파편으로 인해.

용액은 세포 없는 유전자 발현을 위해 높게 활동적이며, 최종 사용에 따라 다양한 방법으로 향상될 수 있다. 단백질 합성의 속도는 표준 스핀 농축기사용으로 용액을 집중시킴으로써 더욱 증가할 수 있다. 선형 DNA는 정제된 GamS 단백질을 첨가하여 분해로부터 보호될 수 있습니다. 진동과 같은 더 복잡한 회로 역학에 필요한 단백질 분해는 자동 분해 생성균주(13)에서ClpX hexamer를 공동 발현함으로써 달성될 수 있다. 마지막으로 LacZ 기반 의 시각적 판독은 lacZ가부족한 자동 리세이트 스트레인을 사용하여 활성화됩니다. 전반적으로,이 방법은 응용 프로그램의 넓은 범위에 적합한 고도로 활성 세포 없는 용액을 생성합니다.

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프로토콜

1. 미디어 및 버퍼를 준비합니다.

  1. 2xYTPG 매체를 준비합니다.
    1. 혼합 62 g 2xYT 분말, 5.99 g 인산염 모노 베이직, 13.93 g 칼륨 인산염 디베이직, 그리고 2 L에 탈이온 된 물.
    2. 30 분14의노출 시간으로 액체 사이클에 자동 클캐브.
    3. 1.1.2에서 2xYTP 매체의 400mL에 7.2g D-포도당(덱스트로스)을 넣고 용해될 때까지 섞는다.
    4. 0.2 μm 필터를 통해 필터 살균.
  2. S30A 버퍼를 준비합니다.
    1. 트리스-HCl(pH 7.7, 50m M 최종 농도), 글루타민칼 칼륨(60mM 결승), 글루타민산마그네슘(14m M 결승)을 혼합한다.
    2. 10M KOH를 사용하여 pH를 7.7로 조정합니다.
  3. 솔루션 1을 준비합니다(표 1참조).
    1. 4-(2-하이드록세틸)-1-파이펫라진에탄황포닉산(HEPES)을 2mL의 물로 재차 장매한다.
    2. KOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다.
    3. 표 1에서다른 모든 구성 요소를 추가합니다.
    4. 10M KOH를 사용하여 pH를 7.6으로 조정합니다. 필터 살균.
  4. 2.5배 프리믹스 용액을 준비합니다(표 2참조).
    1. 표 2의모든 구성 요소를 혼합합니다.
    2. KOH를 사용하여 pH를 7.5로 조정합니다.
    3. 알리쿼트와 동결 -80 °C.
      참고: 20 μL 반응은 8.9 μL의 프리믹스를 사용합니다.

2. 셀을 준비합니다.

  1. 자동 용해 세포를 접종 루프를 사용하여 50 μg/mL 암피실린을 포함하는 LB 천판에 줄이며 37 °C에서 자랍니다(참고 1 참조).
  2. 파이펫 팁을 사용하여 LB/암피실린 배지의 스타터 배양으로 단일 콜로니를 선택하고 하룻밤 사이에 37°C에서 자랍니다.
  3. 400 μg/mL 암피실린을 함유한 2xYTPG 배지의 400mL를 스타터 배양 400μL로 함유하고, 1L 에렌마이어 플라스크에서 37°C로 성장하여 300rpm에서 흔들어진다.
  4. 분광광계를 사용하여 600nm(OD600)에서배양의 광학 밀도를 주기적으로 측정하여 1cm 경로 길이의 광학 큐벳을 읽습니다. OD600이 1을 초과하면 측정전에 배양 5배를 희석하여 측정이 일반적인 실험실 분광광계의 선형 범위 내에 유지되도록 하십시오. 5배 희석 배양이 0.3의 OD600에 도달할 때까지 세포를 계속 성장시한다(배양 OD600 의 1.5).

3. lysate를 준비합니다.

  1. 2mM 디티오스리톨(DTT)으로 보충된 S30A 버퍼를 준비합니다. S30A 버퍼 3mL과 DTT 스톡 용액 6μL을 1M. 얼음 위에 놓아 3.7단계에서 사용할 수 있습니다.
  2. 실온에서 15 분 동안 1800 × g에서 원심 분리하여 세포를 수확하십시오.
  3. 그것을 부어 남은 액체를 제거하기 위해 파이프를 사용하여 상체를 폐기하십시오.
  4. 소용돌이 믹서를 사용하여 45mL의 감기(4-10°C) S30A 버퍼에서 펠릿을 재연한다.
  5. 빈 50mL 원심분리기 튜브의 무게를 측정하고, 세포를 체로 옮기고, 세포를 세척하기 위해 3.2-3.3 단계를 반복한다.
  6. 펠릿의 무게를 측정하여 빈 50mL 튜브의 무게를 뺍니다. 펠릿 중량의 정확한 측정을 보장하기 위해 나머지 수퍼네티를 신중하게 흡인하십시오.
    참고: 일반적인 수율은 생산 배양 400mL에서 세포 펠릿의 ~1.3 g입니다.
  7. 2mM 디티오트레이톨, 즉 1g의 세포 펠릿에 대해 2m의 완충제로 보충된 2부의 차가운 S30A 버퍼를 추가하고, 격렬하게 소용돌이 혼합에 의해 세포를 재연한다.
  8. 셀을 얼리게 합니다. 펠릿이 완전히 동결될 때까지 세포를 함유하는 50mL 튜브를 -20°C 또는 -80°C 냉동고에 놓습니다.
    참고 : 동결 단계는 하루에 좋은 정지 지점입니다.
  9. 실온 수조에서 세포를 해동하십시오.
  10. 2-3분 동안 소용돌이가 활발하게 일어났습니다.
  11. 37°C에서 300rpm에서 흔들리면 45분 동안 배양합니다.
  12. 4°C에서 45분 동안 30,000g ×의 투명한 원심분리기 튜브에서 원심분리하여 무거운 세포 이물질의 샘플을 치웁울 수 있습니다.
    참고: 30,000 x g의 원심분리기를 사용할 수 없는 경우, 원심분리기는 21,000g에서 45분 ×, 펠릿이 덜 컴팩트하기 때문에 3.13단계에서 추가주의를 사용합니다.
  13. 상체를 파이프로 새 튜브로 조심스럽게 옮기고 펠릿을 가능한 한 방해하지 않도록 하십시오. 이송된 상체가 펠릿으로부터 의 물질로 오염되면 이전 단계를 반복한다.
  14. 상체를 1.5mL 원심분리기 튜브및 원심분리기를 다시 한 번 21,00 ×0g(또는 탁상 원심분리기의 최대 속도)에서 5분 간 전송합니다.
  15. 클리어된 자동 리세이트를 원하는 볼륨으로 알리쿼트하여 나머지 펠릿을 조심스럽게 피하고 -80°C에서 동결하거나 즉시 사용하십시오.
    참고: 단일 20 μL 반응은 자동 lysate의 8 μL을 사용합니다.

4. 세포 없는 유전자 발현

참고: 자동 lysate는 이제 원하는 최종 사용에 대한 준비가 되었습니다. 다음은 세포없는 유전자 발현을 위한 예예 표준 프로토콜이다.

  1. 20 μL 반응의 경우 자동 lysate의 얼음 8 μL과 프리믹스8.9 μL을 섞습니다. 마그네슘 글루타민산염 및 PEG 8000 농도의 최적화에 관한 프로토콜 섹션의 끝에 있는 참고를 참조하십시오.
  2. DNA(예를 들어, pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500을 최종 농도8 nM에), 기타 시약 및 물을 20 μL에 추가합니다.
  3. 384웰 마이크로 플레이트에 반응을 배치하고 플레이트 판독기를 사용하여 형광 시간 과정 및/또는 엔드포인트를 측정합니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)의 경우 485 nm의 흥분 파장과 520 nm의 방출 파장을 사용합니다.

5. 프로토콜 수정

참고: 프로토콜을 다음수정하면 다른 응용 프로그램에 서비스를 제공할 수 있습니다.

  1. 선형 DNA 템플릿을 사용하여 세포 없는 유전자 발현
    1. 4절에서 단계를 수행하여, 선형 DNA를 첨가하기 전에 2.2 μM 정제 된 GamS 단백질 (설명된12과같이 표현 및 정제)으로 반응을 보충한다.
  2. 단백질 분해를 통합한 세포 없는 유전자 발현
    1. 단계 2.1에서, 플라스미드 pACYC-FLAG-dN6-His를 포함하는 자동 용해 세포를 사용합니다(재료의 표참조). 모든 성장 매체에는 34 μg/mL 클로람페니콜이 추가로 포함됩니다.
    2. 단계 2.3에서, 플라스미드로부터 발현을 유도하기 위해 성장 배지에서 40 μM 이소프로필 β-D-1-티오갈라크토피라노사이드(IPTG)를 포함한다.
    3. 반복 단계 3.2-3.4 (세척) 2 회 추가 시간 (총 3 개의 세척에 대 한) 클로람페니콜의 완전 한 제거를 보장 하기 위해, 변환 억제제. 처음 두 번의 세차(3.4단계)의 경우 인산염 완충식식염(pH 7.4)으로 S30A 버퍼를 대체한다.
    4. 4.2단계에서는 추가 3m ATP(물 100m ATP의 스톡 용액, pH 7.2) 및 4.5m 마그네슘 글루타메이트(물 내 1M 스톡 용액 사용) (최종 농도)를 추가하여 ClpXP의 높은 ATP 사용과 마그네슘의 첼레이션을 보완합니다.
  3. LacZ 기반 판독값(색상 측정 포함)을 사용하여 세포 없는 유전자 발현
    1. 2.1 단계에서 기본적으로 LacZ를 발현하지 않는 자동 용해 셀을 사용합니다(재료표참조).
  4. 또는 동결 건조 된 세포에서 직접 lysate를 준비하십시오.
    1. 1.1에서 3.7까지의 모든 단계를 수행합니다.
    2. 셀 서스펜션 8μL을 8.9 μL의 프리믹스와 혼합합니다.
    3. 플라스미드 DNA(원하는 경우), 다른 사용자 지정 시약 및 물을 추가하여 최종 부피 인 20 μL에 도달합니다.
    4. 반응을 384웰 마이크로 플레이트로 옮기고 동결 건조시합니다.
      참고: 동결 건조 시료는 최대 1주일 이상 보관할 수 있습니다.
    5. 반응을 시작하려면 원하는 DNA 또는 기타 시약으로 보충된 18 μL의 탈수로 수분을 보충합니다.
    6. 플레이트 리더의 형광 역학을 따르십시오.

참고 1: 자동 용해 세포는 동결 해동 주기에 용해되도록 설계되므로 동결 된 주식을 만들 때 냉동 보호제를 사용하는 것이 특히 중요합니다. 우리는 24 % wt / vol 글리세롤에 주식을 동결하고 -80 ° C에 저장합니다.

참고 2: 마그네슘 이온과 PEG 8000은 용해 성능에 매우 중요합니다. 이전에 발표된 데이터를 기반으로 한 기본 2.5배 프리믹스에는 최종 반응에서 각각 2.4mM및 1.9%가 되는 6m 마그네슘 글루타민산염과 4.8%의 wt/vol PEG 8000이 포함되어 있습니다. 여기에 프로토콜로 준비 된 자동 lysate는 일반적으로 추가와 함께 가장 잘 수행 5 mM Mg-글루타민산염 과 1.5% PEG 8000 최종 반응에. 그러나, 이것은 추가 0-10 mM Mg 글루타민산염및 추가 0-3% PEG 8000 (베이스 프리믹스에 비해)의 범위에서 최적화될 수 있다. 권장 5m Mg-글루타민트와 1.5% PEG 8000(최종 농도)으로 프리믹스를 준비하려면 프리믹스 380 μL과 1M에서 마그네슘 글루타메이트 4.75 μL, PEG 8000의 36.1 μL을 40% 무게/부피로 혼합합니다.

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결과

대표적인 결과는 자동 분해를 사용하여 플라스미드를 구성하는 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1-deGFP-T500으로부터 GFP를 발현하고, 플레이트 판독기에서 GFP 형광의 시간 과정을 기록함으로써 관찰될 수있다(도 1B). 플라스미드 DNA의 희석 시리즈는 1 nM DNA에서도 강한 표정을 찾아냈습니다. 시판되는 용액에 비해, 자동 은 더 큰 총 수율을 생성하고 GFP 시간 과정(그림 1C,D)의시간 유도체로 계산, 더 큰 최대 생산 속도를 달성 할 수 있습니다. 이 방법을 사용한 추가 결과는 Didovyk 외12를참조하십시오. 이 프로토콜에는 실패 지점이 상대적으로 적습니다. 그러나 자동 lysate가 세포 이물질을 충분히 지워내지 못하면 최적이 아닌 결과를 얻을 수 있습니다. 최적의 결과는 또한 LYSate의 각 배치에 대해 PEG-8000...

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토론

여기서 설명된 프로토콜은 세포 없는 유전자 발현을 위한 고활성 세균용 용액 용액을 산출한다. 핵심은 람다 파지 내질심을 세포화로 표현하는 플라스미드 pAD-LyseR을 운반하는 세포를 사용하는 것입니다. 이 세포는 내부 막의 투과화시 스스로 를 용해하기 위해 강력하게, 세포 벽에 내달리신 접근을 허용, 이는 방법은 간단한 동결 해동 주기를 통해 달성. 세포가 효과적으로 자신을 lyse 하기 때문에, 제품은 자동 lysate라고합니다. 세포가 용해 된 후, 유일한 남은 단계는 세포 파편의 자동 lylysate를 취소하는 배양 및 원심 분리입니다.

세균용 용액을 생산하는 다른 방법에 비해, 이 방법은 특히 간단하고 빠른, 그러나 그것은 lysate의 품질을 희생하지 않습니다. 프로토콜은 생산 문화를 접종 한 후 8-9 h로 완료 할 수 있으며 1-2 시간의 실습 노동만 가능합니다. 분자 생물학 실험실에 대한 전적으로 표준이 아닌 유일한 권장 장비는 30,000 × g를

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공개 사항

J.H.는 암 치료제에 중점을 둔 GenCirq Inc.의 공동 창립자입니다. 그는 이사회에 있으며 GenCirq에 지분을 보유하고 있습니다.

감사의 글

저자는 재커리 선과 리처드 머레이 (캘리포니아 공과 대학)에게 플라스미드 P_araBAD-gamS를 친절하게 제공한 것에 대해 감사하고, 카메이 가에코(교토 공과대학)는 고속 냉각 원심분리기를 친절하게 제공합니다. 이 작품은 국립 보건원과 ARO MURI 프로그램의 보조금에 의해 지원되었으며, 일본 MEXT 우수 젊은 연구자(MEXT)를 위한 선도적인 이니셔티브에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2xYT 매체EMD Millipore4.85008또는 동급
3-PGASigma AldrichP8877또는 동급
Amicon Ultra-15 원심 필터 장치, 3kDa 차단Millipore SigmaUFC900308옵션, 용해물을 농축하는 데 사용할 수 있으며 농축할 부피에 적합한 농축기 용량을 선택하고
암피실린Sigma Aldrich를 농축할 수 있습니다.A0166-5G또는 카르베니실린, 보다 안정적인 변형
ATP시그마 알드리치A8937또는 동급
cAMP시그마 알드리치A9501또는 동급
CoA시그마 알드리치C4282또는 동급
CTPUnited States Biosciences14121또는
동급 D-글루코스(덱스트로오스)Fisher ScientificAAA1749603또는 등가의
디티오트레이톨(DTT)시그마 알드리치(AldrichD0632-1G또는 동급의
대장균 BL21-Gold(DE3) 운반pAD-LyseRAddgene99244
대장균 BL21-Gold(DE3) Δ lacZ, pAD-LyseR, Addgene99245
Folinic acidSigma, AldrichF7878또는 동급
GTPUnited States Biosciences,16800또는 동급
의 HEPES,Sigma, AldrichH3375-25G또는 동급의
LB 매체Fisher ScientificDF0446075또는 동급
마그네슘 글루타메이트Sigma Aldrich49605-250G또는 동급
NADSigma AldrichN6522또는 동급
글루타민산칼, Sigma AldrichG1501-100G또는 동급
수산화칼륨(KOH),pH 조정용Sigma Aldrich221473-25G
인산칼륨, 이염기성Fisher ScientificBP363-500또는 동급
인산칼륨 일염기Fisher ScientificBP362-500또는 동급
스페르미딘시그마 알드리치85558또는 동급
Tris-HCl, Fisher Scientific9310500GM또는 동급의
tRNA 믹스Roche10109541001또는 동급의
UTPUnited States Biosciences23160또는 동급의
) , , , , , , , , , 의 의 , 의 륨의 , 의성 의 의 , ,

참고문헌

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