Method Article

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

DOI:

10.3791/62762

⸱

July 21st, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 GST 융합 TPR 모티프 공동 샤페론과 Hsp90 유래 펩타이드와 결합 된 수용자 구슬과 글루타티온 연결된 기증자 구슬을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 조사하는 기술을 제시합니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 기술을 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

열 충격 단백질(Hsp90)-코차페론 상호작용을 대상으로 하면 Hsp90 의존성 세포내 공정을 구체적으로 조절할 수 있습니다. Hsp90의 C-terminus에서 보존된 MEEVD 펜타펩타이드는 공동 샤페론의 테트라트리코피타이드 반복(TPR) 모티프와의 상호 작용을 담당합니다. FK506 결합 단백질 (FKBP) 51 및 FKBP52는 다른 기능을 가진 스테로이드 호르몬 의존성 질병에 관여하는 두 개의 유사한 TPR-motif 공동 샤페론이다. 따라서, Hsp90과 FKBP51 또는 FKBP52 사이의 상호 작용을 구체적으로 차단하는 분자를 식별하는 것은 몇몇 인간 적인 질병을 위한 유망한 치료 잠재력을 제공합니다. 여기에서는 Hsp90과 파트너 공동 샤페론 FKBP51 및 FKBP52 간의 상호 작용을 조사하기 위해 증폭된 발광 근접 성 균질 분석에 대한 프로토콜을 설명합니다. 먼저, 글루타티온 S-transferase(GST) 태그형태로 TPR 모티프 함유 단백질 FKBP51 및 FKBP52를 정제했습니다. GST 융합 TPR 모티프 단백질과 Hsp90의 10-mer C-말단 펩타이드와 결합된 수용자 구슬을 곁들인 글루타티온 연계 기증자 구슬을 사용하여 동질적인 환경에서 단백질 단백질 상호 작용을 조사했습니다. 우리는 Hsp90-FKBP51 또는 Hsp90-FKBP52 상호 작용을 중단하기 위하여 작은 분자를 스크린하기 위하여 이 분석기를 사용하고 강력하고 선택적인 Hsp90-FKBP51 상호 작용 억제제를 확인했습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분자 샤페론은 단백질 접이식, 수송 및 저하를 포함한 단백질 항상성에 기여합니다. 그(것)들은 몇몇 세포 프로세스를 통제하고 암과 신경 퇴행성 질병1과같은 수많은 질병에 연결됩니다. 열 충격 단백질 90 (Hsp90)은 ATP 가수 분해에 의해 구동되는 형태 변화에 의존하고 공동 샤페론2에의해 매개 되는 클라이언트 단백질과 결합하는 가장 중요한 chaperones 중 하나입니다. 치료 대상으로 Hsp90의 명백한 잠재력에도 불구 하 고, 그것의 기능을 미세 조정 하는 것은 큰 도전을 나타냅니다. 임상 시험에서 평가된 N단 ATP 결합 영역을 대상으로 하는 여러 Hsp90 억제제가 있지만, 그 중 어느 것도 마케팅3에대해 승인되지 않았습니다. 잘 정의 된 리간드 바인딩 포켓4의부족으로 인해 Hsp90의 C-말단 영역을 대상으로한 성공 4. 최근, 작은 분자에 의한 Hsp90-cochaperone 상호 작용의 중단은 대체 전략5로조사되고 있다. Hsp90-cochaperone 상호 작용을 표적으로 하는 것은 일반적인 세포 응력 반응을 이끌어 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 이 프로토콜에 대한 개요는 그림 2에표시됩니다.

1. GST-FKBP51 및 GST-FKBP52의 발현 및 정제(그림 2A)

  1. 플라스 미드
    참고: 이미지 컨소시엄에서 인간 FKBP51(클론 id: 5723416)과 인간 FKBP52(클론 id: 7474554)용 cDNA 클론을 획득합니다.
    1. 인간 FKBP51 DNA를 프라이머로 PCR으로 증폭(앞으로 5'GGATCCATGACTGATGAAGGT-3', 역전; 5'CTCGAGCTATTTGTCTCTCCAC-3') BamHI 및 XhoI 오버행 및 복제를 포함 한 BamHI / XhoI 제한 부위.
    2. 인간 FKBP52 DNA를 프라이머로 PCR으로 증폭(앞으로 5'-GAATTCATGACAGGAGATG-3', 역전; 5'-CTCGAGCTATGCCTCTCTCCAC-3') 에코리와 호이 오버행 및 에코리/XhoI 제한 부위에서 pGEX6-2 벡터로 클론을 함유하고 있습니다.
      참고: PCR 반응 설정 및 조건표 1 및 표 2에표시됩니다.
      3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분석에서 Z의 요인과 S/B 비율은 각각 0.82 및 13.35입니다(그림 3A),우리의 분석이 높은 처리량 스크리닝에 강력하고 신뢰할 수 있음을 보여줍니다. 그런 다음 작은 분자 질량 화합물을 검사하는 데 사용했습니다. 도 3B는 선택된 소분자(D10)와 의아페론-코카페론 상호작용의 투여 의존억제를 제시한다. D10에 대한 용량 반응 곡선은 IC50의 값이 계산되는 것을 기반으로 비선형 회귀 분석에 의해 생성됩니다. D10은 Hsp90 - GST-FKBP51 및 Hsp90 - GST-FKBP52 PPI에 대한 용량 의존적 억제를 보여줍니다. 그러나 IC50의 값은 다르다 : HSp90에 대한 IC50 - GST-FKBP51 상호 작용은 65 nM, 반면, Hsp90 - GST-FKBP52 상호 작용, 완전한 억제는 가장 높은 화합물 농도 (100 μM)로 달성되지.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 우리는 Hsp90과 TPR 모티프 공동 샤페론, 특히 FKBP51 및 FKBP52 사이의 상호 작용을 억제하는 작은 분자를 선별하기위한 분석방법을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 높은 Z 점수(>0.8)는 높은 처리량 형식의 견고성과 신뢰성을 보여줍니다. 결과는 1 시간 안에 얻을 수 있고, 구슬, 단백질 및 화합물의 소량이 요구됩니다. 또한,이 프로토콜은 쉽게 관심의 TPR 모티프 공동 샤페론 상호 작용 - 모든 Hsp90 / Hsp70로 확장 될 수있다. Hsp90의 몇몇 TPR-motif 공동 chaperones는 알츠하이머 병에서 자가 면역 질병, 암 등에 구역 수색하는 각종 인간적인 무질서에 연루되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 높은 의학적 중요성의 chaperone-cochaperone 상호 작용을 억제하는 작은 분자의 높은 처리량 검열을 위한 시험관 내 견고하고 저렴한 분석기를 제공합니다.

또한, TPR 도메인을 대상으로 하고 Hsp90과의.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충을 보고합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 스웨덴 연구 위원회 (2018-02843), 브레인 재단 (Fo 2019-0140), 카롤린스카 연구소, 건보르 및 요제프 아네스 재단, 매그너스 베르그발스 재단, 총 및 베르틸 스네스 재단, 토레 닐스 재단, 올드 아펠라 재단, 토르 닐스 재단의 보조금에 의해 지원되었다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
384웰 플레이트Perkin Elmer6008350분석 용량: 25ml
Amicon 10.000MWCO 원심분리 장치, MilliporeUFC901008농축 단백질
AmpicillinSigmaA0166항생제
박테리아 쉐이커, Unimax 1010Heidolph배양 박테리아
cDNA 클론 인간 FKBP51출처: BioScience클론 ID : 5723416pCMV-SPORT6 벡터
cDNA 클론 인간 FKBP52출처 BioScience클론 ID : 7474554pCMV-SPORT6 벡터
화학적으로 유능한 대장균InvitrogenC602003One Shot BL21 Star (DE3)
데이터 분석 소프트웨어GraphPad Prism9.0.0분석 데이터 및 수치 만들기
데이터 분석 소프트웨어Excel분석 데이터
DMSOSupelco1.02952.1000희석 화합물
DPBSGibco14190-144용액 준비
EDTACalbiochem344504초음파 처리 중 단백질 가수 분해 방지
글루타티온SigmaG-4251용리 GST 태그 단백질
글루타티온 공Perkin Elmer6765300공여체 비드
GST-트랩 컬럼Cytiva (GE Healthcare)17528201GST 태그 단백질
정제 이소프로필-&베타;-D-티오갈락토시드Thermo Fisher ScientificR0392단백질 발현 유도
LB Broth (Miller)SigmaL3522미생물 성장 배지
PCR 기기BIO-RADS1000 Thermal Cycler증폭/PCR
PD-10 컬럼Cytiva (GE Healthcare)17085101솔루션 교환
pGEX-6P-1 벡터Cytiva (GE Healthcare)28954648플라스미드
pGEX-6P-2 벡터Cytiva (GE Healthcare)28954650플라스미드
플레이트 리더Perkin ElmerEnSpire 2300 멀티 라벨 리더알파 플레이트
리더 소프트웨어Perkin ElmerEnSpire Manager플레이트 리더
소프트웨어 플레이트 리더 소프트웨어 프로토콜Perkin ElmerAlpha 384-well Low volume이 프로토콜을 사용하여 플레이트 판독
PMSFSigmaP7626초음파 처리 중 단백질 분해 방지
단백질 분해 억제제 칵테일SigmaS8830초음파 처리 중 단백질 분해 방지
아지드 나트륨시그마S2002방부제로
시아노보로하이드라이드 나트륨 (NaBH3CN)시그마156159
인간 Hsp90 베타 이성질체 펩타이드 2.0 10708976001 inc의 아미노산 714-724에 해당하는 10 개의 아미노산 펩타이드 NH2-EDASRMEEVD-COOH
수용체 비드의 미반응 부위 차단
Tween-20SigmaP1379비드 응집 방지
울트라 원심분리기 Avanti J-20 XPBeckman Coulter박테리아 세포 펠릿을 얻기 위한 원심분리기
초음파 세포 교란기MicrosonSonicate 세포로 단백질을 방출하지
않음 접합 수용체 비드Perkin Elmer6762003수용체
비드 XCell SureLock 미니 셀 및 XCell II 블롯 모듈InvitrogenEI0002SDS-PAGE
, , , , , 여체 비드 를 결합하기위한 매트릭스를 활성화합니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chaperone Cochaperone InteractionsHsp90 InteractionsFKBP51 InhibitionFKBP52 InhibitionBead Based AssayHigh Throughput ScreeningProtein Protein InteractionTPR MotifSmall Molecule ScreeningIC50 Determination

Related Articles