이 백서는 Cryo-EM 실험을 위한 플런지 동결 전에 70°C의 높은 온도에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 실험을 위한 샘플 그리드는 일반적으로 생물학적 시료 보관에 최적의 온도(대부분 4°C, 때로는 실온)에서 준비됩니다. 최근에 우리는 저온에서 해결된 단백질 구조가 특히 고온성 고세균의 단백질에 대해 기능적으로 관련이 없을 수 있음을 발견했습니다. Cryo-EM 분석을 위해 더 높은 온도(최대 70°C)에서 단백질 샘플을 준비하는 절차가 개발되었습니다. 우리는 더 높은 온도에서 준비된 샘플의 구조가 기능적으로 관련이 있고 온도에 의존한다는 것을 보여주었습니다. 여기에서는 55°C를 예로 들어 고온에서 샘플 그리드를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 실험은 추가 원심분리 튜브를 사용하여 변형된 유리화 장치를 사용하여 샘플을 55°C에서 배양했습니다. 세부 절차는 증기 응축을 최소화하고 그리드에 얇은 얼음 층을 얻기 위해 미세 조정되었습니다. 성공한 실험과 실패한 실험의 예가 제공됩니다.
서론
단백질 복합체의 구조를 해결하기 위한 Cryo-EM 기술은 특히 고해상도 구조 1,2를 얻는 방향으로 지속적으로 개선되었습니다. 한편, 유리화 공정3 이전에 pH 또는 리간드와 같은 샘플 조건을 변경하여 적용 범위가 확장되었으며, 여기에는 샘플 그리드 준비 후 플런지 동결 4,5가 포함됩니다. 또 다른 중요한 조건은 온도입니다. X선 결정학과 같은 Cryo-EM 실험은 저온에서 수행되지만 Cryo-EM으로 해결된 구조는 유리화 전 용액 상태의 구조를 반영합니다. 최근까지 대부분의 단일 입자 분석(SPA) Cryo-EM 연구는유리화6 전에 얼음 위(즉, 4°C)에 보관된 샘플을 사용하지만 많은 연구에서 약실온 7,8,9,10 또는 최고 42°C에서 샘플을 사용합니다
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프로토콜
참고: 이 프로토콜은 수정된 상업용 유리화 장치를 사용하여 특정 온도, 특히 37°C 이상의 온도에서 초저온 전자 현미경(cryo-EM) 샘플을 준비하는 것을 목표로 합니다. 전체 실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다. 프로토콜은 55°C를 예로 사용합니다. 다른 온도에서의 특정 조건은 참고자료12의 보충 표 2를 참조하십시오.
1. 유리화 장치의 제조
- 닫힌 끝의 1mL 원심분리 튜브에 50cm 구멍을 뚫습니다.
- 그림 2와 같이 초음파 물 배출구의 유리화 장치 챔버에 튜브를 놓습니다.
알림: 목적은 전체 챔버에 도달하기 전에 튜브를 통해 열교환기로 수증기를 유도하여 수분 응결을 최소화하는 것입니다. - 유리화 장치 온도를 지정된 온도(예: 그림 3과 같이 55°C)로 설정하고 유리화 장치 챔버가 55°C 및 100% 상대 습도에 도달하도록 합니다. 실험을 시작하기 전에 조건을 안정화하기 위해 적어도 30 분 동안 그대로 두십시오.
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결과
저배율 개요는 그림 5A, B에 나와 있습니다. 패널 A는 성공적인 그리드의 예입니다. 왼쪽 위 (두꺼운)에서 오른쪽 아래 (더 얇거나 비어 있음)까지 얼음 그라데이션이 있습니다. 이러한 그리드는 청색 및 녹색 박스와 같은 데이터 수집에 적합한 중간 영역에서 적절한 두께의 얼음층을 쉽게 찾을 수 있게 한다. 그리드 B가 너무 건조합니다. 그리드의 사각형은 밝은 대비를 가지며, 이는 얼음 층이 너무 얇거나 얼음 층이 전혀 없음을 의미합니다. 빨간색 화살표로 표시된 두 개의 사각형만 데이터 수집에 적합합니다.
또한 다양한 그리드의 저선량 이미지의 예가 그림 5C, D에 나와 있습니다. 패널 C의 이미지는 대부분의 얼음이 결정 형태이며 데이터 수집에 적합하지 않음을 보여줍니다. 한편, 패널 D의 이미지는 얼음층이 대부분.......
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토론
프로토콜의 1단계에서 원심분리기 튜브가 잘 설치되었고 실험이 진행 중일 때 떨어지지 않는지 확인하십시오. 챔버에 많은 수의 물방울이 축적되어 여과지의 흡착 용량을 변경할 수 있기 때문에 유리화 장치 챔버가 평형 온도에 도달 한 후 실험의 전체 시간이 30 분을 초과하지 않는 것이 좋습니다. 작동 시간이 30분을 초과하면 작업자는 여과지를 교체하고 캐빈이 온도와 습도의 균형을 다시 맞출 때까지 기다려야 합니다. 프로토콜의 8단계에서 제안된 샘플 부피 7-9μL는 평소보다 크며, 그렇지 않으면 샘플이 고온에서 빠르게 증발하여 그리드에 빈 사각형이 생기기 때문입니다. 반면에 적용된 샘플은 9μL를 초과하지 않는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 블로팅하기 전에 핀셋을 움직이는 과정에서 샘플이 떨어질 가능성이 매우 높습니다. 전반적으로이 기술의 성공 열쇠는 그리드를 안정적이고 빠르게 파악하고 각 시간 제한 작업을 정확하고 안정적으로 실행하는 것입니다. 또한 각 실험 라운드는 하나의 특정 고온만 처리하는 것이 좋습니다. 다른 온도에서 실험을.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 유용한 조언을 해준 Thermo Fisher Scientific의 Hervé Remigy 박사에게 감사드립니다. Cryo-EM 실험은 Academia Sinica Cryo-EM Facility(ASCEM)에서 수행되었습니다. ASCEM은 Academia Sinica(Grant No. AS-CFII-108-110) 및 대만 단백질 프로젝트 (보조금 번호. AS-KPQ-109-TPP2). 저자는 또한 샘플 준비에 도움을 준 Ms. Hui-Ju Huang에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 팔콘 튜브 | 팔콘 | 352070 | 크기: 50 mL |
| 여과지 | Ted Pella | 47000-100 | Ø 55/20mm, 등급 595 |
| HI1210 | Leica | 수조 | |
| K100X | 전자 현미경 과학 | 글로우 방전 | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu 그리드 | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | 저선량 이미징 |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot 핀셋 | 테드 펠라 | 47000-500 |
참고문헌
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al.
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재인쇄 및 허가
