방법 논문

라이브 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스 성장률의 정량적 분석

DOI:

10.3791/62778

⸱

2021년 7월 24일

 ,  ,  , 
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

이 논문에서

요약

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우리는 침수 된 문화와 고체 미디어 모두에서 필라멘트 곰팡이 A. nidulans의 성장 운동학을 캡처, 분석 및 정량화하기 위해 전송 된 빛 현미경 기술을 사용하여 라벨이없는 라이브 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있습니다.

초록

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주로 최면/균주 적 성장률의 변화에 의존하는 필라멘트 균류의 식민지 성장이 식민지 크기를 비교하여 고화된 미디어에 거시적으로 추정된다는 것이 잘 확립되어 있습니다. 그러나, 다른 환경/성장 조건(pH, 온도, 탄소 및 질소 원, 항생제 등)하에서 유전적으로 다른 곰팡이 균주 또는 균주의 성장 속도를 정량적으로 측정하는 것은 도전적이다. 따라서, 성장 운동학을 정량화하기 위한 보완적인 접근법의 추구는 곰팡이 세포 성장을 더 잘 이해하기 위해 필수적이다. 또한, 아스퍼질러스 스프를 포함한 필라멘트 균류는 고체 미디어 또는 침수 된 문화에 대한 공중 조건하에서 뚜렷한 성장과 차별화 모드를 가지고 있는 것으로 잘 알려져 있습니다. 여기서는 침수된 배양과 고체 매체 모두에서 라이브 이미징을 사용하여 모델 균주 아스퍼질러스 니둘란스의성장 운동학을 분석하기 위한 정량적 현미경 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 사용자의 사전 이미지 분석 전문 지식을 필요로하지 않는 방식으로, 오픈 소스, 바이오 이미지 (예를 들어, 피지)에 대한 무료 소프트웨어를 사용하여 재현 가능하고 신뢰할 수있는 방식으로 다른 곰팡이 균주의 성장 속도를 캡처합니다.

서론

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필라멘트 균류는 큰 사회 경제적 및 생태학적 중요성, 효소 및 항생제 생산을위한 산업 / 농업 도구로 모두 중요하다1,2 및 작물 식물3의병원균으로, 해충 곤충4 및 인간3. 더욱이, 아스퍼질러스 니둘란스와 같은 필라멘트 균류는 유전학, 세포 및 진화 생물학연구뿐만 아니라 최면 연장5의연구와 같은 근본적인 연구를 위한 모델 유기체로서 널리 사용된다. 필라멘트 균류는 연장 팁6에서막 지질 /단백질의 지속적인 공급과 세포벽의 드 노보 합성을 통해 길게 하는 매우 편광 된 유기체이다. 최면 팁 성장 및 극성 유지 보수의 중심적인 역할은 주로 사이토스켈레탈 성분과 골기6,7,8의편광 분포로 구성된 고도로 정렬된 구조인 'Spitzenkorper'(SPK)라는 특수 구조이....

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프로토콜

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1. 접종 준비

참고: 모든 단계는 라미나르 흐름 캐비닛 아래에서 수행해야 합니다.

  1. 멸균 접종 루프를 이용한 글리세롤 육수(-80°C)로부터, 최소 미디어(MM)의 플레이트에 스트레인 검사와 관련된 적절한 영양 요건으로 보충된 글리세롤 스톡(-80°C)으로부터 관심있는 곰팡이 균주를 줄무늬 [MM: 10.0g/L 포도당, 20mL/L 염용액:26g/L KCl, 26g/L KCl, 26g/L/Mg/Mg.L 76 g/L KH2PO4,2.0 mL/L 클로로폼) 및 1 mL/L 미량 원소(미량 원소: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4,8 g/L ZnSO4,800 mg/L MnSO4,800 mg/L FePO4),pH를 1M NaOH로 6.8로 조정하고, 1%(w/v) 한도및16및 오토클라브에 설명된 바와 같이 필요한보충제를1%로 추가하였다.
    참고: 소금 용액, 미량 원....

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결과

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이 프로토콜에 따라 필라멘트 균개 A. nidulans의다양한 성장/발달 단계에 해당하는 다양한 이미지를 캡처하고 분석했습니다. 이 연구에서 제시된 데이터는 피지 소프트웨어를 사용하여 처리되고 분석되었습니다. 측정은 판다, numpy, 통계 모델, matplotlib 및 seaborn과 같은 소프트웨어 라이브러리를 사용하여 상용 통계 소프트웨어 및 /또는 Python 프로그래밍 언어를 사용하여 그래프로 통계적으로 분석하고 준비한 csv 파일로 저장되었습니다. 자세한 내용은 인용된 원본 출판물에서 확인할 수 있습니다.

인구의 반응을 해석하기 위해서는, 인구 내의 주요 매개변수의 이질성을 결정하고 생리학적으로 구별되는 하위집단(28)을효율적으로 식별하는 것이 중요하다. 도 5는 아즈마크 ngnAΔ 돌연변이 균주, 2개의 유전자에서 베어링 삭.......

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토론

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시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 특정 약물 치료 및/또는 유전 적 개입이 시간이 지남에 따라 검출 가능한 세포 성장 또는 표현성 차이의 결과인지 여부를 실시간으로 정량적으로 정확하게 결정하는 강력한 접근법입니다.

본 연구에서는, 신뢰할 수 있는 살아있는 세포 이미징 방법론이 A. nidulans에서세균관및 최면 팁 성장의 역학을 포함하여 곰팡이 발달을 측정하고 정량적으로 분석하기 위하여 기술되었다. 전송된 빛 현미경 기술을 사용하여 시간이 지남에 따라 형태학적 변화를 모니터링하는 것은 스트레스, 죽거나 죽은 세포를 식별하는 데 매우 유용할 수 있습니다. 단세포 수준에서 이러한 동적 프로세스에 대한 상세한 지식은 세포의 혼합 인구 내와 오랜 관점에서 이질성을 평가할 수 있게 해주며, 세포가 내인성 및 환경 신호에 반응하는 경로 및 상세한 메커니즘의 식별을 허용합니다.

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 사업은 운영 프로그램 "경쟁력, 기업가 정신 및 혁신"(NSRF 2014-2020)의 자금 지원및 그리스와 EU의 공동 자금 지원을 통해 "연구 혁신 인프라 강화"(MIS)라는 "기초 생물학적 프로세스(BioImaging-GR)"(BioImaging-GR)를 시각화하고 모니터링하기 위한 그리스 연구 인프라"(MIS 5002755)의 프로젝트에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
&마이크로;-슬라이드 8 웰Ibidi80826이미징 슬라이드
4-아미노벤조산MerckA9878
azhAΔ ngnAΔ유전자형: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / 참고 문헌:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino AcidsGibco223030
BiotinMerckB4639
클로로포름Merck67-66-3
구리(II) 황산염 5수화물MerckC8027
GlucoseMerckG8270
GraphPad Prism 8.0GraphPad 소프트웨어통계 소프트웨어
ImageJNIH이미지 처리 및 분석 소프트웨어
접종 루프MerckI8263-500EA
Iron(III) phosphateMerck1.03935
Leica Application Suite XLeica Microsystems현미경 소프트웨어
: 황산 마그네슘 헵타 하이드레이트: Merck63138
망간 (II) 황산염 일 수화물: MerckM7899
현미경 Leica TCS SP8: Leica Microsystems
니코틴 아미드 (나이아신 아미드)Supelco47865-U
펩톤Millipore68971
미생물학 배양을 위한 페트리 접시KISKERG090
염화칼MerckP4504
인산칼륨 일염기성MerckP5655
피리독신 염산염MerckP6280
Quali - 마이크로 원심분리기 튜브, 1,7 mL, DNase-, RNase 및 발열원 무료, 멸균KISKERG052-S
Quali - 마이크로 원심분리기 튜브, 2.0 mL, 멸균KISKERG053-S
Quali - 표준 팁, 베벨, 100-1000 &마이크로; LKISKERVL004G
Quali - 표준 팁, 베벨, 1-200 &마이크로; LKISKERVL700G
Quali 마이크로볼륨 팁, DNase-, RNase free, 0,1-10 µ L/클리어KISKERGC. 팁. B
리보플라빈(B2)Supelco47861
메스 블레이드 NO. 11OdontoMed2011S2771
염화나트륨MerckS7653
수산화나트륨MerckS8045
사붕산나트륨 데카하이드레이트MerckS9640
VS151(PilA-GFP 및 H1-mRFP)유전자형: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / 참조:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT유전자형: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / 참고 문헌: TN02A3 -FGSC A1149
효모 추출물Millipore70161
ZnSO4
, 륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
  2. Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I.

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