이 프로토콜은 가래를 단일 셀 서스펜션으로 분리하고 표준 흐름 세포 측정 플랫폼에서 셀룰러 하위 집합의 후속 특성화를 결합하는 효율적인 방법을 설명합니다.
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방법 논문
유동 세포측정에 의한 품질 제어 가래 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
가래는 세포 함량 및 폐의 건강을 이해하기 위해 다른 미세 환경 적 특징을 연구하는 데 널리 사용되며, 전통적으로 세포학 기반 방법론을 사용하여 분석됩니다. 슬라이드를 읽는 데 시간이 많이 걸리며 고도로 전문화된 인력이 필요하기 때문에 유틸리티가 제한됩니다. 더욱이, 광범위한 파편과 너무 많은 편평상피 세포 (SEC) 또는 뺨 세포의 존재는 종종 진단을 위해 부적당한 견본을 렌더링합니다. 대조적으로, 유동 세포측정은 동시에 파편과 SEC를 제외하면서 세포 집단의 높은 처리량 phenotyping을 허용합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 단일 세포 현탁액, 항체 얼룩 및 세포 집단을 고치고, 유동 세포 측정 플랫폼에서 샘플을 획득하는 효율적인 방법을 설명합니다. 파편, 죽은 세포 (SE포함) 및 세포 이중제의 배제를 설명하는 게이팅 전략이 여기에 제시됩니다. 또한, 이 작품은 또한 조혈 및 상피 계보 하위 집합을 특성화하기 위해 분화(CD)45 양성 및 음수 집단의 클러스터를 기반으로 실행 가능한 단일 가래 세포를 분석하는 방법을 설명한다. 품질 관리 측정은 또한 견본이 폐에서 파생되고 타액이 아니라는 것을 기록으로 폐 특정 대식세포를 확인해서 제공됩니다. 마지막으로, 이 방법은 3개의 유동 세포계에서 분석된 동일한 환자에게서 가래 프로파일을 제공함으로써 상이한 세포측정 플랫폼에 적용될 수 있다는 것이 입증되었다; 나비오스 EX, LSR II 및 가사. 더욱이, 이 프로토콜은 관심의 추가 세포 마커를 포함하도록 수정될 수 있다. 유동 세포측정 플랫폼에서 전체 가래 샘플을 분석하는 방법이 여기에 제시되어 폐 질환의 고처리량 진단을 개발하기 위해 가래가 가능하도록 합니다.
서론
흐름 세포계의 하드웨어 및 소프트웨어의 기술적 발전으로 인해 많은 별개의 세포 집단을 동시에 식별할 수 있게 되었습니다1,2,3,4. 조혈 세포 연구에서 유동 세포계의 활용은 예를 들어, 면역 체계2및 조혈계의 세포 계층 구조에 대한 훨씬 더 나은 이해를 주도하고 있으며, 다양한 혈액암의 진단 구별을 이끌어 냈다6,7,8. 대부분의 가래 세포는 조혈 기원9,10,11이지만, 유동 세포분석은 진단 목적을 위해 가래 분석에 널리 적용되지 않았습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 가래에 있는 면역 세포 인구의 평가 (세포의 가장 중요한 부분 집합)가 천식과 ....
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프로토콜
가래 처리의 모든 단계는 적절한 개인 보호 장비와 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
1. 가래 해리를 시작하기 전에 시약 준비
- 1% 파라포름알데히드(PFA), 얼음 샘플당 25mL를 해동하고, 사용할 때까지 차갑게 유지하십시오.
주의: PFA는 흡입 및 피부 접촉에 의해 유독합니다. 제조업체의 지시에 따라 고정을 준비하고 사용할 때까지 25 mL 알리코에서 -20 °C에서 동결하십시오. - 시료의 중량을 근사화하고 2.2단계의 경우 0.1% 디티오트레이톨(DTT)을 충분히 해동하고 37°C로 가져온다. (DTT의 알리쿼트는 사용하기 전에 -20°C에 보관해야 합니다.)
- 2.2단계의 경우 최대 37°C까지 0.5% N-아세틸-L-시스테인(NAC)을 가져오십시오. (NAC는 매주 신선하게 만들어 사용하기 전에 4 °C에서 저장해야합니다.)
2. 가래 해리
- 가래 시료의 무게를 측정하여 해리 시약의 양을 결정합니다.
참고: 샘플은 초기 중량이 ≤3g인 경우, 중간체가 ≤3g인 경우, 중간체가 >3g이지만 ≤8g, >8하지만 ≤16g의 경우 크고, 샘플의 무게가 >16g인 경우 초대형으로 간주됩니다. 작은 표....
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결과
이 프로토콜은 임상 실험실 설정을 염두에 두고 개발되었습니다. 프로토콜을 개발하는 동안 초점은 단순성, 효율성 및 재현성에 있었습니다. 가래 처리에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계가 세포를 세는 것으로 나타났습니다. 따라서, 프로토콜은 가래 처리 및 세포 라벨링이 시간 손실 없이 세포 계산과 독립적으로 수행될 수 있는 방식으로 설정된다. 가려지지 않은 실행을 위해 시료를 적절히 희석하는 데 여전히 필요한 정확한 세포 수는 항체 라벨링 인큐베이션 기간 동안 얻을 수 있다.
이 프로토콜은 세포 수 대신 가래 중량 측정을 최적의 세포 라벨링에 사용할 항체/염료의 표시로 사용합니다. 그러나, 가래 샘플의 무게에 큰 정도의 변화가 있다; 분석된 126개의 샘플 중, 무게는 0.57g내지 38.30g까지 다양 하였다. 따라서 샘플은 네 가지 범주로 나뉘었다. 샘플의 중앙값은 작은 시료의 경우 2.1g, 중간 시료의 경우 5.0g, 대형.......
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토론
가래의 세포 함량은 광범위한 세포의 큰 다양성을 포함, 종종 파편을 많이 동반37. 또한, 가래 분석은 구강 대신 폐로부터 채취되는 시료를 확인하는 품질 관리를 필요로한다38. 따라서, 혈액, 예를 들어 훨씬 더 깨끗하고 균일한 세포 현탁액을 방출하는 혈액에 대한 것처럼 혈류 세포측정에 의해 가래를 분석하는 것은 간단하지 않다. 이 프로토콜은 이러한 모든 문제를 해결했습니다 : 가장 작은 세포 집단과 가장 큰 세포 집단을 모두 감지 할 수 있도록 특정 크기의 구슬을 사용하여 계측기 설정을 제공, 파편을 제거하기위한 게이팅 전략, 세포 덩어리, SEC 및 기타 죽은 세포를 오염, 마지막으로, 가래 샘플을 보장하기위한 품질 관리 조치는 주로 타액이 아닌 폐에서입니다.
스래텀을 작업하는 데 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 세포 수율은 프로토콜의 가래 해리 부분의 2.5 단계에서 사용되는 나일론 세포 .......
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공개 사항
모든 저자는 과거 또는 현재 의 생물 선호도 기술의 직원입니다.
감사의 글
데이비드 로드리게스가 피겨 준비를 해준 것에 대해 감사드립니다. 가래 샘플은 UT 헬스 샌안토니오 플로우 세포측정 공유 자원 시설에서 BD LSR II에서 실행되었으며, UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (UT Health의 CTRC) 및 UL1 TR001120 (CTSA 보조금)에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1% 파라포름알데히드 플로우 픽스 | Polysciences | 25037 | |
| 100 &마이크로; M 나일론 세포 여과기, Falcon #352360 | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 3 M NaOH | EMD | SX0593-1 | |
| 50 mL 원뿔형 팔콘 튜브 | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Alexa488 anti-human CD19 | BioLegend | 302219 | |
| Alexa488 anti-human CD3 | BioLegend | 300415 | |
| Alexa488 anti-human cytokeratin | BioLegend | 628608 | |
| Alexa488 PanCK, CD3 및 CD19 동형 | BioLegend | 400129 | |
| BV510 항인간 CD45 | BioLegend | 304036 | |
| CD66b FITC 동형 | BD Biosciences | 555748 | |
| CompBead Plus 보상 비드 | BD Biosciences | 560497 | |
| Corning 폴리스티렌 dispoable 멸균 병 250 mL | Fisher Scientific | 09-761-4 | |
| 코닝 폴리스티렌 일회용 멸균 병 500mL | Fisher Scientific | 09-761-10 | |
| CS& T 비즈 | BD Biosciences | 655051 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| FITC 항인간 CD66b | GeneTex | GTX75907 | |
| 고정 생존력 얼룩 | BD Biosciences | 564406 | |
| FlowCheck | Beckman Coulter | A69183 | |
| FlowSet | Beckman Coulter | A69184 | |
| HBSS | 피셔 사이언티픽 | 14-175-095 | |
| NAC | 시그마-알드리치 | A9165 | |
| NIST 비드, 05 μ M | Polysciences | 64080 | |
| NIST 비드, 20 μ M | Polysciences | 64160 | |
| NIST 비드, 30 μ M | Polysciences | 64170 | |
| PE 항인간 CD45 | BioLegend | 304039 | |
| PE-CF594 항인간 EpCAM | BD Biosciences | 565399 | |
| PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype | BD Biosciences | 562292 | |
| PE-CR594 BD | Biosciences | 564063 | |
| 구연산나트륨 이수화물 | EMD | SX0445-1 | |
| Trypan 블루 솔루션, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 |
참고문헌
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M.
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재인쇄 및 허가
