유동 세포측정에 의한 품질 제어 가래 분석

Summary

이 프로토콜은 가래를 단일 셀 서스펜션으로 분리하고 표준 흐름 세포 측정 플랫폼에서 셀룰러 하위 집합의 후속 특성화를 결합하는 효율적인 방법을 설명합니다.

Abstract

가래는 세포 함량 및 폐의 건강을 이해하기 위해 다른 미세 환경 적 특징을 연구하는 데 널리 사용되며, 전통적으로 세포학 기반 방법론을 사용하여 분석됩니다. 슬라이드를 읽는 데 시간이 많이 걸리며 고도로 전문화된 인력이 필요하기 때문에 유틸리티가 제한됩니다. 더욱이, 광범위한 파편과 너무 많은 편평상피 세포 (SEC) 또는 뺨 세포의 존재는 종종 진단을 위해 부적당한 견본을 렌더링합니다. 대조적으로, 유동 세포측정은 동시에 파편과 SEC를 제외하면서 세포 집단의 높은 처리량 phenotyping을 허용합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 단일 세포 현탁액, 항체 얼룩 및 세포 집단을 고치고, 유동 세포 측정 플랫폼에서 샘플을 획득하는 효율적인 방법을 설명합니다. 파편, 죽은 세포 (SE포함) 및 세포 이중제의 배제를 설명하는 게이팅 전략이 여기에 제시됩니다. 또한, 이 작품은 또한 조혈 및 상피 계보 하위 집합을 특성화하기 위해 분화(CD)45 양성 및 음수 집단의 클러스터를 기반으로 실행 가능한 단일 가래 세포를 분석하는 방법을 설명한다. 품질 관리 측정은 또한 견본이 폐에서 파생되고 타액이 아니라는 것을 기록으로 폐 특정 대식세포를 확인해서 제공됩니다. 마지막으로, 이 방법은 3개의 유동 세포계에서 분석된 동일한 환자에게서 가래 프로파일을 제공함으로써 상이한 세포측정 플랫폼에 적용될 수 있다는 것이 입증되었다; 나비오스 EX, LSR II 및 가사. 더욱이, 이 프로토콜은 관심의 추가 세포 마커를 포함하도록 수정될 수 있다. 유동 세포측정 플랫폼에서 전체 가래 샘플을 분석하는 방법이 여기에 제시되어 폐 질환의 고처리량 진단을 개발하기 위해 가래가 가능하도록 합니다.

Introduction

흐름 세포계의 하드웨어 및 소프트웨어의 기술적 발전으로 인해 많은 별개의 세포 집단을 동시에 식별할 수 있게 되었습니다1,2,3,4. 조혈 세포 연구에서 유동 세포계의 활용은 예를 들어, 면역 체계²및 조^혈계의 세포 계층 구조에 대한 훨씬 더 나은 이해를 주도하고 있으며, 다양한 혈액암의 진단 구별을 이끌어 냈다^6,7,8. 대부분의 가래 세포는 조혈 기원^9,10,11이지만, 유동 세포분석은 진단 목적을 위해 가래 분석에 널리 적용되지 않았습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 가래에 있는 면역 세포 인구의 평가 (세포의 가장 중요한 부분 집합)가 천식과 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)^12,13,14,15와 같은 질병을 진단 및/또는 모니터링하는 데 큰 도움이 될 수 있음을 시사한다. 더욱이, 유동 세포측정에 사용될 수 있는 상피 특이적 마커의 존재는 가래, 폐 상피 세포에서 세포의 다음 가장 중요한 부분 집합의 심문을 허용한다.

다른 조직 기원의 많은 뚜렷한 세포 집단을 분석하는 기능 이외에, 유동 세포계는 상대적으로 짧은 기간에 많은 수의 세포를 평가할 수 있다. 이에 비해 슬라이드 기반 의 세포학적 유형의 분석에는 고도로 전문화된 인력 및/또는 장비가 필요한 경우가 많습니다. 이러한 분석은 노동 집약적 일 수 있으며, 이는 분석되는 가래 샘플의 비율만으로 이어집니다¹⁶.

세 가지 중요한 문제는 유동 세포 측정에 가래의 광범위한 사용을 제한합니다. 첫 번째 문제는 가래 의 컬렉션에 관한 것입니다. 가래는 폐에서 구강으로 점액을 추방하는 허프 기침을 통해 수집되어 수집 컵에 침을 뱉습니다. 점액은 구강을 통과하기 때문에 SEC 오염의 가능성이 높습니다. 이 오염은 표본 분석을 복잡하게 하지만 이 연구에서와 같이 유동 사이토메트릭 플랫폼에서 문제가 쉽게 수정됩니다.

모든 사람이 자발적으로 가래를 생산할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서, 비침습적 방식으로 가래 수집을 지원하기 위해 여러 장치가 개발되었다¹⁷. 분무기는 이러한 장치 중 하나이며 신뢰할 수있는 가래 샘플^18,19,20을 생성하는 것으로 나타났습니다. 분무기는 비침습적으로 가래를 수집하는 매우 효과적인 방법이지만, 그 사용은 여전히 전문 인력이있는 의료 시설에서 설정이 필요합니다²¹. 대조적으로, 폐 플루트^22,23,24 및 아카펠라^16,25와 같은 핸드헬드 장치는 매우 사용자 친화적이기 때문에 집에서 사용할 수 있다. 이러한 보조 장치는 안전하고 비용 효율적입니다.

우리를 위해, 아카펠라는 폐 플루트¹⁶ 보다는 일관되게 더 나은 결과를 주었고, 그러므로, 아카펠라 장치는 가래 수집을 위해 선택되었습니다. 가래를 사용하기 위한 주된 목적은 폐암 검출 시험¹⁶을 개발하는 것이기 때문에 3일 수집 샘플이 결정되었다. 3일 샘플은 1일 또는 2일 샘플^26,27,28에 비해 폐암 검출 가능성을 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 다른 가래 수집 방법은 다른 목적을 위해 바람직할 수 있다. 상이한 가래 수집 방법이 여기에 기재된 것과 다른 가래 수집 방법이 사용되는 경우, 유동 세포 측정 분석에 사용되는 각 항체 또는 염료를 신중하게 적정하게 적정화하는 것이 좋습니다. 아주 작은 데이터는 다른 가래 수집 방법이 유동 세포측정을 위한 표적으로 한 단백질에 어떻게 영향을 미치는지에 유효합니다.

주로 유동 세포측정과 관련된 진단을 위한 가래사용에 대한 열정을 약화시키는 두 번째 문제점은 세포수이다. 문제는 신뢰할 수 있는 분석을 위한 충분한 실행 가능한 셀의 집합입니다. 두 가지 연구는 보조 장치의 도움으로 비 침습적 인 방법에 의해 수집 된 가래 샘플이 임상 진단 또는 연구 연구에서 활용할 수있는 충분한 실행 가능한 세포를 포함하고 있음을 입증^16,24. 그러나, 이러한 연구의 어느 쪽도 흐름 세포 측정에 관한 세포 수의 문제를 해결.

이 프로토콜에 대한 기초를 형성하는 연구를 위해, 가래 견본은 각 연구 사이트에 대한 승인된 기관 지침에 따라 폐암 개발을 위한 고위험에 참가자에게서 집합되었습니다. 고위험 참가자는 55-75 년 사이 정의 되었습니다., 훈제 30 팩 년 지난 15 년 이내에 흡연을 종료 하지 않은. 환자는 제조 업체의 지침에 따라 아카펠라 장치를 사용하는 방법을 보여주었다²⁹ 집에서 3 일 연속 가래를 수집. 샘플은 마지막 컬렉션까지 냉장고에 보관되었습니다. 마지막 수집 일에, 샘플은 냉동 차가운 팩과 함께 하룻밤 실험실로 배송되었다. 샘플은 수신된 날에 단일 세포 현탁액으로 처리되었습니다. 가래 수집의 이 방법을 사용하여, 믿을 수 있는 유동 세포 측정 분석을 위해 충분한 실행 가능한 세포이상을 얻습니다.

마지막으로, 이전 세포 번호 문제와 관련, 그 뮤추얼 환경에서 가래 세포를 방출하는 방법의 문제입니다. 세포는 어떻게 실행 가능한 유지하고 흐름 세포계를 막히지 않는 단일 세포 현탁액을 만들 수 있습니까? Pizzichini et ^al.30 및 Miller 외.³¹의 초기 작업을 기반으로, 이 프로토콜은 유동 세포 측정 분석에 적합한 단일 세포 현탁액으로 가래 처리를 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 유동 세포측정^32,33,34에 잘 확립된 가이드라인을 사용하여 가래에 있는 조혈 및 상피 세포를 식별하고 계측기 설정, 품질 관리 조치 및 유동 세포 측정 플랫폼에서 가래 분석을 표준화하는 분석 지침을 제공하기 위한 효율적인 항체 라벨링 전략을 개발했습니다.

Protocol

가래 처리의 모든 단계는 적절한 개인 보호 장비와 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

1. 가래 해리를 시작하기 전에 시약 준비

1. 1% 파라포름알데히드(PFA), 얼음 샘플당 25mL를 해동하고, 사용할 때까지 차갑게 유지하십시오.
   주의: PFA는 흡입 및 피부 접촉에 의해 유독합니다. 제조업체의 지시에 따라 고정을 준비하고 사용할 때까지 25 mL 알리코에서 -20 °C에서 동결하십시오.
2. 시료의 중량을 근사화하고 2.2단계의 경우 0.1% 디티오트레이톨(DTT)을 충분히 해동하고 37°C로 가져온다. (DTT의 알리쿼트는 사용하기 전에 -20°C에 보관해야 합니다.)
3. 2.2단계의 경우 최대 37°C까지 0.5% N-아세틸-L-시스테인(NAC)을 가져오십시오. (NAC는 매주 신선하게 만들어 사용하기 전에 4 °C에서 저장해야합니다.)

2. 가래 해리

1. 가래 시료의 무게를 측정하여 해리 시약의 양을 결정합니다.
   참고: 샘플은 초기 중량이 ≤3g인 경우, 중간체가 ≤3g인 경우, 중간체가 >3g이지만 ≤8g, >8하지만 ≤16g의 경우 크고, 샘플의 무게가 >16g인 경우 초대형으로 간주됩니다. 작은 표시, 중간, 큰 및 초대형 표시는 프로토콜 전체에 걸쳐 사용됩니다. 절단 및 라벨링에 필요한 시약의 양은 가래 샘플의 크기에 따라 다릅니다.
2. 작은 샘플을 깨끗한 50mL 원추형 튜브, 중간 시료를 깨끗한 250mL 플라스틱 일회용 병으로 옮기거나 크고 초대형 샘플을 깨끗한 500mL 플라스틱 일회용 병에 옮기. 0.5% NAC의 1mL/g 샘플 무게와 0.1% DTT의 4mL/g 샘플 무게를 추가합니다.
3. 최대 속도(15초)의 소용돌이를 한 다음 실온(최대 속도)에서 15분 동안 바위를 휘두를 수 있습니다.
4. NAC 및 DTT를 중화시키기 위해 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 4부량으로 샘플을 희석시키는 데; 최대 속도로 빠르게 소용돌이를 가하고 최대 속도로 5 분 동안 실온에서 바위를 흔들수 있습니다.
5. 100 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 하나 이상의 50mL 원심분리기 튜브로 필터링하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다.
6. 4°C에서 10분 동안 800 x g 의 세포 원심분리기. 수퍼내티컬을 흡습하고, 모든 펠릿을 15mL 원뿔튜브에 결합한 다음 동일한 조건을 사용하여 HBSS로 펠릿을 세척합니다.
7. 가래 샘플의 초기 중량에 의해 결정된 버퍼의 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
   참고: 작은 샘플은 HBSS의 250 μL에서 재중단됩니다. 중간 시료는 HBSS의 760 μL에서 재중단됩니다. 크고 초대형 시료는 1460μL의 HBSS에서 재중단됩니다.
8. Trypan Blue를 사용하여 라이브/데드 셀 카운트에 대한 셀 서스펜션의 알리쿼트(aliquot)를 복용하십시오.
   참고: 작은 샘플의 경우 5 μL을 사용합니다. 중간, 크고 초대형 시료의 경우 HBSS로 10 μL을 사용합니다.
   1. 가래 희석의 10 μL을 0.4% Trypan Blue의 30 μL과 혼합하여 1:40의 최종 샘플 희석을 달성합니다. 세포 수를 위해 혈종계의 카운팅 챔버에 적재합니다.
      참고: 정확한 수를 달성하기 위해 셀 수가 너무 낮거나 너무 높으면 최종 희석을 조정해야 할 수 있습니다. SEC와 파편으로부터 가래 세포를 올바르게 구별하기 위한 Guiot 등.²⁰ 을 상담하는 것이 좋습니다. 이것은 정확한 세포 수에 필수적입니다.
9. 초대형 샘플에서 총 50 x ¹⁰⁶ 셀을 제거하고 HBSS를 추가하여 새로운 튜브에 추가하여 총 1700 μL의 부피를 생성합니다.
   참고: 프로토콜의 나머지 부분에 대해 큰 샘플을 고려합니다. 남은 샘플을 폐기하거나 다른 목적으로 사용할 수 있습니다.

3. 항체 및 생존 성 염료 염색

1. 항체 및 염색염 선택
   참고: 표 1 은 이 프로토콜과 그들이 식별하는 세포 집단에 사용되는 항체 및 생존성 염료를 보여줍니다.
   1. 가래 세포를 포함하는 튜브에 라벨을 부착합니다(레이블의 표 2 참조).
   2. 비염색세포와 관과 함께 시료튜브에 대해 5mL 유동 세포측정관(사용된 유동 세포계와 호환)을 사용한다. 혈액 및 상피 관 샘플에 15 mL 원피스 튜브를 사용합니다.
      참고: 이 견본은 항체 염색 및 고정다음 혈류 세포측정관으로 옮겨질 것입니다.
2. 보상 튜브에 라벨을 부착합니다(표 3).
   참고: 사용 중인 유동 세포계와 호환되는 5mL 유동 세포측정관을 사용하십시오.
3. 표 2 및 표 3에 표시된 바와 같이 각각의 가래 세포 튜브 및 보상 튜브에 HBSS, 항체 및/또는 염료의 양을 추가합니다.
   참고: 모든 튜브의 염색 시간이 일관되도록 세포 또는 보상 구슬을 추가하기 전에 모든 튜브에 버퍼(HBBS), 항체 및 염료를 추가합니다.
4. 표 2에 나열된 가래 세포 볼륨의 양을 분석 튜브에 추가합니다.
5. 표 3에 나열된 보상 튜브에 보상 구슬을 추가합니다.
6. 빛으로부터 보호되는 얼음에 모든 튜브(분석 및 보상 튜브)를 35분 동안 배양합니다. 그런 다음 800 x g에서 10 분 동안 4 °C에서 얼음 차가운 HBSS 및 원심 분리기로 튜브를 채웁니다.
7. 보상 튜브의 경우, 가능한 한 펠릿에 가까운 슈퍼 나탄을 흡인하고 풀기 위해 펠릿을 쓸어.
8. 보상 튜브에 0.5 mL의 차가운 HBSS를 추가하고 4 ° C의 얼음에 저장하고 유동 세포 분석에 필요할 때까지 빛으로부터 보호하십시오.
9. 원심분리 후 얼룩이 없는 동위형, 혈액 및 상피 관으로부터 상퍼를 흡인하고(항체 염색 섹션에서 3.6단계) 튜브를 가볍게 하여 펠릿을 풀어줍니다.

4. 1% 파라포름알데히드 (PFA)로 고정

1. 감기 1% PFA (지금까지 해동해야) 얼룩되지 않은, 동종형, 혈액 및 상피 튜브에 추가; 2 mL을 염색되지 않은 및 동형 튜브에, 혈액 및 상피 튜브에 10 mL.
2. 1시간 동안 빛으로부터 보호되는 얼음에 튜브를 배양합니다. 30분 후 최대 속도로 빠르게 소용돌이를 가합니다.
3. 얼음 차가운 HBSS로 튜브를 채웁니다. 그런 다음 원심분리기 튜브는 4°C에서 1600 x g에서 10분 동안 합니다.
4. 세포 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 슈퍼 나티를 흡인하고 세포를 느슨하게손가락으로 튜브를 쓸어 넘깁니다.
5. 200 μL의 차가운 HBSS를 얼룩이 없는 및 이소타입 튜브에 추가합니다.
6. 총 세포 수에 따라 혈액 및 상피 관의 재발을 위해 HBSS의 부피를 계산합니다.
   참고 : 재서스펜션 볼륨 = 0.15 x [총 세포 수 (가래 의 8 단계) / ¹⁰⁶]. 초대형 샘플의 셀 수로 50 x ¹⁰⁶ 을 사용합니다.
7. 모든 샘플 및 보정 튜브를 저장하여 유동 세포 측정 분석이 수행될 때까지 얼음의 빛으로부터 보호됩니다.
   참고: 이 프로토콜은 24시간 이상 저장소에 대해 테스트되지 않았습니다.

5. 유동 세포계에 대한 데이터 수집

1. 사용되는 흐름 사이토미터에 적합한 시작 절차를 적용합니다.
   참고: 이 프로토콜의 이 섹션에서는 유동 세포계를 운영하는 사람이 사용할 수 있는 계측기의 사용에 대해 교육을 받았으며, 특히 광학 및 유체 시스템의 안정성 확인, 광 산란 및 형광 강도 표준화를 위한 기술, 올바른 보상 매트릭스를 계산하고 적용하는 등의 일상적인 절차에 관한 것으로 가정합니다.
2. 국립 표준 기술 연구소 (NIST) 구슬의 혼합물을 사용하여 앞으로 분산 및 측면 산란 전압이 구슬을 축에 너무 가까이 두지 않고 전체 플롯에 걸쳐 NIST 구슬을 배치하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
   참고: 이 단계는 5μm 미만의 이물질을 인수 후 분석을 통해 제거할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다. 사용되는 유동 세포계에 따라 가장 작은 구슬이 임계값(LSR II 또는 가사를 사용할 때) 또는 높은 차별(Navios EX 흐름 사이토미터 사용)으로 제외되지 않는다는 점을 염두에 두어야 합니다. Navios EX의 경우, 전방 및 측면 분산, 전방 분산용 236의 전압, 측면 분산에 대해 250의 게인이 사용되었다. LSR II의 경우, 165의 전방 산란 전압과 190의 측면 산란 전압이 사용되었습니다.
3. 유량을 중간(LSR II) 또는 높음(Navios EX)으로 설정합니다.
   참고: 대부분의 기기의 중간 또는 높은 유량은 가래 튜브를 획득하는 데 사용할 수 있습니다. 유량의 너무 느리거나 시료의 너무 희석을 사용하면 세포가 침전되어 바람직하지 않은 소용돌이가 증가할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 4.6 단계에서 계산된 리서스펜션 볼륨을 준수하면 신속하게 획득할 수 있지만 기계를 막지 는 않는 셀룰러 밀도가 발생합니다.
4. 분산 및 형광 파라미터에 사용되는 각 매개 변수에 대한 전압을 조정하여 세포 모집단을 스케일에 배치합니다. 게이팅 전략과 함께 수치를 사용하여 전압을 조정하는 방법에 대한 지침으로 사용합니다.
   참고: 필요한 모든 매개 변수가 수집 하기 전에 매개 변수 선택 창에서 선택 되거나 데이터를 수집 하지 않습니다 있는지 확인 합니다.
5. 먼저 얼룩이 없는 가래 샘플에 대한 데이터를 획득한 다음, 동형 염색 샘플, 그리고 혈액 관 및 상피 관에 대한 데이터를 수집합니다.
   참고: 세포 현탁액이 너무 집중되어 서세포계가 막힘 없이 시료를 실행할 수 있도록 하는 경우, 샘플은 HBSS로 더 희석될 수 있다.

Results

이 프로토콜은 임상 실험실 설정을 염두에 두고 개발되었습니다. 프로토콜을 개발하는 동안 초점은 단순성, 효율성 및 재현성에 있었습니다. 가래 처리에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계가 세포를 세는 것으로 나타났습니다. 따라서, 프로토콜은 가래 처리 및 세포 라벨링이 시간 손실 없이 세포 계산과 독립적으로 수행될 수 있는 방식으로 설정된다. 가려지지 않은 실행을 위해 시료를 적절히 희석하는 데 여전히 필요한 정확한 세포 수는 항체 라벨링 인큐베이션 기간 동안 얻을 수 있다.

이 프로토콜은 세포 수 대신 가래 중량 측정을 최적의 세포 라벨링에 사용할 항체/염료의 표시로 사용합니다. 그러나, 가래 샘플의 무게에 큰 정도의 변화가 있다; 분석된 126개의 샘플 중, 무게는 0.57g내지 38.30g까지 다양 하였다. 따라서 샘플은 네 가지 범주로 나뉘었다. 샘플의 중앙값은 작은 시료의 경우 2.1g, 중간 시료의 경우 5.0g, 대형...

Discussion

가래의 세포 함량은 광범위한 세포의 큰 다양성을 포함, 종종 파편을 많이 동반³⁷. 또한, 가래 분석은 구강 대신 폐로부터 채취되는 시료를 확인하는 품질 관리를 필요로한다³⁸. 따라서, 혈액, 예를 들어 훨씬 더 깨끗하고 균일한 세포 현탁액을 방출하는 혈액에 대한 것처럼 혈류 세포측정에 의해 가래를 분석하는 것은 간단하지 않다. 이 프로토콜은 이러한 모든 문제를 해결했습니다 : 가장 작은 세포 집단과 가장 큰 세포 집단을 모두 감지 할 수 있도록 특정 크기의 구슬을 사용하여 계측기 설정을 제공, 파편을 제거하기위한 게이팅 전략, 세포 덩어리, SEC 및 기타 죽은 세포를 오염, 마지막으로, 가래 샘플을 보장하기위한 품질 관리 조치는 주로 타액이 아닌 폐에서입니다.

스래텀을 작업하는 데 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 세포 수율은 프로토콜의 가래 해리 부분의 2.5 단계에서 사용되는 나일론 세포 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% 파라포름알데히드 플로우 픽스	Polysciences	25037
100 &마이크로; M 나일론 세포 여과기, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL 원뿔형 팔콘 튜브	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3 및 CD19 동형	BioLegend	400129
BV510 항인간 CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC 동형	BD Biosciences	555748
CompBead Plus 보상 비드	BD Biosciences	560497
Corning 폴리스티렌 dispoable 멸균 병 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
코닝 폴리스티렌 일회용 멸균 병 500mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS& T 비즈	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC 항인간 CD66b	GeneTex	GTX75907
고정 생존력 얼룩	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	피셔 사이언티픽	14-175-095
NAC	시그마-알드리치	A9165
NIST 비드, 05 μ M	Polysciences	64080
NIST 비드, 20 μ M	Polysciences	64160
NIST 비드, 30 μ M	Polysciences	64170
PE 항인간 CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 항인간 EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 BD	Biosciences	564063
구연산나트륨 이수화물	EMD	SX0445-1
Trypan 블루 솔루션, 0.4%	Fisher Scientific	15250061