단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

Summary

단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.

Abstract

지난 몇 년 동안 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법 (cryo-EM)의 기술적 및 방법론적 발전은 생물학적 거대 분자의 고해상도 구조 측정을위한 새로운 길을 열었습니다. 저저온-EM의 놀라운 발전에도 불구하고 단일 입자 분석 워크플로우의 다양한 측면에서 여전히 개선범위가 남아 있습니다. 단일 입자 분석은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지를 요구합니다. 지난 8년 동안 단일 입자 저저온-EM용 자동 이미징을 위해 여러 개의 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지가 개발되었습니다. 이 논문은 저용량 조건하에서 생체 분자를 생체화하기 위한 완전 자동화된 이미지 수집 파이프라인의 적용을 제시합니다.

cryo-EM 데이터를 완전하고 자동으로 정확하게 수집할 수 있는 소프트웨어 패키지를 보여 줍니다. 또한 이 소프트웨어 패키지에 의해 다양한 미세 한 매개 변수를 쉽게 제어 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 직접 전자 검출기 (DED)가 장착 된 200 keV 극저온 전자 현미경을 갖춘 중증 급성 호흡기 증후군 -코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 자동화 된 이미징에서이 소프트웨어 패키지의 잠재력을 보여줍니다. 약 3,000개의 극저온-EM 영화 이미지가 단일 세션(48h)의 데이터 수집에서 획득되어 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 원자 분해능 구조를 산출했습니다. 더욱이, 이러한 구조 연구는 스파이크 단백질이 두 가지 주요 적합성, 1-RBD(수용체 결합 도메인)를 열어 놓고 모든 RBD를 폐쇄된 적합성을 채택한다는 것을 나타낸다.

Introduction

단일 입자 저온 -EM은 생물학적 거대 분자¹의 고해상도 구조 측정을위한 주류 구조 생물학 기술이되었다. 단일 입자 재구성은 생물학적 ^{거대 분자2,3}의 3차원 (3D) 구조를 재구성하는 데 사용되는 2차원 (2D) 입자 이미지를 추출하기 위해 유리화 된 샘플의 광대 한 수의 현미경 그래프를 획득하는 데 달려 있습니다. DED를 개발하기 전에 단일 입자 재구성에서 달성된 해상도는 4에서 30 ^Å4,5 사이로 다양했습니다. 최근에는 단일 입자 저온-EM의 달성 가능한 해상도가 1.8 ^Å6을 넘어왔습니다. DED 및 자동화된 데이터 수집 소프트웨어는 데이터 수집에 대한 인간의 개입이 최소화된 이 해상도 ^revolution7에 주요 기여를 했습니다. 일반적으로, 저온-EM 이미징은 저전자 용량 율(20-100 e/^Å2)에서 수행되어 생물학적 샘플의 전자 빔 유도 방사선 손상을 최소화하며, 이는 이미지내 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)에 기여한다.....

Protocol

참고: 저저온-EM 데이터 수집에는 3가지 중요한 단계가 필요합니다: 1. cryo-EM 그리드 준비, 현미경의 2. 교정 및 정렬, 3. 자동 데이터 수집(그림 1). 또한 자동화된 데이터 수집은 적절한 영역 선택, b. 위도-S 최적화, c. 자동 구멍 선택 시작 및 d. 자동 데이터 수집(그림 1)으로 세분화됩니다.

1. 자동 데이터 수집을 위한 Cryo-EM 그리드 준비 및 샘플 로딩

1. 광선 방전기로 그리드를 청소하고 실험 요구 사항에 따라 광선 배출 매개 변수를 다릅니다 (여기, 20 mA에서 60 s).
2. 새로 준비된 단백질 샘플(3μL)을 광발 배출 그리드에 넣고 10s의 배양합니다.
3. 100% 습도에서 3-5s의 그리드를 블롯하고 저온 플런저를 사용하여 액체 에탄으로 빠르게 뛰어들수 있습니다.
4. 그리드를 클립 링에 수동으로 고정하여 유연한 C-클립 링을 사용하여 카트리지를 형성합니다.
5. 냉동 카트리지 장착 그리드를 오토로더 카세트에 로드하고 나노 캡으로 카세트를 데이터 수집을 위해 현미경의 미리 냉각된 오토로더로 전송합니다.

....

Results

현재 전염병 상황에서, 극저온-EM은 SARS-CoV-226,27,28,29로부터 다양한 단백질의 구조를 특성화하는 데 중요한 역할을 하며, 이는 바이러스에 대한 백신 및 약물을 개발하는 데 도움이 될 수 있다. 2019년 코로나바이러스 질병에 대처하기 위해 제한된 인적 자원을 갖춘 신속한 연구 노력이 절실히 필요합니다. 단일 입자 저온-EM의 데이터 수집은 거대 분자의 구조 결정에 시간이 많이 걸리지만 중요한 단계입니다. Cryo-EM 자동 데이터 수집의 최근 개발은 데이터 수집에 제한된 인간의 간섭을 가능하게했다. Latitude-S 소프트웨어는 정제된 SARS-CoV2 스파이크 단백질의 자동화된 데이터 수집에 사용되는 중요한 자동 데이터 수집 소프트웨어 패키지입니다.

Discussion

Latitude-S는 직관적인 사용자 인터페이스로, 이틀 만에 수천 개의 고해상도 현미경 또는 영화 파일을 자동으로 설정하고 수집할 수 있는 환경을 제공합니다. 그리드 를 가로 질러 쉽게 탐색할 수 있으며 낮은 배율에서 높은 배율로 이동하는 동안 현미경 단계의 위치를 유지합니다. Latitude-S를 사용하여 데이터 수집의 각 단계는 시간 효율적이며 간단한 사용자 인터페이스, 최대 4.5GB/s 속도로 데이터의 빠른 스트리밍, 수집 하는 동안 데이터의 동시 표시와 같은 기능을 제공합니다. 또한, 미리 보정된 용량 분획, 용량 속도, 포커스 및 배율 매개 변수는 자동 데이터 수집의 새로운 세션을 시작하고 시간을 절약하기 위해 쉽게 재장전되었습니다.

지속적인 모니터링이 없고 데이터 세트의 품질을 손상시키지 않으면서 데이터를 자동으로 수집하는 것은 어렵고 시간이 많이 소요되는 작업입니다. 특히 이 전염병 동안 시간과 리소스가 주요 제약 조건이 될 때 Latitude-S 소프트웨어를 사.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
블로팅 페이퍼	Ted Pella, INC.	47000-100	EM 검체 준비 항목
캡슐	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97591	EM 표본 준비 장치
카세트	Thermo Fisher Scientific	1020863	EM 표본 준비 장치
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	EM 표본 준비 항목
C-Clip 삽입 도구	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97571	EM 검체 준비 도구
C-Clip Ring	Thermo Fisher Scientific 1036173		EM 검체 준비 항목
EM 그리드(Quantifoil)	전자 현미경 과학	Q3100AR1.3	R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow 방전 기계	Quorum	N/A	Quorum GlowQube 글로우 방전 기계
K2 DED	Gatan Inc.	N/A	Cryo-EM 데이터 수집 장치(카메라)
Latitude S Software	Gatan Inc.		이미징 소프트웨어
로딩 스테이션	Thermo Fisher Scientific	1130698	EM 표본 준비 장치
Talos 200 kV Arctica	Thermo Scientific™	N/A	극저온 전자 현미경
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A	EM 검체 준비 장치