세포 외 소포 (전기)는 세포 생물학 및 세포 간 통신에 기여합니다. 세포에 의한 전기자동차 의 섭취를 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이의 필요성이 있다. 현재 프로토콜은 나노 여과 계 미세 유체 장치에 의한 EV 절연에 따라 공초점 현미경 검사를 통해 3차원 형광 이미징을 활용하여 EV uptake 분석법을 제안합니다.
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방법 논문
공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포의 세포 외 소포 (EV) 섭취량을 시각화하고 정량화하기 위한 실용적인 에세이가 필요합니다. EV 섭취량은 다양한 연구 분야에서 세포간 통신에 중요한 역할을 합니다. 암 생물학, 신경 과학 및 약물 전달. 많은 EV 섭취량 은 문학에서 보고되었습니다. 그러나 실용적이고 상세한 실험 방법론이 부족합니다. EV 섭취량은 형광 라벨을 부착하여 세포 내의 위치를 감지하여 평가할 수 있습니다. 세포의 내이화 된 전기와 셀의 피상적 인 전기를 구별하는 것은 EV 섭취량을 정확하게 결정하는 것이 어렵지만 중요합니다. 따라서, 3차원(3D) 형광 공초점 현미경을 통해 EV 의 섭취를 효율적으로 정량화하는 분석이 이 작품에서 제안된다. 형광 라벨이 부착된 전기는 나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여 제조되었으며, 3D 공초점 현미경검사법에 의해 시각화된 다음 고급 이미지 처리 소프트웨어를 통해 분석하였다. 이 프로토콜은 셀룰러 수준에서 전기를 분석하기 위한 강력한 방법론과 효율적인 분석을 위한 실용적인 접근 방식을 제공합니다.
서론
세포외 소포(EV)는 나노 크기의 지질 막 결합 입자로, 이독(100-500 nm) 및 엑소좀(50-150 nm)1의 크기로 분류된다. 전기 는 단백질, 핵산 및 지질과 같은 다양한 생체 분자를 포함합니다. 이 생체 분자는 화물로 캡슐화 되고 EVs1,2,3을 통해 세포 외 공간으로 방출되기 전에 세포에서 유래합니다.
그들의 화물의 다양성때문에, 전기는 세포 간 통신에 적극적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 세포별 전기자동차의 방출 및 섭취는 세포 4,5 사이의 생체 분자의 전달을 허용한다. 셀에 EV 화물을 도입하면 수신자 셀의 기능 및 근종 상태를 변경할 수 있습니다4,5,6. 전기 자동차는 여러 경로를 통해 내면화됩니다. 그러나 정확한 메커니즘....
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프로토콜
1. EV 절연 및 온칩 면역 형광 EV 라벨링
- EV 절연을 위한 세포 배양 매체(CCM) 및 CCM의 사전 처리
- 종자 PC3 세포는 75cm2 세포 배양 플라스크에서 30% 합류한다. 제어 세포가 표준 미디어 및 세포 선별 보충제에서 90%의 합류(~48h)로 증가하도록 허용합니다.
참고: EV 함유 성분이 세포 섭취(즉, 태아 소 혈청)에 영향을 미치지 않도록 하려면 외성 고갈된 미디어와 보충제를 사용하십시오. - CCM을 수확하십시오.
- CCM을 실온(RT)에서 10 분 동안 10분 동안 원심분리하여 부착되지 않은 세포와 미디어로 수확한 큰 파편을 펠렛합니다. 상체를 새로운 원식 튜브로 옮는다.
- 새로운 튜브에서, 원심 분리는 미디어에 남아있는 작은 파편과 자멸 체를 펠릿4 °C에서 20 분 동안 10,000 x g 에서 상류체를 분리합니다. 일부 더 큰 전기 자동차는 펠릿 것입니다. 상체를 새 튜브로 옮기습니다.
- 0.45 μm 수성 소수성 폴리비닐리덴 불소(PVDF) 멤브레인 주사기 필터를 통해 상체를 필터링합니다.
참고: EV 절연을 위해 CCM을 즉시 처리하지 않을 경우, 격리가 수행될 때까지 미리 처리된 CCM을 -....
- 종자 PC3 세포는 75cm2 세포 배양 플라스크에서 30% 합류한다. 제어 세포가 표준 미디어 및 세포 선별 보충제에서 90%의 합류(~48h)로 증가하도록 허용합니다.
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결과
나노 여과 계 미세 유체 장치를 사용하여, 전기는 PC3 CCM에서 분리되고 불소 -컨쥬게이트 EV 특이적 (CD63) 항체로 표시되었다 (도 1). 표지된 EV는 3D 공초점 현미경 검사법(그림 2)에 의해 성공적으로 시각화되었습니다. 표지된 전기 는 엑소좀 고갈된 매체에서 몇 시간 동안 세포로 배양되었다. 배양 후, 세포는 엑소좀 고갈된 매체로 세척하였다. 나머지 EV는 인큐베이션 중에 내부화되거나 세포에 부착되었습니다. 셀 영역이 레이블이 지정되었습니다. 내화 된 전기는 말장난19,20,24,27 및 개별 EV (그림 3 및 그림 4A
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토론
공초점 현미경 검사를 통한 3D 형광 이미징을 기반으로 하는 EV 섭취 분석법은 효율적인 방법론과 민감한 분석을 제공합니다. 이 형광 EV 라벨링은 EV의 시각화를 용이하게 하고 정확한 EV 업테이크 분석기를 성공적으로 수행합니다. EV 라벨링 및 잔류 염료 를 제거하기위한 이전 방법은 초음파 심립분리 (UC)를 사용하여 침전을 제거하여보고되었습니다. 그러나, UC는 전기자동차를 공동 침전시킬 수 있으며, 고정염은 거짓 양성 신호12,13로 이어질 수 있다. 나노 여과 기반 의 미세 유체 장치는 이 전기 및 염료의 강수량을 제거하여 형광 라벨이 부착된 EV의 품질과 분석의 특이성을 향상시킵니다. EV 섭취량은 셀 표면의 피상적 EV와 분리된 내부화된 EV를 구별하고 정량화하기 위해 체적 분석에 의해 측정되었다. EV 섭취량의 체적 분석은 셀 크기별로 EV 섭취량의 정상화를 가능하게 합니다. 라이브 셀 EV 섭.......
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공개 사항
조대표는 나노여과계 미세유체장치 엑소디스크에 대한 특허를 발명한 것으로, Labspinner(울산, 한국)에 허가를 받았습니다. 다른 모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 NCI 보조금 Nos에 의해 지원되었다. U54CA143803, CA163124, CA093900 및 CA143055 ~ K. J. P. 이 연구는 한국보건복지부의 지원을 받아 한국보건산업개발원(KHIDI)을 통해 한국보건기술R&D 사업의 지원(교부금 번호: HI19C1122)에 의해 지원되었다. 김제이와 Y.K. 조 대표는 한국 정부의 지원을 받아 기초과학연구소(IBS-R020-D1)의 지원을 받았다. 저자는 원고의 비판적 독서에 대한 브래디 비뇨기과 연구소의 현재와 과거 회원, 특히 피엔타 - 수정 연구소의 구성원을 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 항체 | Biolegend | 353038 | 형광 염료 접합 EV 특이적 항체 |
| CellTracker Orange CMTMR 염료 | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) 형광 표지 시약 |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | 컨 | 포칼 이미징 MRD77400 대물렌즈, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | 컨포칼 이미징 대물렌즈, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | EV 절연을 위한 나노 여과 기반 미세유체 장치 |
| , ExoDiscovery | Labspinner, Inc. | EX-R1001 | 엑소디스크 |
| 엑소좀 고갈 | FBS Thermo Fisher Scientific | A2720801 | PC3 세포주 유래 EV 수집을 위한 세포 배양 배지의 영양소 |
| 소 태아 혈청(FBS) | VWR | 1500-500 | 세포 배양을 위한 영양소 |
| 염소 안티 마우스 IgG H& L 사전 흡착된 | abcam | ab7063 | EV 라벨링 Ibidi USA의 네거트비 제어를 위한 마우스 IgG 항체 |
| U DISH μ-Dish 35mm | Ibidi | 81156 | 컨포칼 이미징용 배양 접시 |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | 사후 이미지 처리 소프트웨어 |
| 인큐베이터 System+ CO2/O2/N2 라이브 | 셀 기기 | TU-O-20 | 라이브 셀 이미징용 인큐베이터 시스템 |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 카메라 | 컨포칼 이미징용 | Nikon | NA |
| Nikon Eclipse Ti 현미경 | Nikon | NA | 컨포칼 이미징용 도립 현미경 |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Nikon 현미경용 이미지 처리 소프트웨어 |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | EV 집중용 측정 장치 |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | 그래프 소프트웨어 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 세포 배양을 위한 항생제 |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | PC3 세포주 배양을 위한 세포 배양 배지 |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | EV 라벨링을 위한 RNA 염색 형광 염료 |
참고문헌
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....
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