Method Article

이 단지에서 CD95 사망 유도 신호 복합체 및 프로카스파스-8의 처리 구성 측정

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서, 죽음을 유도하는 신호 복합체(DISC)에서 직접 카스파제-8 처리를 감지하고 이 복합체의 조성을 결정하는 실험 워크플로우가 제시된다. 이 방법론은 세포 사멸 경로의 분자 메커니즘을 해명에서 세포 사멸 네트워크의 동적 모델링에 이르기까지 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

외래 세포멸은 CD95/Fas/APO-1 또는 종양 괴사 인자-유도 리간드(TRAIL)-수용체 1/수용체 2(TRAIL-R1/R2)와 같은 사망 수용체(DRs)의 활성화에 의해 중재된다. 그들의 cognate 리간드로 이 수용체의 자극은 죽음을 유도하는 신호 복합체 (DISC)의 조립으로 이끌어 냅니다. DISC는 DR, 어댑터 단백질 Fas-연관 단백질을 데스 도메인(FADD), procaspases-8/-10, 및 세포 FADD 와 같은 인터류신(IL)-1β 변환 효소 억제 단백질(c-FLIPs)으로 포함한다. DISC는 procaspase-8 처리 및 활성화를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 후자는 디스크에 조립된 데스 이펙터 도메인(DED) 필라멘트의 이질/올리고머화를 통해 발생합니다.

procaspase-8의 활성화는 여러 단계에서 발생하는 처리 뒤에 있습니다. 이 작업에서는 이 컴플렉스에서 DISC 형성 및 프로카스파스-8의 처리를 측정할 수 있는 확립된 실험 워크플로우가 설명되어 있습니다. 워크플로는 서양 얼룩 분석에 의해 지원되는 면역 침전 기술을 기반으로 합니다. 이 워크플로우를 통해 DISC 및 그 처리에 대한 다양한 단계의 procaspase-8 모집을 주의 깊게 모니터링할 수 있으며 외외 세포멸의 분자 메커니즘을 조사하는 데 매우 관련이 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

가장 잘 연구 된 죽음 수용체 중 하나 (DRs) CD95 (Fas, APO-1). 외래 식수 막멸 경로는 COgnate 리간드, 즉 CD95L과 상호 작용하거나 TRAIL-Rs에 결합하는 DR의 상호 작용으로 시작됩니다. 이 결과 해당 DR. DISC에서 디스크의 형성은 CD95, FADD, procaspase-8/-10 및 c-FLIP 단백질1,2로구성된다. 더욱이, DISC는 CD95 및 FADD와 같은 데스 도메인(DD)-함유 단백질, 및 FADD, procaspase-8/-10 및 c-FLIP(도1)와같은 DED 함유 단백질 간의 상호 작용에 의해 조립된다. Procaspase-8은 DEDs의 협회를 통해 올리고머화를 거치며 DED 필라멘트의 형성을 초래하고 procaspase-8 활성화 및 처리가 뒤따릅니다. 이것은 세포 사멸로 이끌어 내는 caspase 폭포를 트리거합니다(그림 1)3,4. 따라서, procaspase-8은 CD95 또는 TRAIL-Rs에 의해 매개되는 외외 세포사멸 경로의 중앙 시인터 카스파제이며, 해당 거대 분자 플랫폼, DISC에서 활성화된다.

procaspase-8의 2개의 등소 형태, 즉 procaspase-8a (p55) 및 -8b (p53), DISC5에모집되는 것으로 알려져 있습니다. 두 등도 형태 모두 두 개의 DED를 포함한다. DED1 및 DED2는 프로카스파스-8a/b의 N 단말 부분에 위치하고 있으며 촉매 p18 및 p10 도메인이 뒤따릅니다. procaspase-8 DEDs의 상세한 극저온 전자 현미경 검사법 (cryo-EM) 분석은 DED 필라멘트4,6에게불린 필라멘트 구조물로 procaspase-8 단백질의 조립을 밝혔습니다. 놀랍게도, 선형 procaspase-8 체인은 처음에 DISC에서 procaspase-8 활성화에 선행된 이질에 종사하는 것이 제안되었습니다. 지금, 그 체인은 procaspase-8 DED 필라멘트의 하위 구조, 세 개의 나선으로 조립 된 세 개의 체인을 포함하는 후자는 알려져 있다3,4,6,7.

DED 필라멘트에서 분화하면, 프로카스파스-8a/b의 형성적 변화는 프로카스파스-8의 활성 센터형성과 활성화3,8로이어진다. 이것은 두 개의 경로를 통해 매개되는 procaspase-8 처리에 선행됩니다: 첫번째는 p43/p41 분열 제품의 생성을 통해 가고 p30 분열 제품의 초기 생성을 통해 두 번째. p43/p41 통로는 Asp374에서 procaspase-8a/b의 분열에 의해 개시되어 p43/p41 및 p12 분열제품(그림 2)을초래한다. 또한, 이들 단편은 Asp384 및 Asp210/216에서 자동 촉매로 갈라져 활성 카스파스-8 이테로테트라머, p10 2/p1829,10,11의형성을초래한다. 또한, 처리의 p43/p41 경로에 병행하여, procaspase-8a/b는 또한 아스p216에서 절단되어 C-단말 분열 제품 p30의 형성으로 이어지고, 그 다음으로 p10 및 p1810(도 2)에대한 프로테올리시스가 뒤따랐다.

DED 필라멘트에서 Procaspase-8a/b 활성화는 c-FLIPs12라는단백질에 의해 엄격하게 조절된다. c-FLIP 단백질은 c-FLIP Long(c-FLIP L),c-FLIP Short(c-FLIPS),c-FLIPRaji(c-FLIP R)세 가지 등등형태로 발생합니다. 세 개의 동소형태모두 N단자 지역에 2개의 DED가 포함되어 있습니다. c-FLIPL은 또한 C-단말 촉매 비활성 카스파스와 같은도메인(12,13)을가지고 있다. c-FLIP-c-FLIPS및 c-FLIPR-의짧은 동소형태는모두 DISC6,14,15에서DED 필라멘트 형성을 방해하여 반석멸 방식으로 작용한다. 또한, c-FLIPL은 농도 의존적 방식으로 카스파제-8 활성화를 조절할 수 있다. 이것은 프로- 및 반-apoptotic 효과16,17,18귀착될 수 있다. 촉매 활성 프로카스파스-8/c-FLIPL 이성애를 형성함으로써 c-FLIPL은 프로카스파스-8의 활성 중심의 안정화및 활성화로 이어집니다. c-FLIPL의 프로-또는 반-아포토틱 기능은 DED 필라멘트의 양과 조립된 procaspase-8/c-FLIPL 이종수(19)의 후속 양에 직접적으로 의존한다. 디스크에서 c-FLIPL의 낮거나 중간 농도는 caspase-8의 활성화를 지원하는 DED 필라멘트에서 충분한 양의 procaspase-8/c-FLIPL 이종수의 결과를 초래한다. 대조적으로, c-FLIPL의 증가양은 직접 DISC20에서그것의 반 자멸 효과로 이끌어 내다.

함께 촬영, 활성화 및 디스크에서 procaspase-8a/b의 처리는 여러 단계를 포함하는 매우 규제 과정이다. 이 백서에서는 DISC에서 직접 프로카스파스-8 처리의 측정과 이 복합체의 조성에 대한 분석에 대해 설명합니다. 이것은 모범적인 DR 복합체로 CD95 DISC를 사용하여 표시됩니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T세포 실험은 윤리적 합의42502-2-1273 유니 MD에 따라 수행되었다.

1. 실험을 위한 세포 준비

참고: 이 면역 침전을 위한 세포의 평균 수는 1 × 107입니다. 부착 된 세포는 실험 당일 1 × 107 세포가 되도록 실험 하루 전에 시드해야합니다.

  1. 실험을 위한 부착 셀 준비
    1. 종자 5-8 × 106 부착 세포는 20 mL의 배지에서 (구성을위한 재료의 표 참조) 실험이 시작되기 하루 전에 14.5cm 접시에서 각 조건에 대해.
    2. 실험 당일, 세포가 80-90% 컨런트와 접시를 부착하고 있는지 확인하십시오. 배지를 버리고 부착 셀에 신선한 배지를 추가합니다.
  2. 실험을 위한 서스펜션 셀 준비
    1. 실험이 시작되기 직전 14.5cm 접시에 10mL의 배양 배지에 1× 107 현탁세포(조성물 표 참조)를 신중하게 배치합니다.
    2. 1 차 세포를 사용하는 경우, 이전에 설명된절차(21)에따라 1차 T 세포를 분리한다. 1일 T 세포를 24시간 동안 1μg/mL 식물성 세포로 처리하고, 6일 동안 25개의 U/mL IL2 치료를 처리합니다.
    3. 실험이 시작되기 직전 14.5cm 접시에 1개의 ×108개의 1차 T세포를 배양 배지 10mL에 조심스럽게 배치한다(조성물 표 참조).
      참고: 이러한 세포가 작기 때문에 이 더 많은 기본 T 세포 수가 권장됩니다.

2. CD95L 자극

  1. CD95L로 세포를 자극하십시오(이전에 설명된 대로생산된 20 또는 시판가능(재료표 참조).
    참고: CD95L의 농도와 자극 의 시간은 세포형 의존13,15,22,23,24,25이다. 하나의 자극 조건을 두 번 준비하여 '비드 컨트롤' 샘플을 병렬로 생성합니다.
    1. CD95L의 선택된 농도로 부착 세포를 자극한다. 플레이트를 비스듬히 잡고 리간드를 부착 셀에 닿지 않고 매체에 파이프합니다.
    2. 리간드 용액을 셀 서스펜션으로 배관하여 CD95L로 서스펜션 셀을 자극합니다.

3. 세포 수확 과 리시스

  1. 셀 접시를 얼음 위에 놓습니다.
    참고: 매체를 폐기하지 마십시오. 죽어가는 세포는 매체에 떠 있고 분석에 중요합니다.
  2. 10mL의 차가운 인산염 완충식식염(PBS)을 세포 현탁액에 넣고 부착된 세포를 플레이트에서 긁어냅니다. 50mL 튜브에서 셀 서스펜션을 수집합니다.
  3. 차가운 PBS 10mL로 셀 접시를 두 번 씻고 워시 용액을 동일한 50mL 튜브에 넣습니다. 5분, 4°C에 대해 500 g ×의 세포 현탁액을 원심분리합니다.
  4. 상체를 버리고 차가운 PBS의 1 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브로 옮기십시오.
  5. 5분, 4°C에 대해 500 g ×의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 차가운 PBS의 1 mL로 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
  6. 5분, 4°C에 대해 500 g ×의 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 버리고 용해 버퍼 1mL (4 % 프로테아제 억제제 칵테일 포함)으로 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 얼음에 30 분 동안 배양.
  7. 15분, 4°C의 최대 속도(~17,000×g)로 리세지를 원심분리합니다.
  8. 상체(lysate)를 깨끗한 튜브로 옮기십시오. 펠릿을 버리십시오. 다른 튜브에 있는 lysate의 50 μL를 가져 가라. 브래드포드 분석에 의한 단백질 농도를 분석하고 바이알에서 단백질의 25 μg에 해당하는 용액의 양을 섭취한다. 바이알에 로딩 버퍼(컴포지션의 재료 표 참조)을 추가합니다. -20°C에 보관하여 용하 제어로 보관합니다.

4. 면역 강수량 (IP)

  1. 항 APO-1 항체2 μL과 단백질 A 세파로즈 구슬 10 μL을 용액에 넣습니다. '비드 컨트롤'을 생성하기 위해 lysate (자극 된 샘플)를 포함하는 별도의 튜브에 비드의 10 μL만 추가합니다.
    참고: 단백질 A 세파로즈 구슬을 취급하는 동안 팁을 자르거나 IP에 대한 특별한 팁을 구입하여 넓은 오리피스가 있는 파이펫 팁을 사용하십시오.
  2. 4°C에서 하룻밤 동안 부드러운 혼합으로 항체/단백질 A 세파로즈 구슬과 lysate의 혼합물을 배양합니다. 원심분리는 항체/단백질A 세파로즈 구슬을 4분, 4°C에 대해 500 g에서 ×. 상체를 버리고, 차가운 PBS 1mL을 구슬에 넣고, 이 단계를 적어도 세 번 반복한다.
  3. 상부체를 폐기합니다. 바람직하게는 50 μL 해밀턴 주사기로 구슬을 흡인한다.

5. 웨스턴 블롯

  1. 구슬에 4x 로딩 버퍼의 20 μL을 추가하고 구슬에 넣고 10분 동안 95°C에서 가열합니다. 용액 컨트롤을 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
  2. 12.5% 나트륨 도데실 황산염(SDS) 젤(젤 준비를 위한 재료표 참조)에 용액, IP 및 단백질 표준을 적재하고 80V의 일정한 전압으로 실행한다.
  3. SDS 젤에서 니트로셀룰로오스 막으로 단백질을 전달합니다.
    참고: 여기서, 관심 있는 단백질에 최적화된 반건조 기술은 12분 이상(25V; 2.5A= 상수)를 통해 전송하는 데 사용되었다. 니트로셀룰로오스 멤브레인과 전기 포근 버퍼에 두 개의 미니 크기 이송 스택을 담그십시오 (구성을위한 재료 표 참조, 제조업체의 지시에 따라 준비) 서쪽 블로팅 전에 몇 분 동안.
  4. 상자에 블로티드 멤브레인을 놓고 블로킹 용액 (PBS (PBST) + 5 % 우유에서 0.1 % Tween-20)에 1 h로 차단하십시오. 부드러운 동요 하에서 차단 용액으로 멤브레인을 배양합니다.
  5. PBST로 멤브레인을 3회 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다.

6. 웨스턴 블롯 감지

  1. 표시된 희석에 제1 차 일차 항체를 추가 (재료의 표참조) 막에 부드러운 동요와 함께 4 °C에서 하룻밤 을 배양.
  2. PBST로 멤브레인을 3회 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다.
  3. 20mL의 이차 항체(PBST + 5% 우유에서 희석)로 멤브레인을 1시간 동안 부드럽게 흔들어 보습합니다.
  4. PBST로 멤브레인을 3회 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다.
  5. PBST를 폐기하고 멤브레인에 고추냉이 과산화기기류 의 약 1 mL을 추가합니다.
  6. 화학 발광 신호를 감지합니다(재료 표참조).
    참고: 노출 시간 및 캡처된 이미지의 수는 세포내 단백질의 양과 사용된 항체의 특이성에 달려 있습니다. 검출에 사용되는 각 항체에 대해 경험적으로 확립되어야 한다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD95 DISC에서 DISC및 해당 처리를 위해 caspase-8 채용을 분석하기 위해 CD95 DISC의 IP와 서부 블롯 분석을 결합한 고전적인 워크플로우를 설명합니다. 이를 통해 DISC에서 caspase-8 활성화의 몇 가지 주요 기능을 검출할 수 있습니다: caspase-8-활성화 매크로 분자 플랫폼의 조립, DISC에 procaspase-8의 모집, 그리고 이 시터 카스파제의처리(도 1 및 도 2). 이러한 워크플로우는 CD95L을 이용한 민감한 세포의 치료를 시간 의존적 방식으로, 그들의 용해, 항 CD95(anti-APO-1) 항체를 이용한 면역침전, 그리고 후속 서부 얼룩분석(도 3)을포함한다.

자궁 경부암 HeLa-CD95 세포는 DISC형성(26)을분석하는 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 접근법은 Kischkel 외27에 의해 처음 설명되었으며 여러 그룹에 의해 그 이후로 성공적으로 개발되었습니다. 이 복합체에서 효율적인 DISC 면역 침전 및 모니터링 caspase-8 처리를 위해 몇 가지 중요한 문제를 고려해야 합니다.

첫째, 면역 침전 중에 모든 세척 단계를 따르는 것이 필수적입니다. 특히 중요한 것은 세파로즈 구슬의 최종 세척 단계와 세파로즈 구슬의 건조입니다. 이는 면역침전의 신호/잡음 비율을 높이기 위해 올바르게 수행되어야 하며, DISC에서 caspase-8 모집 및 처리를 감지할 수 있도록 허용합니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 이 사전 정리 단계가 서쪽 blotting7,23에의하여 DISC에 caspase-8 모집의 검출을 위해 필수적이지 않다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 언급했듯이, 면역 강...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 빌헬름 산더 재단 (2017.008.02), 다이나믹 시스템 센터 (CDS), 우리의 작업을 지원하기위한 유럽 프로그램 ERDF (유럽 지역 개발 기금)와 DFG (LA 2386)에 의해 투자 인정. 우리는 우리의 실험을 지원 카리나 Guttek 감사합니다. 우리는 우리에게 1 차적인 T 세포를 제공하기 위한 더크 Reinhold 교수 (OvGU, Magdeburg)를 인정합니다.

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Materials

3피펫팅하는 데 사용됩니다

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
각자 하는12.5% SDS 젤
3.28 mL 증류된 H2O
2.5 mL 트리스; PH 8.8; 1.5 M
4.06 mL 아크릴아미드
100 µ L 10% SDS
100 &마이크로; L 10% APS
7.5 & 마이크로; L TEMED

2개의 수집 젤을 위해:
3.1 mL 증류된 H2O
1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 mL 아크릴아미드
50 &마이크로; L 10% SDS
25 &마이크로; L 10% APS
7.5 & 마이크로; L TEMED
14.5cm 셀 접시Greiner639160
아크릴아미드Carl RothA124.1
에어로졸 필터 피펫 팁, 높은 회수 필터 및 넓은 오리피스가 있는VWR46620-664(북미) 또는 732-0559(유럽)
P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공하거나 EnzoALX-805-038-C100면역 침
전 항 카스파제-10 AbBiozolMBL-M059-3PBST에서 1:1000 + 1 : 100 NaN3< / sub>
anti-caspase-3 Ab세포 신호9662 S희석 : PBST에서 1:2000 + 1 : 100 NaN3< / sub>
P. Krammer 교수가 본 실험에서 제공한항-카스파제-8 Ab C15ALX-804-242-C100: PBST 중 1:20 + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715희석: PBST에서 1:2000 + P. Krammer 교수가 본 실험에서 제공하는 1:100 NaN3
>anti-c-FLIP NF6 Ab또는 ENZOALX-804-961-0100에서 구매 가능희석 : PBST에서 1:10 + P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공 한 1 : 100 NaN3< / sub>
anti-FADD 1C4 AbADI-AAM-212-E에서 구입할 수 있습니다희석 : PBST에서 1:10 + 1 : 100 NaN3< / sub>
anti-PARP Ab세포 신호9542희석 : PBST에서 1:1000 + 1 : 100 NaN3< / sub>
APSCarl Roth9592.3
β-메르캅토에탄올Carl Roth4227.2
Bradford solution
단백질 분석 염료 시약 농축액 450ml		Bio Rad500-0006P
. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공한CD95LALX-522-020-C005
화학발광 검출기
Chem Doc XRS+		Bio Rad에서 구입할 수 있습니다.
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001제조사 지침에 따라 준비
DPBS (10x) w/o Ca, MgPAN BiotechP04-53500희석 1:10 H2O, 냉장고에 보관
영동 완충액자체 제작10x 전기영동 완충액:
60.6 g Tris
288 g 글리신
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 사용 전 희석
Carl Roth3908.3
염소 안티 마우스 IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05희석 1:10.000 in PBST + 5% 우유
염소 안티 마우스 IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05희석 1:10.000 in PBST + 5% 우유
염소 안티-토끼 IgG-HRPSouthernBiotech4030-05희석 1:10.000 PBST + 5% 우유
인터루킨-2 인간(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001T 세포 활성화를 위해
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
로딩 버퍼
4x Laemmli 샘플 버퍼, 10 mL		Bio Rad161-0747제조업체의 지침에 따라 준비
Luminata Forte Western HRP 기판MilliporeWBLUFO500
용해 버퍼자체 제작13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
960 mL H 2 < / sub 추가>O
배지 DMEM F12 (1:1) w 안정 글루타민,  2,438 g/LPAN BiotechP04-4115410% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.0001% 퓨로마이신을 10% FCS
Life Technologie의 gibco2187503410% FCS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 중간
분유Carl RothT145.4
에 첨가Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBST자체 제작20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
희석 사용 전 1:20
PBST + 5% 우유자체 제작분유 50 g + 1 L PBST
PHA세포 활성화를 위한Thermo Fisher ScientificR30852801
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-03733-5 & 마이크로 사이 사용; L
단백질 A Sepharose CL-4B 비드Novodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01친화성 수지 비드 제조업체 지침에 따라 제조
스크레이퍼VWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
셰이커Heidolph
아지드 나트륨Carl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo 미니 크기 트랜스퍼 스택Bio Rad170-4270제조업체 지침에 따라 사용
TransBlot Turbo 5x 트랜스퍼 버퍼Bio Rad10026938제조업체 지침에 따라 준비
TransBlot Turbo 미니 크기 니트로셀룰로오스 멤브레인Bio Rad170-4270제조업체의 지침에 따라 사용
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000
2개의 분리 젤을 위해 : 용해물 안티액틴 Ab Sigma Aldrich A2103 희석: PBST + 1:100 NaN.에서 구입할 수 있습니다. 희석에만 사용 : > 또는 ENZO 희석으로 구매 가능 또는 ENZO 또는 ENZO 전기 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 배지 분유에 추가함으로써 T

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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