여기서, 죽음을 유도하는 신호 복합체(DISC)에서 직접 카스파제-8 처리를 감지하고 이 복합체의 조성을 결정하는 실험 워크플로우가 제시된다. 이 방법론은 세포 사멸 경로의 분자 메커니즘을 해명에서 세포 사멸 네트워크의 동적 모델링에 이르기까지 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
외래 세포멸은 CD95/Fas/APO-1 또는 종양 괴사 인자-유도 리간드(TRAIL)-수용체 1/수용체 2(TRAIL-R1/R2)와 같은 사망 수용체(DRs)의 활성화에 의해 중재된다. 그들의 cognate 리간드로 이 수용체의 자극은 죽음을 유도하는 신호 복합체 (DISC)의 조립으로 이끌어 냅니다. DISC는 DR, 어댑터 단백질 Fas-연관 단백질을 데스 도메인(FADD), procaspases-8/-10, 및 세포 FADD 와 같은 인터류신(IL)-1β 변환 효소 억제 단백질(c-FLIPs)으로 포함한다. DISC는 procaspase-8 처리 및 활성화를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 후자는 디스크에 조립된 데스 이펙터 도메인(DED) 필라멘트의 이질/올리고머화를 통해 발생합니다.
procaspase-8의 활성화는 여러 단계에서 발생하는 처리 뒤에 있습니다. 이 작업에서는 이 컴플렉스에서 DISC 형성 및 프로카스파스-8의 처리를 측정할 수 있는 확립된 실험 워크플로우가 설명되어 있습니다. 워크플로는 서양 얼룩 분석에 의해 지원되는 면역 침전 기술을 기반으로 합니다. 이 워크플로우를 통해 DISC 및 그 처리에 대한 다양한 단계의 procaspase-8 모집을 주의 깊게 모니터링할 수 있으며 외외 세포멸의 분자 메커니즘을 조사하는 데 매우 관련이 있습니다.
서론
가장 잘 연구 된 죽음 수용체 중 하나 (DRs) CD95 (Fas, APO-1). 외래 식수 막멸 경로는 COgnate 리간드, 즉 CD95L과 상호 작용하거나 TRAIL-Rs에 결합하는 DR의 상호 작용으로 시작됩니다. 이 결과 해당 DR. DISC에서 디스크의 형성은 CD95, FADD, procaspase-8/-10 및 c-FLIP 단백질1,2로구성된다. 더욱이, DISC는 CD95 및 FADD와 같은 데스 도메인(DD)-함유 단백질, 및 FADD, procaspase-8/-10 및 c-FLIP(도1)와같은 DED 함유 단백질 간의 상호 작용에 의해 조립된다. Procaspase-8은 DEDs의 협회를 통해 올리고머화를 거치며 DED 필라멘트의 형성을 초래하고 procaspase-8 활성화 및 처리가 뒤따릅니다. 이것은 세포 사멸로 이끌어 내는 caspase 폭포를 트리거합니다(그림 1)3,4. 따라서, procaspase-8은 CD95 또....
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프로토콜
T세포 실험은 윤리적 합의42502-2-1273 유니 MD에 따라 수행되었다.
1. 실험을 위한 세포 준비
참고: 이 면역 침전을 위한 세포의 평균 수는 1 × 107입니다. 부착 된 세포는 실험 당일 1 × 107 세포가 되도록 실험 하루 전에 시드해야합니다.
- 실험을 위한 부착 셀 준비
- 종자 5-8 × 106 부착 세포는 20 mL의 배지에서 (구성을위한 재료의 표 참조) 실험이 시작되기 하루 전에 14.5cm 접시에서 각 조건에 대해.
- 실험 당일, 세포가 80-90% 컨런트와 접시를 부착하고 있는지 확인하십시오. 배지를 버리고 부착 셀에 신선한 배지를 추가합니다.
- 실험을 위한 서스펜션 셀 준비
- 실험이 시작되기 직전 14.5cm 접시에 10mL의 배양 배지에 1× 107 현탁세포(조성물 표 참조)를 신중하게 배치합니다.
- 1 차 세포를 사용하는 경우, 이전에 설명된절차(21)에
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결과
CD95 DISC에서 DISC및 해당 처리를 위해 caspase-8 채용을 분석하기 위해 CD95 DISC의 IP와 서부 블롯 분석을 결합한 고전적인 워크플로우를 설명합니다. 이를 통해 DISC에서 caspase-8 활성화의 몇 가지 주요 기능을 검출할 수 있습니다: caspase-8-활성화 매크로 분자 플랫폼의 조립, DISC에 procaspase-8의 모집, 그리고 이 시터 카스파제의처리(도 1 및 도 2). 이러한 워크플로우는 CD95L을 이용한 민감한 세포의 치료를 시간 의존적 방식으로, 그들의 용해, 항 CD95(anti-APO-1) 항체를 이용한 면역침전, 그리고 후속 서부 얼룩분석(도 3)을포함한다.
자궁 경부암 HeLa-CD95 세포는 DISC형성(26)을분석하는 .......
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토론
이 접근법은 Kischkel 외27에 의해 처음 설명되었으며 여러 그룹에 의해 그 이후로 성공적으로 개발되었습니다. 이 복합체에서 효율적인 DISC 면역 침전 및 모니터링 caspase-8 처리를 위해 몇 가지 중요한 문제를 고려해야 합니다.
첫째, 면역 침전 중에 모든 세척 단계를 따르는 것이 필수적입니다. 특히 중요한 것은 세파로즈 구슬의 최종 세척 단계와 세파로즈 구슬의 건조입니다. 이는 면역침전의 신호/잡음 비율을 높이기 위해 올바르게 수행되어야 하며, DISC에서 caspase-8 모집 및 처리를 감지할 수 있도록 허용합니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 이 사전 정리 단계가 서쪽 blotting7,23에의하여 DISC에 caspase-8 모집의 검출을 위해 필수적이지 않다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 언급했듯이, 면역 강.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는 빌헬름 산더 재단 (2017.008.02), 다이나믹 시스템 센터 (CDS), 우리의 작업을 지원하기위한 유럽 프로그램 ERDF (유럽 지역 개발 기금)와 DFG (LA 2386)에 의해 투자 인정. 우리는 우리의 실험을 지원 카리나 Guttek 감사합니다. 우리는 우리에게 1 차적인 T 세포를 제공하기 위한 더크 Reinhold 교수 (OvGU, Magdeburg)를 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
3피펫팅하는 데 사용됩니다
2개의 분리 젤을 위해 : 용해물 안티액틴 Ab Sigma Aldrich A2103 희석: PBST + 1:100 NaN.에서 구입할 수 있습니다. 희석에만 사용 : > 또는 ENZO 희석으로 구매 가능 또는 ENZO 또는 ENZO 전기 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 배지 분유에 추가함으로써 T
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 각자 하는 | 12.5% SDS 젤 | 3.28 mL 증류된 H2O 2.5 mL 트리스; PH 8.8; 1.5 M 4.06 mL 아크릴아미드 100 µ L 10% SDS 100 &마이크로; L 10% APS 7.5 & 마이크로; L TEMED 2개의 수집 젤을 위해: 3.1 mL 증류된 H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL 아크릴아미드 50 &마이크로; L 10% SDS 25 &마이크로; L 10% APS 7.5 & 마이크로; L TEMED | |
| 14.5cm 셀 접시 | Greiner | 639160 | |
| 아크릴아미드 | Carl Roth | A124.1 | |
| 에어로졸 필터 피펫 팁, 높은 회수 필터 및 넓은 오리피스가 있는 | VWR | 46620-664(북미) 또는 732-0559(유럽) | |
| P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공하거나 Enzo | ALX-805-038-C100 | 면역 침 | |
| 전 항 카스파제-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | PBST에서 1:1000 + 1 : 100 NaN3< / sub> |
| anti-caspase-3 Ab | 세포 신호 | 9662 S | 희석 : PBST에서 1:2000 + 1 : 100 NaN3< / sub> |
| P. Krammer 교수가 본 실험에서 제공한 | 항-카스파제-8 Ab C15 | ALX-804-242-C100 | : PBST 중 1:20 + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | 희석: PBST에서 1:2000 + P. Krammer 교수가 본 실험에서 제공하는 1:100 NaN3 |
| >anti-c-FLIP NF6 Ab | 또는 ENZO | ALX-804-961-0100 | 에서 구매 가능희석 : PBST에서 1:10 + P. Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공 한 1 : 100 NaN3< / sub> |
| anti-FADD 1C4 Ab | ADI-AAM-212-E | 에서 구입할 수 있습니다 | 희석 : PBST에서 1:10 + 1 : 100 NaN3< / sub> |
| anti-PARP Ab | 세포 신호 | 9542 | 희석 : PBST에서 1:1000 + 1 : 100 NaN3< / sub> |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-메르캅토에탄올 | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution 단백질 분석 염료 시약 농축액 450ml | Bio Rad | 500-0006 | P |
| . Krammer 교수가 이러한 실험에서 제공한 | CD95L | ALX-522-020-C005 | |
| 화학발광 검출기 Chem Doc XRS+ | Bio Rad에서 구입할 수 있습니다. | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | 제조사 지침에 따라 준비 |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | 희석 1:10 H2O, 냉장고에 보관 |
| 영동 완충액 | 자체 제작 | 10x 전기영동 완충액: 60.6 g Tris 288 g 글리신 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 사용 전 희석 | |
| Carl Roth | 3908.3 | ||
| 염소 안티 마우스 IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | 희석 1:10.000 in PBST + 5% 우유 |
| 염소 안티 마우스 IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | 희석 1:10.000 in PBST + 5% 우유 |
| 염소 안티-토끼 IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | 희석 1:10.000 PBST + 5% 우유 |
| 인터루킨-2 인간(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | T 세포 활성화를 위해 |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| 로딩 버퍼 4x Laemmli 샘플 버퍼, 10 mL | Bio Rad | 161-0747 | 제조업체의 지침에 따라 준비 |
| Luminata Forte Western HRP 기판 | Millipore | WBLUFO500 | |
| 용해 버퍼 | 자체 제작 | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 960 mL H 2 < / sub 추가>O | |
| 배지 DMEM F12 (1:1) w 안정 글루타민, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | 10% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.0001% 퓨로마이신을 10% FCS |
| Life Technologie의 gibco | 21875034 | 10% FCS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 중간 | |
| 분유 | Carl Roth | T145.4 | |
| 에 첨가Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | 자체 제작 | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O 희석 사용 전 1:20 | |
| PBST + 5% 우유 | 자체 제작 | 분유 50 g + 1 L PBST | |
| PHA | 세포 활성화를 위한 | Thermo Fisher Scientific | R30852801 |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | 3-5 & 마이크로 사이 사용; L |
| 단백질 A Sepharose CL-4B 비드 | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | 친화성 수지 비드 제조업체 지침에 따라 제조 |
| 스크레이퍼 | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| 셰이커 | Heidolph | ||
| 아지드 나트륨 | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo 미니 크기 트랜스퍼 스택 | Bio Rad | 170-4270 | 제조업체 지침에 따라 사용 |
| TransBlot Turbo 5x 트랜스퍼 버퍼 | Bio Rad | 10026938 | 제조업체 지침에 따라 준비 |
| TransBlot Turbo 미니 크기 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Bio Rad | 170-4270 | 제조업체의 지침에 따라 사용 |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
참고문헌
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dicke....
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