무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

Philip E. J. Smith; Taylor Slouka; Mona Dabbas; Javin  P. Oza

doi:10.3791/62866

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방법 논문

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

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DOI:

10.3791/62866

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2021년 7월 22일

Philip E. J. Smith¹^,² , Taylor Slouka¹^,² , Mona Dabbas¹^,² , Javin P. Oza¹^,²

¹Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, ²Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

이 논문에서

정오 공지

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요약

이 연구는 에스케리치아 콜라이 (E. coli )에서 세포 추출물을 제조한 후 24 시간 이내에 무세포 단백질 합성 (CFPS) 반응을 설명합니다. 무세포 자동 유도 (CFAI) 프로토콜에 대한 설명은 연구자의 감독을 줄이고 얻은 세포 추출물의 양을 늘리기 위해 개선 된 내용을 자세히 설명합니다.

초록

무세포 단백질 합성(CFPS)은 시험관 내에서 전사 및 번역 기계를 포획하는 생명공학 플랫폼으로 성장했습니다. 수많은 개발로 인해 CFPS 플랫폼은 새로운 사용자가 더 쉽게 액세스 할 수있게되었으며 응용 프로그램의 범위를 확장했습니다. 용해물 기반 CFPS 시스템의 경우, 세포 추출물은 다양한 유기체로부터 생성될 수 있으며, 단백질 합성을 증강시키기 위해 숙주의 독특한 생화학을 이용한다. 지난 20 년 동안 대장균 (E. coli) 은 경제성과 다양성으로 인해 CFPS를 지원하는 데 가장 널리 사용되는 유기체 중 하나가되었습니다. 수많은 주요 발전에도 불구하고, 대장균 세포 추출물 제조를 위한 워크플로우는 신규 사용자가 자신의 애플리케이션에 CFPS를 구현하는 데 있어 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 추출물 준비 작업 과정은 시간이 많이 걸리며 재현 가능한 결과를 얻기 위해 기술적 전문 지식이 필요합니다. 이러한 장벽을 극복하기 위해 우리는 이전에 사용자 입력 및 필요한 기술 전문 지식을 줄이는 24 시간 무세포 자동 유도 (CFAI) 워크 플로의 개발을보고했습니다. CFAI 워크플로우는 세포 추출물을 생성하는 데 필요한 노동력과 기술 기술을 최소화하는 동시에 획득한 세포 추출물의 총 양을 증가시킵니다. 여기에서는 접근성을 향상시키고 대장균 기반 CFPS의 광범위한 구현을 지원하기 위해 단계별로 워크 플로우를 설명합니다.

서론

생명 공학 응용 분야를위한 무세포 단백질 합성 (CFPS)의 사용은 지난 몇 년 동안 ^1,2,3 년 동안 크게 증가했습니다. 이러한 개발은 부분적으로 CFPS에서 발생하는 프로세스와 각 구성 요소 ^4,5의 역할을 이해하려는 노력이 증가했기 때문일 수 있습니다. 또한 최적화 된 설정 및 대체 에너지 원으로 인한 비용 절감으로 인해 새로운 사용자 ^6,7,8,9를 위해 무세포 기술을 쉽게 구현할 수있었습니다. 단백질 합성에 필요한 전사 및 번역 인자를 구현하기 위해, 세포 추출물은 종종 무세포 반응⁽¹⁰)을 구동하는데 사용된다. 최근 출판 된 사용자 가이드는 기능 추출을 생성하기위한 간단한 프로토콜을 제공하여 신규 및 숙련 된 사용자 모두에게 구현하기가 더 쉬....