이 프로토콜은 러플링(ruffling), 거대피노솜(macropinosome) 성숙의 시각화, 덱스트란 및 기타 세포 라벨링 분석의 시각화를 최적화하기 위해 연속 흡수 및 역 이미지를 사용하여 살아있는 세포에서 dextran 이미징을 보여줍니다.
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방법 논문
Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling 및 Macropinocytosis
이 논문에서
요약
초록
마크로피노사이토시스(Macropinocytosis)는 고도로 보존되어 있지만 여전히 불완전하게 이해되고 있는 과정으로, 세포 내 액체, 유동상 영양소 및 기타 물질의 흡수 및 섭취에 필수적입니다. 세포 표면 주름의 극적인 확장, 매크로피노솜 형성을 위한 폐쇄 및 내재화된 매크로피노솜의 성숙은 이 경로의 핵심 이벤트이며, 이는 형광 화물의 덩어리 추적을 기반으로 하는 기존의 컨포칼 이미징을 사용하여 포착하기 어려울 수 있습니다. 형광 덱스트랜스는 일반적으로 거대피노솜 및 기타 내포성 경로에 대한 유체 상 마커로 실험적으로 사용됩니다. 실험실에서 덱스트란 흡수의 이미징을 최적화하기 위해 채택한 방법은 배지에서 고농도의 형광 덱스트란으로 목욕한 세포의 라이브 이미징을 사용하는 것이며, 표지되지 않은 세포는 부조(검은색)로 나타납니다. 세포 주름 닫힘을 시각화하기 위해 세포 주름이 강조 표시되며, 내재화된 거대피노좀(macropinosome)은 세포 내부에 형광 액포로 나타납니다. 이 방법은 거대피노솜 특징을 시각화하는 데 최적이며 쉽게 세분화하고 정량화할 수 있습니다. 이 논문은 다양한 크기의 dextrans를 가진 경로의 이중 표지와 마크로피노솜 및 기타 엔도솜을 표시하기 위한 지질 프로브와 형광 막 단백질의 동시 발현에 대해 설명합니다. CLEM(Correlative Light and Electron Microscopy)을 사용하여 초구조 수준에서 내부화된 덱스트란을 검출하는 것도 입증되었습니다. 이러한 세포 과정은 3D를 포함한 여러 라이브 이미징 방식을 사용하여 이미지화할 수 있습니다. 종합하면, 이러한 접근 방식은 다양한 설정 및 실험 시스템에서 거대피노솜 이미징을 최적화합니다.
서론
대부분의 척추동물 세포 유형은 단세포 아메바1로 거슬러 올라가는 진화 전반에 걸쳐 선배들과 함께 액체의 비선택적 흡수에 대한 타고난 능력을 공유합니다. 거대세포작용(macropinocytosis)에 의한 고도로 보존된 유체상 흡수 과정은 아메바가 주로 영양분 획득을 위해 사용하는 반면, 척추동물 세포에서는 스트레스를 받는 영양분을 얻기 위한 공급 경로로 사용되며, 면역 세포가 조직 환경의 샘플링 및 감시를 위해 사용합니다2. 마크로피노사이토시스(Macropinocytosis)는 독특하고 큰(직경 >0.2mm) 액포와 같은 마크로피노솜, 유체 및 용질 흡수의 비선택적인 특성, 그리고 기회주의적으로 마크로피노솜으로 내재화되는 원형질막의 확장을 포함하여 다른 형태의 세포내이입증과 구별되는 특징을 가지고 있습니다3. 이러한 흡수의 비선택적인 특성은 필수 용해성 및 원형질막 단백질을 세포 표면으로 다시 재활용하여 구하기 위해 분류 및 재활용이 신속하게 이루어져야 함을 의미합니다. 거대피노솜으로 흡수된 대부분의 물질은 리소좀에서 분해될 운명이며, 거대피노솜 성숙 및 다른 엔....
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프로토콜
1. 35mm 유리 바닥 접시에 세포 준비 (Day 0)
- 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 10% 열 비활성화(RAW264.7의 경우) 또는 일반 태아 송아지 혈청 및 1% L-글루타민이 보충된 완전한 배지에서 세포주를 유지하고 계대절시킵니다.
- 35mm 유리 바닥 접시에서 24시간 내에 60% 포화도를 달성하기 위해 적절한 수의 셀을 플레이트에 넣습니다.
참고: 권장 세포 밀도는 여기에 설명된 RAW264.7, BV2 미세아교세포 및 MDA-MB 231 유방암 세포의 경우 0.15 x 106 cells/mL 2mL에서 0.25 x 106 cells/mL 사이입니다.
2. 형광 DNA 플라스미드 transfection(1일차) - 선택 사항
참고: 서로 다른 형광 표지된 단백질 및 프로브는 클론 세포주에서 일시적 또는 안정적으로 발현되어 초기 엔도솜, 후기 엔도솜 또는 리소좀과 같은 내세포 경로의 액틴 러플 및 구획을 특이적으로 라벨링할 수 있습니다.
- 제조업체의 지침에 따라 지질 기반 t....
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결과
고농도의 형광 덱스트란에 담근 표지되지 않은 살아 있는 세포를 이미징하는 접근 방식은 거대세포증가증을 추적하기 위한 기존 이미징 기술에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 이미지를 릴리프하게 표시하면 세포체가 검은색으로 나타나고 밝은 형광 배경에서 극적인 세포 표면이 주름을 잡는 것을 더 잘 시각화할 수 있으며, 그림 1A와 같이 TMR 덱스트란(70kDa)으로 채워진 매크로피노좀의 유체상 내재화가 이루어집니다. 이 최대 강도 투영에서 암세포는 주름진 경계에서 세포로 들어가는 거대피노솜으로 기록됩니다. 배경이 없거나 초점이 맞지 않는 형광이 없는 세포의 검은색 내부는 매크로피노솜의 고대비 정의를 제공하여 크기와 모양을 정확하게 묘사하고 그림 1B에 표시된 것처럼 성숙 중에 발생하는 변화를 드러냅니다. 동형 융합은 크기 증가를 동반하며(그.......
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토론
이 논문은 형광 덱스트란으로 연속적으로 목욕하는 세포의 실시간 이미징과 라벨링되지 않은 세포의 검은색 배경에서의 흡수를 시각화하는 것을 기반으로 덱스트란 라벨링을 사용하여 거대세포증가증을 추적하는 보다 전통적인 방법의 변형을 설명합니다. 최적화된 프로토콜은 서로 다른 세포 내 소포를 구별할 수 있는 수단을 제공하고 여러 macropinocytotic 및 endocytic cargos 및 protein의 공간-시간 추적을 가능하게 합니다. 유체상 흡수의 동적 과정을 모니터링하기 위해 세포를 덱스트란 배지에 담그는 방법은 Dictyostelium23에서 처음 시연되었습니다. 다른 이전 연구의 예에서도 세포를 구호하여 흡수를 볼 수 있습니다 15,16. 이 논문에 설명된 프로토콜은 이 접근법에 대.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 Tatiana Khromykh의 전문적인 기술 지원에 감사드립니다. 형광 이미징은 호주 암 연구 재단(Australian Cancer Research Foundation)이 자금을 지원하는 암 초미세 구조 및 기능 시설(Cancer Ultrastructure and Function Facility)을 통합한 IMB 현미경에서 수행되었습니다. 전자 현미경은 UQ의 현미경 및 미시분석 센터에서 수행되었습니다. 기금은 호주 국립 보건 의료 연구 위원회(JLS APP1176209)와 호주 연구 위원회(DP180101910)로부터 받았습니다. NDC는 실리콘 밸리 커뮤니티 재단(Silicon Valley Community Foundation)의 자문 기금인 챈 저커버그 이니셔티브 DAF의 보조금 번호 2020-225648에 의해 CZI 이미징 과학자로 지원됩니다. YH는 호주 정부의 박사 장학금과 율길바 알츠하이머 연구 프로그램의 자금 지원을 받았습니다. Z-JX는 중국과학원(Chinese Academy of Science) 장학금의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2% 오스뮴 테트록사이드 | ProSciTech | EMS19192 | |
| 647-트랜스페린 | 분자 프로브, 인비트로겐 | T23366 | |
| BV2 세포 | Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)- | ||
| CpG (Class B) B | Integrated DNA Technologies | 맞춤 주문 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 at 10 kDa MW | Life Technology Australia Pty Ltd | D22910 | |
| Dextran Alexa Fluor 647 at 10 kDa MW | Life Technology Australia Pty Ltd | D22914 | |
| Dextran Oregon Green 488, 70 kDa MW | Life Technology Australia Pty Ltd | D1818 | |
| 덱스트란 테트라메틸로다민, 70 kDa MW | Life Technology Australia Pty Ltd | D7173 | |
| DMEM 배지, 피루브산 나트륨 및 L-글루타민 | Gibco Invitrogen | #11995 | |
| 태아 송아지 혈청 | Interpath Services Pty Ltd | SFBS-F | |
| 글루타르알데히드 수용액, EM 등급 25% | ProSciTech | C002 | |
| Jeol 1011 전자 현미경 | JEOL-L-Glutamine | ||
| Gibco Invitrogen | 25030081 | ||
| Lipofectamine 2000 | Gibco Invitrogen | 11668019 | |
| MatTek 유리 바닥 접시 35mm, 코팅되지 않은 그리드 | MatTek Corporation | P35G-2-14-CGRD | |
| MatTek 유리 바닥 접시 35mm 코팅되지 않은 | MatTek Corporation | P35G-1.5-14C | |
| MDA-MB 231 셀 | ATCC | HTB-26 | |
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| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium 1640, without L-glutamine | Gibco Invitrogen | #21870 | |
| Ultrapure LPS | Jomar Life Research Pte Ltd | TLR-3PELPS | |
| 우라닐 아세테이 | ProSciTech | C079 | |
| Zeiss 도립 LSM880 컨포칼 현미경 | Zeiss | - |
참고문헌
- King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
- Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A.
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