마우스 뇌의 자유 부동 면역 염색

요약

이 프로토콜은 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌 조직학 연구를위한 효율적이고 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.

초록

마우스 뇌의 면역 히스토케미칼 염색은 에너지 대사 및 기타 신경 생물학적 과정의 조절의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 신경 과학에 일반적으로 사용되는 일상적인 기술입니다. 그러나, 품질, 신뢰성, 그리고 뇌 역사학 결과의 재현성 실험실 마다 다를 수 있습니다. 각 염색 실험에 대해, 종, 조직, 표적 단백질 및 시약의 작업 조건의 차이에 따라 주요 절차를 최적화할 필요가 있습니다. 이 논문은 대동맥 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 스테인링, 조직 마운팅 및 이미징을 포함하여 신뢰할 수있는 워크플로우를 자세히 보여줍니다.

또한 연구원의 개별적인 필요를 충족시키기 위하여 이 절차를 수정하는 방법 토론입니다. 이 프로토콜의 신뢰성과 효율성을 설명하기 위해, 페리뉴런 그물은 마우스 두뇌에 있는 항 AVP 항체를 가진 비오틴 표지된 Wisteria florbunda agglutinin (WFA) 및 아르기닌 바소프레신 (AVP)로 염색되었습니다. 마지막으로 전체 절차에 대한 중요한 세부 정보가 해결되었으며 이 프로토콜의 이점은 다른 프로토콜과 비교됩니다. 이 논문은 마우스 뇌 조직의 자유로운 부동 면역 염색을 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에 따라 이 과정을 통해 주니어 및 고위 과학자 모두 면역 염색 연구의 품질, 신뢰성 및 재현성을 쉽게 개선할 수 있습니다.

서론

비만과 관련 된 comorbidities의 보급은 엄청난 사회 경제적 부담을 일으키는 원인이 되는 전염병 수준에 도달했습니다^1,2. 다양한 마우스 모델은 비만에 대한 책임이 있는 생물학적 과정을 더 잘 이해하기 위해 개발되었다^3,4. 중앙 메커니즘은 이러한 동물 모델에서 에너지 항상성의 조절에 중요 하기 때문에, 마우스 두뇌의 신경 해부학 연구이 분야에서 필요한 기술이 되었다. 그러나, 뇌 조직학 기술의 품질, 신뢰성 및 재현성은 여러 가지 이유로 실험실 과 심지어 연구자 들 사이에서 상당히 변화 (예를 들어, 항체, 조직, 치료, 종, 연구 목표). 따라서 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌의 조직학적 연구를 위한 일반적인 프로토콜을 수립할 필요가 있다. 한편, 초보자는 신속하게 학습, 마스터, 자신의 개별 요구를 충족하기 위해이 프로토콜을 조정할 수 있습니다.

면역조직화학염색은 다양한 조직(예를 들어, 뇌 및 말초 조직)^5,6

프로토콜

C57BL/6J 마우스는 남녀(8-16주)의 쥐가 본 연구에서 사용되었다. 모든 동물과 모든 절차의 치료는 의학의 베일러 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

1. 관류

참고: 1.1 - 1.6 단계는 연기 후드로 수행됩니다.

1. 마취
   1. 이소플루란 5mL( 재료 표 참조)를 건조기 바닥에 놓인 종이 타월에 붓습니다. 건조기 내부의 구멍이 뚫은 장벽에 마우스를 소개하고 호흡의 징후가 사라질 때까지 기다립니다.
      참고 : 호흡없이, 마우스는 여전히 짧은 기간 동안 심장 박동을 가지고 있으며, 심장 박동이 사라지기 전에 퍼프됩니다.
   2. 진행하기 전에 발가락 핀치에 반사가 없는지 확인합니다.
   3. 각 발을 통해 핀을 운전하여 거품 보드에 마우스를 고정합니다. 거품 보드가 액체 유출을 수집하기 위해 트레이에 배치되었는지 확인합니다.
2. 심장 노출
   1. 흉부와 복부를 통해 중간선을 따라 세로 피상절개를 한 다음 흉부와 복부의 근육 벽을 노출하기 위해 피부를 옆으로 움직입니다. 다음으로, 간과 창자를 노출하는 근육 층에 절....

결과

이 프로토콜의 흐름 차트는 그림 1에 간략하게 설명되어 있습니다. 이 실험실의 극저온 절제 절차는 5개의 두뇌 견본이 동시에 단면된 그림 2A에서 입증됩니다. 뇌 섹션의 장착은 도 2B에 표시되며, 뇌 섹션이 있는 완전히 장착된 슬라이드는 도 2C에 설명되어 있습니다. 도 3에서, 브레그마 -0.82mm에서 WFA 및 AVP의 공동 염색을 통한 마우스 뇌 섹션의 대표적인 형광 면역히스토화학 이미지가 구형 핵 및 슈프라옵틱 핵에서 관찰되었다. WFA 신호는 전방 시상 하부 및 망상 핵의 주변 영역에서 관찰되었다.

토론

이 프로토콜은 관류, 조직 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 장착 및 이미징을 포함한 마우스 뇌의 신경 해부학 적 연구를위한 확립 된 방법을 제공합니다. 그러나 일관되고 신뢰할 수 있는 결과에 필수적인 몇 가지 주요 세부 사항을 최적화해야 합니다.

관류의 품질은 성공적인 염색에 매우 중요합니다. 혈액세포(예: 적혈구)가 인공적인 '양성' 염색¹⁰을 생성할 수 있다는 점을 감안할 때 혈액이 뇌에 남아 있다면 염색 결과는 영향을 받을 수 있습니다. 우리는 일반적으로 혈액이없는 뇌의 결과 관류의 높은 품질을 나타내는 갈색 회색 간의 존재를 추론. 이 프로토콜에 사용되는 자동 관류 펌프는 단기간 내에 한 동물을 성공적으로 perfuse하는 데 도움이 됩니다. 고정이 부족하면 후속 절차에서 부드럽고 깨지기 쉬운 뇌 섹션을 생성하며, 고정을 통해 단백질의 향상된 포름알데히드 교차 연결로 인한 항원 반응의 감도를 감소시게 됩니다. 다른 조건이 테스.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Alexa Flour 594 당나귀 안티-토끼 IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% 자당	VWR	470302	30 g 자당을 PBS 100 mL로 분출;
중성 완충 포르말린	VWR	16004-128	10%, 25 ° C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q 주사기	BD	309597
48 웰 세포 배양 플레이트	Corning	3548
6웰 세포 배양 플레이트	Corning	3516
DAPI를 사용한 페이딩 방지 마운팅 배지	Vector Laboratories	H-1200
오토클레이브 플라스틱 건조제	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP 항체	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	사용자 선호	사항 해당 없음	20% 글리세롤, 30% 에틸렌 글리콜 및 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	해당 없음
현미경 슬라이드 박스(50개)	VWR	해당
PBT	사용자 선호 사항	해당 없음	2.5 mL의 Triton X-100을 1000 mL의 PBS
관류에 용해 두 개의 자동 관류 시스템	Leica	39471005
Phosphate-buffered Saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 ° C, pH 7.3-7.5, 1x 구성 : 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM 인산염 버퍼
슬라이드 Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
염화나트륨	RICCA 화학	7220-32	0.9 %, 25 ° C, pH 7.4
스트렙타비딘 단백질, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA 항체	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 스캐너	Zeiss	해당
Zen 3.1 소프트웨어			스캐너 소프트웨어

없음없음