방법 논문

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

DOI:

10.3791/62878

⸱

2021년 10월 7일

 ,  , 
1Faculty of Biology, Technion - Israel Institute of Technology

이 논문에서

요약

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공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

초록

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최근 몇 년 동안, 리보솜은 우리의 mRNA를 해독 할뿐만 아니라 혼잡 한 세포 환경으로 폴리펩티드 사슬의 출현을 안내한다는 것이 분명 해졌다. 리보솜은 막 표적화 인자의 공간적 및 동역학적으로 조절된 결합, 효소 변형 및 접이식 샤페론을 위한 플랫폼을 제공한다. 심지어 고차 올리고머 복합체로의 조립뿐만 아니라 단백질-단백질 네트워크 형성 단계도 합성과 배위되는 것으로 최근에 발견되었다.

여기에서는 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하기 위해 개발 된 방법 인 선택적 리보솜 프로파일 링 에 대해 설명합니다. 우리는 공동 번역 상호 작용기와 함께 리보솜 - 초기 사슬 복합체를 캡처하는 데 필요한 다양한 친화성 정제 단계뿐만 아니라 mRNA 추출, 크기 배제, 역전사, 딥 시퀀싱 및 빅 데이터 분석 단계를 자세히 설명합니다 거의 코돈 분해능에서 공동 번역 상호 작용을 해독하는 데 필요합니다.

서론

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Se lective Ribosome Profiling (SeRP)은 현재까지 1,2,3,4,5,6 직접적인 방식으로 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하고 특성화하는 유일한 방법입니다. SeRP는 코돈 분해능 2,7에 가까운 리보솜을 번역하는 모든 인자의 상호작용에 대한 글로벌 프로파일링을 가능하게 한다.

이 방법은 성장하는 세포의 플래시 동결과 활성 번역 보존에 의존합니다. 이어서, 세포 용해물은 RNase I로 처리되어 "리보솜 발자국"으로 불리는 리보솜-보호된 mRNA 단편을 제외한 세포 내의 모든 mRNA를 소화시킨다. 그런 다음 샘플을 두 부분으로 나눕니다. 한 부분은 모든 세포 리보솜 발자국의 분리에 직접 사용되며, 이....

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프로토콜

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1. 선택적 리보솜 프로파일링을 위한 균주 생성

참고: Selective Ribosome Profiling (SeRP)은 리보솜-초기 사슬 복합체와의 상호작용 모드를 평가하기 위해 관심 인자의 친화성 정제에 의존하는 방법이다. 상동성 재조합(9) 및 CRISPR/Cas910 기반 방법은 친화성 정제를 위해 다양한 관심 인자를 태그와 융합시키기 위해 이용된다. 이러한 태그는 GFP, GFP-트랩 친화성 정제를 위해, IgG-세파로스 비드 정제를 위한 TAP-태그 뿐만 아니라 아비딘 또는 스트렙타비딘에 의해 정제된 AVI-태그이며, 최근 몇 년 동안의 몇 가지 성공적인 예를 열거한다.

  1. 성장 또는 기능적 분석을 수행하여 태깅이 단백질 기능에 영향을 미치지 않았 음을 검증하십시오. N' 대 C' 터미널 태깅을 평가해야 합니다.
    참고: 리보솜(rRNA)과 다양한 인자의 많은 리보솜 결합 도메인은 고도로 충전되어 있어 고도로 대전된 태그(예: 폴리히스티딘)를 사용하는 것이 바람직하지 않습니다.

2. 문화 성장

  1. 원하는 태그가 붙은 단....

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결과

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이 프로토콜의 흐름도(도 1)에 예시된 바와 같이, 세포를 로그 페이즈로 성장시킨 다음, 여과에 의해 신속하게 수집하고, 극저온 분쇄에 의해 용해시켰다. 그런 다음 용해물을 두 개로 나눴습니다: 하나는 총 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고 다른 하나는 선택된 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고, 우리는 태그된 단백질-리보솜-초기 사슬 복합체를 풀다운하기 위해 친화성 정제를 수행했다. 우리는 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 태그된 단백질 발현 및 풀다운의 성공을 웨스턴 블롯 분석에 의해 보장하였다. 우리는 작은 RNA 전기영동(2100 BioAnalyzer 시스템)에 의해 일반적으로 20-45nt 길이인 리보솜 보호 풋프린트의 분리를 검증하여 시스템 매뉴얼에 따라 5-10nt 크기 시프트 검출을 가능하게 했습니다(그림 3). 그런 다음 심층 시퀀싱.......

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토론

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여기서, 프로토콜은 코돈 분해능에 가까운 공동-번역 상호작용을 캡처하기 위한 선택적 리보솜 프로파일링 접근법을 상세히 설명한다. 리보솜이 붐비는 세포질로 출현하는 초기 사슬을 조정하기위한 허브로 상승함에 따라, 이것은 기능적 프로테옴을 보장하고 다양한 질병을 연구하는 데 필요한 다양한 공동 번역 상호 작용을 확인하고 특성화하는 중요한 방법입니다. 현재까지, SeRP는 생체내14,15,16에서 직접적인 방식으로 이러한 상호작용을 포착하고 특성화할 수 있는 유일한 방법이다.

첫 번째이자 가장 중요한 단계는 세포 수집과 용해입니다. 몇 초 안에 진행중인 번역을 플래시 동결 후 동결 상태에서 용해하여 캡처하는 것이 필수적입니다. 세포 수집은 리보솜 유출을 피하고 빠르게 발생할 수있는 스트레스 번역 반응을 .......

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공개 사항

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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우리는 유익한 토론을 해준 모든 실험실 구성원들과 원고의 비판적 독서에 대한 무하마드 Makhzumy에게 감사하고 싶습니다. 이 작품은 ISF (이스라엘 과학 재단) 보조금 2106/20에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3'-인산화된 28 nt RNA 제어 올리고뉴클레오티드IDT맞춤 주문RNase 무료 HPLC 정제; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC
GACGCGA/3Phos/-3'Absolute
ethanolVWR20821
Acid phenol– chloroformAmbionAM9722
항체: mouse monclonal anti-HAMerck1158381600112CA5
AprotininRothA162.3
ATP*NEBP0756S10 mM
Bacto 한천BD214030
Bacto peptoneBD211820
Bacto tryptoneBD
박토 효모 추출물BD212720
베스타틴 염산염로스2937.2
클로로포름머크102445
CircLigase II ssDNA 리가제 *진앙지CL9025K100 U/μ L
콜로이드 Coomassie 염색 용액Roth4829
cOmplete, EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 정제Roche Diagnostics29384100
CycloheximideBiological IndustriesA0879
DEPC 처리 및 멸균 여과수 *Sigma95284
D-Glucose 무수MerckG5767-500G
DiethylpyrocarbonateRothK028
Dimethylsulfoxide*Sigma-Aldrich276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*Thermo Fisher ScientificSM1313
DNA 로딩 염료*Thermo Fisher ScientificR06316×
DNase I, 재조합Roche4716728001RNAse free
dNTP 솔루션 세트*NEBN0446S
EDTA*Roth8043
글리세롤VWR24388.260.
글리신 용액: Sigma-Aldrich67419-1ML-F1 M
GlycoBlueAmbionAM951615 mg / mL
HepesRothHN78.3
HF Phusion 중합 효소 *NEBM0530L
HK S. cerevisiaeSigma-AldrichH6380-1.5KU
염산AppliChemA1305
이소프로판올시그마-알드리치33539
이소프로필&베타;-D-1-티오갈락토피라노시드로스CN08
카나마이신로스T832.4
KCl로스6781.1
KH2PO4Roth3904.1
루펩틴로스CN33.4
링커 L(rt)IDT맞춤 주문
액체 질소
MgCl2RothKK36.3
Na2HPO4RothP030.2
Na2HPO4· 2H2ORothT879.3
NaCl*InvitrogenAM976065 M
NaH2PO4· H2ORothK300.2
NHS 활성 세파로스 4 고속 흐름 비드GE Life Sciences17090601
Nonidet P 40 대체Sigma74385
Pepstatin ARoth2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluorideRoth6367
프리캐스트 겔Bio-Rad567103410% 및 12%
RNase IAmbionAM2294
SDS, 20%AmbionAM9820RNase free
아세트산나트륨*AmbionAM97403 M, pH 5.5
아지드화나트륨MerckS8032-100G
염화나트륨Roth9265
수산화나트륨*SigmaS27701 N
설탕시그마-알드리치16104
SUPERase-In RNase 억제제AmbionAM2694
Superscript III Reverse Transciptase*Invitrogen18080-044
SYBR Gold*InvitrogenS11494
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제*NEBM0201L
T4 RNA 리가제 2*NEBM0242L
TBE 폴리아크릴아미드 겔*NovexEC6215BOX8%
TBE– 요소 폴리아크릴아미드 겔*NovexEC68752BOX10%
TBE– 요소 폴리아크릴아미드 겔*NovexEC6885BOX15%
TBE– 요소 샘플 버퍼*NovexLC68762회;
TrisRoth4855
Tris*AmbionAM98511 M, pH 7.0
Tris*AmbionAM98561 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE 버퍼*Invitrogen15581-044
* - 라이브러리 준비
가스켓 및 스프링 클램프, 90 mm,Millipore 
접지 조인트 플라스크 1 L,MilliporeXX1504705
211699품 XX1009020

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  2. Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryo....

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태그

RNASaccharomyces cerevisiae

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