선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

요약

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

초록

최근 몇 년 동안, 리보솜은 우리의 mRNA를 해독 할뿐만 아니라 혼잡 한 세포 환경으로 폴리펩티드 사슬의 출현을 안내한다는 것이 분명 해졌다. 리보솜은 막 표적화 인자의 공간적 및 동역학적으로 조절된 결합, 효소 변형 및 접이식 샤페론을 위한 플랫폼을 제공한다. 심지어 고차 올리고머 복합체로의 조립뿐만 아니라 단백질-단백질 네트워크 형성 단계도 합성과 배위되는 것으로 최근에 발견되었다.

여기에서는 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하기 위해 개발 된 방법 인 선택적 리보솜 프로파일 링 에 대해 설명합니다. 우리는 공동 번역 상호 작용기와 함께 리보솜 - 초기 사슬 복합체를 캡처하는 데 필요한 다양한 친화성 정제 단계뿐만 아니라 mRNA 추출, 크기 배제, 역전사, 딥 시퀀싱 및 빅 데이터 분석 단계를 자세히 설명합니다 거의 코돈 분해능에서 공동 번역 상호 작용을 해독하는 데 필요합니다.

서론

Se lective Ribosome Profiling (SeRP)은 현재까지 1,2,3,4,5,6 직접적인 방식으로 생체 내에서 공동 번역 상호 작용을 캡처하고 특성화하는 유일한 방법입니다. SeRP는 코돈 분해능 ^2,7에 가까운 리보솜을 번역하는 모든 인자의 상호작용에 대한 글로벌 프로파일링을 가능하게 ^한다.

이 방법은 성장하는 세포의 플래시 동결과 활성 번역 보존에 의존합니다. 이어서, 세포 용해물은 RNase I로 처리되어 "리보솜 발자국"으로 불리는 리보솜-보호된 mRNA 단편을 제외한 세포 내의 모든 mRNA를 소화시킨다. 그런 다음 샘플을 두 부분으로 나눕니다. 한 부분은 모든 세포 리보솜 발자국의 분리에 직접 사용되며, 이는 세포에서 진행중인 모든 번역을 나타냅니다. 두 번째 부분은 관심 인자와 관련된 리보솜의 특정 서브세트의 친화도-정제를 위해 사용된다: 예를 들어: 변형 효소, 전좌 인자, 폴딩 샤페론, 및 복합체-어셈블리 상호작용. 친화도 정제된 리보솜 발자국은 집합적으로 인터랙텀(interactome)이라고 불린다. 이어서, 리보솜-보호된 mRNA를 추출하고 cDNA 라이브러리 생성에 사용하고, 이어서 딥 시퀀싱을 수행한다.

전체 트랜스라톰 및 인터랙토메 샘플의 비교 분석은 관심 인자와 관련된 모든 orfs의 동정뿐만 아니라 각 orf 상호작용 프로파일의 특성화를 허용한다. 이 프로파일은 정확한 결합 개시 및 종결 서열을 보고하며, 이로부터 해독된 코돈 및 신흥 폴리펩티드 쇄의 각각의 잔기를 추론할 수 있을 뿐만 아니라, 상호작용 동안 리보솜 속도 변이(^7,8)에 대해서도 보고한다. 그림 1은 프로토콜을 회로도로 보여줍니다.

그림 1: SeRP 프로토콜의 개요 이 프로토콜은 7-10 일 이내에 전체적으로 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

1. 선택적 리보솜 프로파일링을 위한 균주 생성

참고: Selective Ribosome Profiling (SeRP)은 리보솜-초기 사슬 복합체와의 상호작용 모드를 평가하기 위해 관심 인자의 친화성 정제에 의존하는 방법이다. 상동성 재조합⁽⁹) 및 CRISPR/Cas9¹⁰ 기반 방법은 친화성 정제를 위해 다양한 관심 인자를 태그와 융합시키기 위해 이용된다. 이러한 태그는 GFP, GFP-트랩 친화성 정제를 위해, IgG-세파로스 비드 정제를 위한 TAP-태그 뿐만 아니라 아비딘 또는 스트렙타비딘에 의해 정제된 AVI-태그이며, 최근 몇 년 동안의 몇 가지 성공적인 예를 열거한다.

1. 성장 또는 기능적 분석을 수행하여 태깅이 단백질 기능에 영향을 미치지 않았 음을 검증하십시오. N' 대 C' 터미널 태깅을 평가해야 합니다.
   참고: 리보솜(rRNA)과 다양한 인자의 많은 리보솜 결합 도메인은 고도로 충전되어 있어 고도로 대전된 태그(예: 폴리히스티딘)를 사용하는 것이 바람직하지 않습니다.

2. 문화 성장

1. 원하는 태그가 붙은 단백질을 함유한 구성된 효모 배양물(균주 BY4741 기준)을 액체 효모-추출물-펩톤-덱스트로스(YPD)가 풍부한 배지 또는 합성 덱스트로스(SD) 최소 배지(황산암모늄이 포함된 1.7g/L 효모 질소 염기 또는 황산암모늄이 없는 1.7g/L 효모 질소 염기 1g/L 모노소듐 글루탐산, 2% 글루코스 및 아미노산의 완전하거나 적절한 혼합물로 보충)에서 배양하십시오.
2. 세포 배양액 250-500 mL를 0.5_OD600 (미드-로그)로 성장시키고, 30°C에서, 적절한 배지에서 성장시킨다.

3. 세포 수집 및 용해

1. 유리 여과 시스템 (1 L 유리 깔때기, 진공 베이스 및 캡, 스테인레스 스틸 스크린, 개스킷 및 스프링 클램프, 90 mm; 접지 조인트 플라스크 1 L)이있는 0.45 μm 니트로 셀룰로오스 블롯팅 멤브레인 상에서 진공 여과하여 세포를 신속하게 수집합니다.
2. 플래쉬 동결된 세포를 동결시키고, 펠릿화된 세포를 주걱으로 긁어내고, 즉시 이들을 액체 질소가 채워진 50 mL 튜브에 침지시킨다.
   정지 지점: 세포는 최대 3-4주 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
3. 믹서 밀에서 극저온 분쇄에 의한 세포 용해를 수행한다: 30 Hz에서 2분 동안 2회, 용해 완충액 1 mL를 사용한다( 표 1 참조). 밀링 사이의 액체 질소에서 차가워집니다.

시약	시료당 양(μL)	최종 농도
10 mg/mL CHX (사이클로헥시미드)	220	0.5 밀리그램/mL
1M 트리스-HCl pH 8.0	88	20 밀리지미터
3엠 KCl	205.7	140 밀리지미터
1MMgCl2	26.4	6 밀리지미터
1M PMSF	4.4	1 밀리지미터
NP-40	4.4	0.10%
프로테아제 억제제	2 정
DNase I	8.8	0.02 U/mL
최종 볼륨	4,400

표 1: 용해 완충액 마스터 믹스에 대한 레시피.

참고: 용해 완충액은 관심있는 단백질이 매우 불안정한 경우 더 많은 프로테아제 억제제 (예 : 베스타틴, 루펩틴, 아프로티닌 등)를 포함하도록 변경 될 수 있지만 다음 단계에서 조립 된 리보솜의 크고 작은 서브 유닛을 유지하기 위해 EDTA를 피하는 것이 중요합니다. 유사한 이유로, 항상 완충 용액 내에 적어도 6 mM_MgCl2 를 유지한다.

주의: HCl은 부식성이 강하고 PMSF는 독성이 있습니다. 장갑을 끼고 조심스럽게 다루십시오.

4. 30,000 x g, 4°C에서 2분 동안 원심분리하여 용해물을 맑게 하고 상층액을 수집한다.

4. SeRP를 위한 리보솜-초기 사슬 복합체의 정제

1. 각 실험에 대해 상청액을 두 부분으로 나눕니다. 각각 다른 마이크로 원심분리 튜브에 있습니다 : 총 RNA 샘플 (∼200 μL) 및 면역 정제 (IP) 샘플 (∼700 μL) 트랜스라톰 샘플.
2. 전체 RNA 샘플 처리
   1. 4°C에서 25분 동안 10 U의 RNase I을 사용하여 총 RNA 샘플을 소화하고; 회전 믹스 랙으로 30RPM으로 회전합니다.
      참고: 폴리솜 프로파일링을 사용하여 소화 상태를 보정하여 모노솜 피크의 과소화 또는 과소 소화를 보장할 수 있습니다.
   2. 표 2에 기재된 바와 같이 수크로오스 쿠션 마스터 믹스를 제조한다.

시약	시료당 양(μL)	최종 농도
자당 50%	200	25%
1M 트리스-HCl pH 8.0	8	20 밀리지미터
3엠 KCl	18.7	140 밀리지미터
1MMgCl2	4	10 밀리지미터
100 밀리그램/mL CHX	0.4	0.1 밀리그램/mL
프로테아제 억제제	태블릿 1개
최종 볼륨	400

표 2: 자당 쿠션 마스터 믹스의 레시피.

3. 샘플을 400 μL의 수크로오스 쿠션 상에 로딩하고, 245,000 x g 및 4°C에서 90분 동안 TLA120-로터에서 원심분리한다.
4. 진공 펌프로 상층액을 신속하게 제거하고 펠렛을 150 μL 용해 완충액으로 오버레이하십시오. 펠렛을 4°C 및 300 RPM에서 1시간 동안 진탕하여 재현탁시킨다.
5. 피펫팅에 의해 잔류 펠렛을 재현탁시키고 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
   참고: 총 RNA의 100-200 μg은 일반적으로 전체 트랜스라톰의 리보솜 프로파일링에 충분합니다. 리보솜-초기 사슬 복합체 친화성 정제(¹¹ )의 가장 널리 퍼진 오염물질인 rRNA 오염을 감소시키기 위해 rRNA 고갈 단계를 추가할 수 있다(자세한 내용은 논의 참조).

3. 면역정제 시료 처리
   1. 샘플 당 100-400 μL의 친화도-결합 매트릭스 (70% EtOH 중의 1:1 항체-컨쥬게이션된 비드)를 3 x 1 mL 용해 완충액 (DNase I 및 프로테아제 억제제 없이)으로 세척하고; 친화성 매트릭스를 용해 완충액에 재현탁시킨 다음, 5분 동안 4°C에서 회전 믹스 랙으로 30 RPM에서 회전시킨다. 3,000 x g, 4°C에서 30초 동안 원심분리하여 침전시켰다. 상부 액체를 버리십시오. 세 번 반복하십시오.
   2. 친화도 결합 매트릭스와 함께 RNase I의 A260 nm 단위 당 10 U를 사용하여 면역정제 샘플을 소화한다 (예를 들어, 샘플 당 100-400 μL의 GFP-TRAP).
   3. 단백질을 친화성 매트릭스에 결합시키기 위해, 4°C에서 회전 믹스 랙과 함께 30 RPM에서 25분 동안 회전시킨다.
   4. 표 3에 상술된 바와 같이 세척 완충액 마스터 믹스를 준비한다.

시약	시료당 양(μL)	최종 농도
10 밀리그램/mL CHX	50	0.1 밀리그램/mL
1M 트리스-HCl pH 8.0	100	20 밀리지미터
3엠 KCl	233	140 밀리지미터
1MMgCl2	50	10 밀리지미터
1M PMSF	5	1 밀리지미터
NP-40	0.5	0.01%
프로테아제 억제제	2 정
50% 글리세롤	1,000	10%
최종 볼륨	5,000

표 3: 세척 완충액 마스터 믹스에 대한 레시피.

5. 친화도 결합 매트릭스를 1 mL의 세척 완충액으로 3회 세척하고, 매번 ~1분 동안 혼합하고, 믹스 랙에서 30 RPM에서, 4°C에서 회전시킨다.
6. 4°C에서 30초 동안 3,000 x g 에서 원심분리하여 침전물을 침전시켰다. 상부 액체를 버리십시오.
7. 1 mL 세척 완충액에서 두 번 더 세척하고, 매번 5분 동안 혼합팩에서 회전시키고, 4°C에서 30 RPM으로 회전시킨다.
8. 3,000 x g 및 4°C에서 30 s 동안 원심분리하여 침전시켰다.
9. 동일한 양의 2x 샘플 버퍼로 단백질 용출을 위해 50μL의 비드를 사용하십시오. RNA 추출을 위해 나머지 비드를 사용하십시오.
10. 3,000 x g, 4°C에서 30초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화하고 상부 액체를 버린다.
11. 액체 질소에서 동결시키고 -80°C에서 저장한다. 후속 RNA 추출을 위해 이러한 샘플을 사용하십시오.
    정지 지점: 샘플은 -80°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관할 수 있습니다. 이는 중지 지점이 될 수 있습니다.
12. 각 단계의 분취량(∼10 부피%, 혼합 후)으로 웨스턴 블롯 또는 쿠마시 염색에 의한 친화성 정제 단계의 성공을 평가한다. 항상 친화성 매트릭스에 대한 비특이적 결합에 대한 대조군으로서 태그가 지정되지 않은 WT 균주에 대한 모의 IP를 사용하십시오.
    참고 : 높은 비특이적 배경은 소금 / 세제 농도가 증가하는 추가 세척 단계를 통해 극복 할 수 있습니다. 일시적 상호작용은 다양한 가교제 처리에 의해 안정화될 수 있으며, 예를 들어, 살아있는 세포의 파라포름알데히드 (PFA) 처리-성장 배지에 0.4%-1% PFA를 2-5분 동안 첨가하고, 이어서 글리신 (0.3 M) 담금질에 의해 3분 동안 켄칭하는 것이 매우 권장된다.
    주의: 파라포름알데히드는 발암물질로 의심됩니다. 파라포름 알데히드는 빠르게 증발하고 부식성이 있기 때문에 화학 안전 후드에서 작업하고 두 겹의 장갑을 착용하십시오.

5. 깊은 시퀀싱을위한 cDNA 라이브러리 준비

1. RNA 추출
   참고: RNase가 없는 붙지 않는 1.5mL 튜브를 사용하여 RNA 또는 DNA 고갈을 방지하십시오.
   1. 단계 4.2.5 및 4.3.12로부터의 샘플을 얼음 상에서 해동시키고, 샘플을 10 mM Tris-HCl pH 7.0으로 재현탁시켜 700 μL의 최종 부피로 재현탁시킨다.
      주의: 산-페놀과 클로로포름은 휘발성이며 해롭다. 화학 안전 후드에서 작업하십시오.
   2. 40 μL의 20% SDS를 0.7 mL 총 RNA 또는 IP 용출액에 첨가한다. 몇 번 닫고 반전하십시오. 단백질 침전은 샘플을 흰색으로 바꿔야합니다.
   3. 0.75 mL의 미리 가온된 산-페놀:클로로포름을 샘플에 첨가하십시오. 튜브를 단단히 밀봉하고 열 혼합기에서 1,400RPM에서 5분 동안 그리고 65°C에서 흔들어 주십시오. 얼음 위에서 샘플을 5 분 동안 식히십시오.
   4. 튜브를 단계 5.1.3에서 원심분리한다. 2 분 동안 20,000 x g 에서. 상단 수층을 신선한 튜브로 옮기고 0.7 mL의 산 페놀 : 클로로포름을 첨가하십시오.
   5. 실온에서 5 분 동안 배양하고 때로는 볼텍싱합니다. 20,000 x g에서 2분 동안 원심분리한다. 상부 수성층을 신선한 튜브로 옮기고 0.6 mL 클로로포름 및 와류를 첨가한다.
   6. 20,000 x g에서 1분 동안 원심분리한다. 상단 수성 층을 신선한 튜브로 옮깁니다.
   7. 78 μL의 3 M NaOAc, pH 5.5, 2 μL의 글리코블루, 및 0.75 mL의 이소프로판올을 첨가하여 핵산을 침전시킨다. 5 분 동안 철저히 소용돌이. -80°C에서 적어도 1시간 또는 -20°C에서 16시간 동안 인큐베이션한다.
   8. 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하고 4°C에서 상층액을 버린다. 펠렛을 빙냉 0.75 mL의 80% 에탄올로 세척한다. 철저한 세척을 위해 튜브를 뒤집습니다. 4°C에서 5분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 버린다.
   9. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 스핀다운하고 남은 에탄올을 제거하고 액체를 버린다. 펠렛을 열린 뚜껑으로 65°C에서 5분 동안 건조시켰다. 샘플을 다음과 같이 재현탁시킨다: IP에 대해 샘플을 10 mM Tris-HCl, pH 7.0의 10 μL에 재현탁시킨다. 총 트랜스라톰 분석을 위해, 샘플을 20 μL의 10 mM Tris-HCl, pH 7.0에 재현탁시킨다.
      정지점: RNA는 수개월 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
2. 형광측정법에 의한 총 RNA 농도 정량화
   참고: 다음 모든 물질과 표면은 차세대 시퀀싱을 위해 cDNA 라이브러리를 준비하는 동안 RNase가 없어야 합니다. RNA 샘플을 취급하는 동안 장갑을 착용하십시오.
   1. 1 μL의 산 페놀-추출된 총 RNA를 9 μL의 10 mM Tris-HCl, pH 7.0에 희석하였다. 제조업체의 웹 사이트에서 지시 한대로 형광계를 사용하여 정량화하십시오.
   2. 50 μg의 RNA를 함유하는 샘플을 10 μL의 10 mM Tris-HCl, pH 7.0으로 희석한다.
      참고: IP 샘플을 측정하지 말고 다음 단계를 위해 모든 것을 사용하십시오.
3. 젤 정화 리보솜 보호 발자국 조각
   1. 15% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔을 설정하고 1x TBE 실행 완충액에 침수시킨다. 샘플 로딩 전에 200V에서 30분 동안 실행합니다. 각 샘플에 2x TBE-urea 샘플 버퍼 20μL를 첨가한다.
      참고: 예상 밴드 크기는 약 25-35nt입니다.
   2. 10 bp DNA 사다리를 해동시키고 변성 샘플(사다리 아님)을 80°C에서 2분 동안 해동시킨 다음, 얼음 상에서 냉각시킨다. 각 샘플을 다른 모든 차선에 로드합니다. 젤을 200V에서 50-70 분 동안 실행하십시오.
   3. 6 μL의 SYBR Gold (10,000 x 농축액)를 60 mL의 1x TBE 버퍼에 희석하고 15-20 분 동안 광 보호 상자에서 흔들면서 얼룩을냅니다. 겔을 염색하면서, 멸균 메스 및 0.5 mL 겔-브레이커 튜브를 표지된 1.5 mL 튜브에서 제조하였다.
   4. 멸균 메스로 원하는 밴드를 소비하고 (신선한 것을 사용하거나 샘플 사이에 잘 청소하십시오) 각 젤 조각을 젤 브레이커 튜브에 넣으십시오.
   5. 젤의 이미지를 촬영하여 젤에 샘플 잔류 물이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
   6. 절단된 슬라이스를 함유하는 튜브를 4°C에서 5분 동안 20,000 x g 에서 원심분리하고, 나머지 겔 조각을 겔 차단기 튜브로부터 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
   7. 0.5 mL의 10 mM 트리스, pH 7.0을 첨가한다. 열 혼합기에서 1,400 RPM에서 70°C에서 10분 동안 흔들어준다.
   8. 넓은 보어 피펫 팁으로 셀룰로스 아세테이트 컬럼을 옮기고, 4°C에서 3분 동안 20,000 x g 에서 원심분리한다.
   9. 플로우스루를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 얼음 위에서 식히십시오.
   10. 핵산을 침전시키기 위해, 추가로 550 μL의 IPA, 55 μL의 3 M NaOAc, 및 2 μL의 글리코블루와 와류를 완전히 혼합한다. 샘플을 적어도 1시간 동안 -80°C에 둔다.
   11. 20,000 x g 및 4°C에서 적어도 1시간 동안 원심분리하고 상층액을 버린다. 펠렛을 빙냉 80% 에탄올 0.75 mL로 세척한다. 펠릿이 바닥에서 분리 될 때까지 철저히 세척하기 위해 튜브를 뒤집습니다. 다시 20,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다.
   12. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 스핀다운하고 남은 에탄올을 제거하였다. 펠렛을 열린 뚜껑으로 65°C에서 5분 동안 건조시킨다.
   13. 15 μL의 10 mM 트리스, pH 7.0을 첨가하고, 펠렛을 완전히 재현탁시킨다. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 회전시키고 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼다.
       정지점: 정제된 RNA는 -80°C에서 몇 달 동안 저장될 수 있다.
4. 탈인산화
   1. 각 샘플에 대해 3 μL의 다음 믹스를 사용하십시오: ATP가 없는 10x T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응 완충액 2μL에 RNase 억제제 1μL를 첨가하십시오. 2 μL의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 각 샘플에 첨가한다. 피펫을 부드럽게 잘 섞고, 진탕 없이 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
   2. 효소를 불활성화시키기 위해, 샘플을 75°C에서 10분 동안 인큐베이션하고, 450 x g, 4°C에서 20초 동안 스핀다운시킨다.
   3. 핵산을 침전시키려면, 2 μL의 글리코블루, 550 μL의 IPA 및 55 μL의 3 M NaOAc를 첨가하였다.
   4. 소용돌이를 완전히 혼합하고 샘플을 -80°C에서 적어도 1시간 동안 냉각시킨다.
      정지 지점: 샘플은 -80°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관할 수 있습니다.
   5. 5.3.11-5.3.13단계를 반복합니다.
      정지점: 탈인산화된 RNA는 수개월 동안 -80°C에서 저장될 수 있다.
5. 바이오분석기를 이용한 정량화
   1. 1 μL의 샘플과 4 μL의 DEPC 처리수를 혼합하여 각 RNA 샘플을 1:4 희석액으로 만든다.
      주의: DEPC는 발암 물질입니다. 장갑을 끼고 조심스럽게 작업하십시오.
   2. 바이오 분석기 소형 RNA 칩 / 테이프 스테이션을 실행하십시오. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
      참고: 예상 리보솜 보호 RNA 단편 크기는 약 28-30 nt입니다.
6. Ligate 3' 끝과 링커-1
   1. 작은 RNA 단편 5 pmol을 10 μL로 희석하여 10 mM 트리스, pH 7.0으로 한다. 샘플을 80°C에서 2분 동안 변성시키고 얼음 위에서 차가워진다.
   2. 표 4에 상술된 바와 같이 마스터 믹스를 제조하고 샘플 당 29 μL를 사용한다.

시약	시료당 양(μL)	최종 농도
50% 멸균 여과된 PEG 8000	16	20%
증권 시세 표시기	4	10%
10× T4 RNA 리가아제 2 완충액	4	1배
수퍼라아제-RNase 억제제에서	2	2 U
10 mM 아데닐화 링커 3-L1	0.1	25 μM
DEPC 처리 된 물	2.9
최종 볼륨	29

표 4: 3' 말단 결찰 마스터 믹스에 대한 레시피.

3. 1 μL의 T4 RNA 리가아제 2와 피펫을 부드럽게 첨가하여 잘 혼합한다. 23°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
4. 핵산을 침전시키기 위해, 추가로 550 μL의 IPA, 500 μL의 10 mM 트리스, pH 7.0, 55 μL의 3 M NaOAc, 및 2 μL의 글리코블루. 볼텍스를 완전히 혼합하고, 샘플을 적어도 1 h 동안 -80°C에 놓는다.
   정지점: 샘플을 -80°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관한다.
5. 5.3.2-5.3.12단계를 반복합니다.
6. 펠렛을 6 μL의 10 mM 트리스, pH 7.0에 재현탁시킨다. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 회전시키고, 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼다.
   정지 지점: 샘플은 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

7. 3' 연결된 발자국의 겔 정제
   1. 10% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔을 설정하고 1x TBE 실행 완충액에 침수시킨다. 샘플 로딩 전에 200V에서 30분 동안 실행합니다. 각 샘플에 6 μL의 2x TBE-urea 샘플 버퍼를 첨가한다.
      참고: 예상 밴드 크기는 약 71-73nt입니다.
   2. 5.3.2-5.3.13단계를 반복합니다.
      정지 지점: 샘플은 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
8. ssDNA를 생성하기 위해 3ʹ 연결된 발자국 조각을 역전사
   1. 표 5에 상술된 바와 같이 마스터 믹스를 제조하고 샘플 당 3 μL를 사용한다.

시약	시료당 양(μL)	최종 농도
10 mM dNTPs	1	0.5 밀리지미터
25 μM 링커 L (rt)	0.5	625 nM
DEPC 처리 된 물	1.5
최종 볼륨	3

표 5: 핵산이 변성되기 전의 역전사 버퍼 마스터 믹스에 대한 레시피.

2. 소용돌이 치며 샘플을 회전시킵니다.
3. 샘플을 65°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
4. 얼음 위에서 샘플을 식히십시오.
5. 표 6에 상술된 바와 같이 마스터 믹스를 제조하고 샘플 당 6 μL를 사용한다. 소용돌이 치며 샘플을 회전시킵니다. 1 μL의 Superscript III를 각 샘플 및 피펫에 첨가하고 부드럽게 혼합하여 잘 혼합하고 50°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.

시약	시료당 양(μL)	최종 농도
5× FS 버퍼	4	1배
수퍼라아제-RNase 억제제에서	1	2 U
DTT 0.1 엠	1	5 밀리지미터
최종 볼륨	6

표 6: 핵산 변성 후의 역전사 버퍼 마스터 믹스에 대한 레시피.

6. 2.3 μL의 1 N NaOH를 첨가하고, 이는 RNA를 가수분해하고 역전사를 켄칭한다.
   주의: NaOH는 부식성이 매우 높습니다. 장갑과 눈 보호 장치를 착용하십시오.
7. 샘플이 분홍색으로 변할 때까지 95°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
8. 10% TBE-우레아 폴리아크릴아미드 겔을 설정하고 1x TBE 실행 완충액에 침수시킨다. 샘플 로딩 전에 200V에서 30분 동안 실행합니다. 각 샘플에 23μL의 2x TBE-urea 샘플 버퍼를 첨가한다.
   참고: 예상 DNA 밴드 크기는 115-117 nt입니다.
9. 5.3.2-5.3.12단계를 반복합니다.
10. 펠렛을 10 mM 트리스, pH 8.0의 15 μL에 재현탁시킨다. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 회전시키고 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼다.
    정지 지점: 샘플은 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

9. ssDNA 원형화
   1. 다음의 마스터 믹스를 준비하고, 표 7에 상술된 바와 같이 샘플당 4 μL를 로딩한다.

시약	시료당 양(μL)	최종 농도
10× CircLigase II 버퍼	2	1배
5 M 베타인 (옵션)	1	0.25 엠
50 mMMnCl2	1	2.5 밀리지미터
최종 볼륨	4

표 7: ssDNA 원형화 마스터 믹스에 대한 레시피.

2. 1 μL의 CircLigase II ssDNA 리가아제를 각 샘플에 첨가하고, 60°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   참고: 이 단계의 효율은 1시간 배양 후 각 샘플에 1μL의 CircLigase II ssDNA 리가아제를 첨가함으로써 증가될 수 있다.
3. 효소를 불활성화시키고 80°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
4. 얼음 위에서 식히고 PCR 증폭을 계속하거나 -80°C에서 보관한다.
   정지 지점: 샘플은 -80°C에서 수년 동안 보관할 수 있습니다.

10. PCR 증폭
    1. 다음의 PCR 마스터 믹스를 준비하고, 표 8에 상술된 바와 같이 샘플당 82 μL를 로딩한다.

시약	시료당 양(μL)	최종 농도
DEPC 처리 된 물	61.6
5× 퓨션 HF 반응 완충액	17.6	1배
10 mM dNTPs	1.8	200 μM
100 μM PCR 정방향 프라이머	0.2	225 nM
HF Phusion 중합효소	0.8	1.6 U
최종 볼륨	82

표 8: PCR 증폭 마스터 믹스를 위한 레시피.

2. 마스터 믹스가 들어있는 각 튜브에 5μL의 원형 DNA를 첨가한다.
   참고: 나머지 원형 DNA 샘플을 -80°C에 보관하십시오.
3. 20 μM PCR 역방향 바코드 프라이머의 상이한 1 μL를 각 샘플에 첨가하고( 표 9 참조) 와류하여 완전히 혼합한다.
4. 각 튜브를 네 개의 개별 PCR 튜브로 분취하고, 각각은 상이한 수의 PCR 사이클을 위해 사용될 것이다.
5. 표 10에 상술된 바와 같이 하기 프로그램에 따라 PCR 반응을 실행한다.

주기	변성 (98 °C)	어닐 (60 °C)	확장 (72 °C)
1	30초
2-16	10초	10초	5초

표 10: PCR 반응을 위한 PCR 프로그램.

6. 사이클 8, 9, 10, 및 11 후에 첫 번째 시도로서 PCR 튜브(IP 샘플의 경우, 사이클 범위는 9 내지 15)를 제거하였다. 매 사이클이 끝나면 프로그램을 일시 중지하고 하나의 분취량을 꺼내 얼음 위에 놓은 다음 신속하게 프로그램을 다시 시작하십시오.
   참고 : 사이클 수는 각 반응에서 순환 된 DNA의 양에 따라 조정되어야합니다. 예를 들어 그림 4를 참조하고 더 자세히 설명합니다.
7. 각 17 μL 반응에, 3.5 μL의 6x DNA 로딩 염료를 첨가한다.
8. 10 bp DNA 사다리를 해동시킨다.
9. 겔 전기영동에 의한 크기 분리를 위해, 8% TBE 폴리아크릴아미드를 1x TBE 실행 완충액에 침수시키고 각각의 상이한 사이클 수의 샘플을 인접한 웰에 로딩하고 180 V에서 50분 동안 겔을 실행한다.
10. 6 μL의 SYBR Gold (10,000 x 농축액)를 60 mL의 1x TBE 버퍼에 희석하고 15-20 분 동안 광 보호 상자에서 흔들면서 얼룩을냅니다.
11. 겔을 염색하면서, 멸균 메스 및 0.5 mL 겔-브레이커 튜브를 표지된 1.5 mL 튜브에서 제조하였다.
12. 염색된 핵산의 이미지를 촬영한다.
13. 멸균 메스로 174-176 bp의 예상 밴드 크기로 원하는 밴드를 절단하고 겔 슬라이스를 준비된 0.5 mL 겔 차단기 튜브에 넣습니다 (샘플 사이를 철저히 청소하고 RNase 불활성화제를 사용하거나 새로운 블레이드로 전환).
14. 튜브를 20,000 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 이어서 나머지 겔 조각을 0.5 mL 겔 차단기 튜브로부터 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
15. 500 μL의 10 mM 트리스, pH 8.0을 첨가하고, 10분 및 70°C에서 1,400 RPM의 열 혼합기에서 진탕한다.
16. 용해된 겔을 넓은 보어 피펫 팁이 있는 셀룰로스 아세테이트 컬럼으로 옮긴다.
17. 컬럼을 20,000 x g 및 4°C에서 3분 동안 원심분리하고, 유동-관통을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 얼음 상에서 냉각시킨다.
18. 핵산을 침전시키기 위해, 추가로 550 μL의 IPA, 32 μL의 5 M NaCl, 1 μL의 0.5 M EDTA, 및 2 μL의 글리코블루와 와류를 완전히 혼합한다.
19. 샘플을 -80°C 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 적어도 1시간 동안 보관한다.
    정지 지점: 샘플은 -80°C에서 하룻밤 또는 그 이상 보관할 수 있습니다.
20. 5.3.11-5.3.12단계를 반복합니다.
21. 11 μL의 10 mM 트리스, pH 8.0에 재현탁시킨다. 450 x g, 4°C에서 20초 동안 회전시키고 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮겼다.
    정지 지점: 샘플은 -80°C에서 수년 동안 보관할 수 있습니다.

11. 바이오 분석기에 의한 크기 분포 정량화
    1. 1 μL의 시료를 4 μL의 DEPC 처리수와 혼합하여 각 시료를 1:4로 희석한다.
    2. 바이오 분석기 소형 RNA 칩을 실행합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
       참고: 예상 길이는 175 ± 5bp입니다.
12. 형광계로 DNA 농도 정량화
    1. 제조업체의 권장 사항에 따라 형광계로 dsDNA 고감도 농도 검사를 수행하십시오.
    2. Illumina 권장 사항에 따라 멀티플렉스 및 시퀀스 샘플(인덱스 어댑터 풀링 가이드¹²).

6. 데이터 분석

1. 보충 파일에 자세히 설명된 대로 분석을 수행합니다.

결과

이 프로토콜의 흐름도(도 1)에 예시된 바와 같이, 세포를 로그 페이즈로 성장시킨 다음, 여과에 의해 신속하게 수집하고, 극저온 분쇄에 의해 용해시켰다. 그런 다음 용해물을 두 개로 나눴습니다: 하나는 총 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고 다른 하나는 선택된 리보솜-보호된 mRNA 풋프린트에 대한 것이고, 우리는 태그된 단백질-리보솜-초기 사슬 복합체를 풀다운하기 위해 친화성 정제를 수행했다. 우리는 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 태그된 단백질 발현 및 풀다운의 성공을 웨스턴 블롯 분석에 의해 보장하였다. 우리는 작은 RNA 전기영동(2100 BioAnalyzer 시스템)에 의해 일반적으로 20-45nt 길이인 리보솜 보호 풋프린트의 분리를 검증하여 시스템 매뉴얼에 따라 5-10nt 크기 시프트 검출을 가능하게 했습니다(그림 3). 그런 다음 심층 시퀀싱...

토론

여기서, 프로토콜은 코돈 분해능에 가까운 공동-번역 상호작용을 캡처하기 위한 선택적 리보솜 프로파일링 접근법을 상세히 설명한다. 리보솜이 붐비는 세포질로 출현하는 초기 사슬을 조정하기위한 허브로 상승함에 따라, 이것은 기능적 프로테옴을 보장하고 다양한 질병을 연구하는 데 필요한 다양한 공동 번역 상호 작용을 확인하고 특성화하는 중요한 방법입니다. 현재까지, SeRP는 생체내^14,15,16에서 직접적인 방식으로 이러한 상호작용을 포착하고 특성화할 수 있는 유일한 방법이다.

첫 번째이자 가장 중요한 단계는 세포 수집과 용해입니다. 몇 초 안에 진행중인 번역을 플래시 동결 후 동결 상태에서 용해하여 캡처하는 것이 필수적입니다. 세포 수집은 리보솜 유출을 피하고 빠르게 발생할 수있는 스트레스 번역 반응을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3'-인산화된 28 nt RNA 제어 올리고뉴클레오티드	IDT	맞춤 주문	RNase 무료 HPLC 정제; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Absolute
ethanol	VWR	20821
Acid phenol– chloroform	Ambion	AM9722
항체: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto 한천	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD
박토 효모 추출물	BD	212720
베스타틴 염산염	로스	2937.2
클로로포름	머크	102445
CircLigase II ssDNA 리가제 *	진앙지	CL9025K	100 U/μ L
콜로이드 Coomassie 염색 용액	Roth	4829
cOmplete, EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 정제	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC 처리 및 멸균 여과수 *	Sigma	95284
D-Glucose 무수	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA 로딩 염료*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, 재조합	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP 솔루션 세트*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
글리세롤	VWR	24388.260.
글리신 용액	: Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg / mL
Hepes	Roth	HN78.3
HF Phusion 중합 효소 *	NEB	M0530L
HK S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
염산	AppliChem	A1305
이소프로판올	시그마-알드리치	33539
이소프로필&베타;-D-1-티오갈락토피라노시드	로스	CN08
카나마이신	로스	T832.4
KCl	로스	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
루펩틴	로스	CN33.4
링커 L(rt)	IDT	맞춤 주문
액체 질소
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4· 2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4· H2O	Roth	K300.2
NHS 활성 세파로스 4 고속 흐름 비드	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 대체	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
프리캐스트 겔	Bio-Rad	5671034	10% 및 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
아세트산나트륨*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
아지드화나트륨	Merck	S8032-100G
염화나트륨	Roth	9265
수산화나트륨*	Sigma	S2770	1 N
설탕	시그마-알드리치	16104
SUPERase-In RNase 억제제	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제*	NEB	M0201L
T4 RNA 리가제 2*	NEB	M0242L
TBE 폴리아크릴아미드 겔*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE– 요소 폴리아크릴아미드 겔*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE– 요소 폴리아크릴아미드 겔*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE– 요소 샘플 버퍼*	Novex	LC6876	2회;
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE 버퍼*	Invitrogen	15581-044
* - 라이브러리 준비
가스켓 및 스프링 클램프, 90 mm,	Millipore
접지 조인트 플라스크 1 L,	Millipore	XX1504705