본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
반응성 산소 종 (ROS)은 장 집상성에서 필수적인 역할을합니다. ROS는 세포 대사의 천연 부산물입니다. 그들은 항균 반응 및 상처 치유에 관여로 점막 수준에서 감염 또는 부상에 대 한 응답으로 생산 됩니다. 그(것)들은 또한 세포 성장 및 분화를 포함하여 몇몇 통로를 통제하는 중요한 이차 메신저입니다. 다른 한편으로는, 과도한 ROS 수준은 산화 스트레스로 이끌어 내고, 이는 세포에 대한 해로운 일 수 있고 만성 염증 또는 암 같이 장 질병을 선호할 수 있습니다. 이 작품은 상업적으로 이용 가능한 불소 성 프로브를 사용하여 살아있는 화상 진찰 및 유동 세포측정에 의하여 장 내 뮤뇨 오르가노이드에서 ROS를 검출하는 간단한 방법을 제공합니다. 여기서 프로토콜은 장 가구형에서 레독스 균형을 조절하고 특정 장 세포 유형에서 ROS 수준을 검출하는 화합물의 효과를 분석하며, 여기에 GFP로 유전적으로 표지된 장 줄기 세포의 분석에 의해 예시된다. 이 프로토콜은 다른 형광 프로브와 함께 사용될 수 있다.
서론
반응성 산소 종 (ROS) 세포 대사의 자연 부산물. 또한 초산화화물 음이온 및 과산화수소를 생성하는 멤브레인 바인딩 NADPH-Oxidases (NOX) 및 듀얼 옥시다제 (DUOX)와 같은 특수 효소 복합체에 의해 적극적으로 생성 될 수 있습니다. 항산화 효소와 ROS 청소부를 발현함으로써 세포는 레독스 균형을 미세조정하여 조직 항상성을 보호할 수 있습니다2. ROS는 세포에 매우 독성이 있고 DNA, 단백질 및 지질을 손상시킬 수 있지만 중요한 신호 분자2입니다. 장 상피에서, 중간 정도의 ROS 수준은 줄기 및 전구 세포 증식에 필요합니다3; 높은 ROS 수준은 그들의 apoptosis4로 이끌어 내는. 만성 산화 스트레스는 염증성 장 질환이나 암과 같은 많은 위장 질환과 관련이 있습니다. 예를 들어, Wnt 구동 장암의 마우스 모델에서 NADPH-산화제의 활성화를 통한 ROS 생산이 상승하여 암세포 과확산5,6에 요구되는 것으로 나타났다. 장 세포, 특히 줄기 세포가 ....
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프로토콜
모든 동물 실험은 2016-0022년 프랑스 농무부의 승인 후 수행되었다. 모든 단계는 조직 배양 후드 내부에서 수행됩니다.
1. 장 내장을 배양하기 위한 시약 및 재료 준비
- 성장 배양 배지를 준비하려면 1x 글루타민, 1배 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액, HEPES 10mMM, 뮤린 EGF 50ng/mL, 뮤린 노긴 500 ng/mL(R-Spond)의 20 μg/mL(R-Spond1)를 혼합하여 R-Spond 1의 암조를 준비 한다. 지하실을 추출하는 동안 심열(RT)을 실온(RT)에 둡니다.
참고: -20°C에서 알리쿼트에서 사용하지 않은 배지를 동결합니다. 동결 및 해동을 피하십시오. - 고급 DMEM/F-12의 40mL로 50mL 튜브를 채우고 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 사용하지 않은 배지를 4°C로 유지합니다. 그것은 유기 체 패시징에 사용 됩니다. - 37°C에서 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트(μ-슬라이드 8 웰 챔버 및/또는 96웰 원형 바닥)를 미리 데워십시오.
- 해동 지하 멤브레인 매트릭스 (BMM) ( 재료의 표 참조) 얼음에 알리쿼트 (프로토콜을 시작하기 전에 또는 적어도....
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결과
설명된 프로토콜의 개념 증명으로서, 장줄기 세포가 바커 등에서 확립한 모자이크 GFP 발현을 표시하는 Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 마우스 라인에서 얻은 토굴은 처음에 장 줄기 세포를 특성화하고 GFP 발현에 기초하여 이러한 세포를 매핑할 수 있도록 사용되었다. 모델은 상이한 처리시 특정 세포 유형 집단에서 ROS 수준을 비교하기 위하여 제공됩니다. ROS 억제제(NAC)가 사용되었고, 유도제(tBHP)가 세포로 작용하여 레벨의 변화를 시각화하는 것으로 알려져 있다.
도 1A 및 1B 는 장 가구 배양에 대한 암호화 추출 절차 중에 얻은 분수 F1 및 F4의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 각 분획은 추출 절차 중에 현미경 또는 쌍안경으로 검사해야 만 소굴 분리를 따르고 사악, 단일 세포 또는 파편이 아닌 토굴로 농축된 분수를 정의해야 합니다. .......
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토론
이 작품은 뮤직 제주네아네아의 토굴을 분리하고, 3D 오르간노이드로 배양하고, ROS에 민감한 플루오로겐성 프로브를 전체 오르가노이드의 질적 현미경 영상과 결합하여 오르가노이드 변화 후 단일 세포에 대한 유동 세포측정을 사용하여 분석하는 단계별 프로토콜을 제공한다.
이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 암호화 추출 프로시저입니다. 실제로, 토굴 준비의 품질은 성공적인 오르가노이드 형성의 열쇠입니다. 따라서 농축 된 지하실과 셀룰러 파편 이나 죽어가는 세포가 거의없는 분획을 얻는 것이 필수적입니다. 소굴은 마우스의 연령 및 상태와 다를 수 있으므로 프로토콜에 표시된 것과 다른 분획에서 발견될 수 있습니다. EDTA 인큐베이션의 수는 그에 따라 수정될 수 있다. 4분 후 암호가 분리되지 않는 경우 3분 EDTA 배양을 반복해야 합니다. 반대로 첫 번째 EDTA 인큐베이션 이후에 이미 분리된 토굴을 가정합니다. 이 경우 두 번째 EDTA 인큐베이션이 필요하지 않을 수 있으며, DPBS의 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR) 보조금 17-CE14-0022 (i-스트레스)에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 보충제, 비타민 A 뺀 | ThermoFisher | 12587010 | 재고 농도 : 50x |
| GlutaMAX (glutamine< / em>) | ThermoFisher | 35050038 | 재고 농도 : 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | 재고 농도 : 1 M |
| 쥐 EGF | R & D | 2028-EG-200 | 재고 농도: 500 &마이크로; PBS |
| 쥐 Noggin | ; D | 1967-NG/CF | 재고 농도: 100 & 마이크로; PBS |
| 쥐 R-spondin1 R& | ; D | 3474-RS-050 | 재고 농도 : 50 &마이크로; PBS |
| N-2 보충제 | ThermoFisher | 17502048 | 재고 농도 : 100x |
| 페니실린-스트렙토 마이신 (P / S) | ThermoFisher | 15140122 | 재고 농도 : 100x (10,000 단위 / mL의 페니실린 및 10,000 µ 스트렙토 마이신의 g / mL) |
| Material< / strong> | |||
| 70 µ m 세포 여과기 | Corning | 352350 | |
| 96-웰 라운드 바닥 | Corning | 3799 | |
| 볼 팁 가위 Fine | Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® 딥 레드 시약 | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phé nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x 칼슘 없음 무마그네슘(DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | 10 mg/mL 재고 |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | 냉장고에서 한 번 해동하고 얼음에 1 시간 동안 보관하고 500 mL 분취액을 만들고 -20 °C에서 보관하십시오. C |
| µ-Slide 8 웰 챔버 | Ibidi | 80826 | |
| N-아세틸시스테인(NAC) | 시그마 | A9165 | |
| tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(tBCHP) 용액(70%wt. H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), 페놀 레드 없음 (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to used to minimize cell dead on tissue |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (유세포 분석기) | ThermoFischer | 유세포 분석기 | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | 이미지 생성 | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS 분석 | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | 컨포칼 시스템 | |
| 고속 EMCCD 카메라 Evolve Delta 512 | 광도 컨 | 포칼 시스템 | |
| Prism | GraphPad 소프트웨어 | 통계 분석 |
참고문헌
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequence....
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재인쇄 및 허가
