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방법 논문

낭포성 섬유증 기도 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과를 연구하는 모델의 설계 및 개발

2.1K 조회수

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DOI:

10.3791/62888

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2021년 8월 3일

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1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 낭포성 섬유증 기도 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 위한 모형 시스템을 개발하는 것입니다. 인공 가래 배지는 가래의 조성을 모방하고, 과옥배양 조건은 폐 미생물 공동체에 대한 보충 산소의 효과를 모델링한다.

초록

기도 미생물 지역 사회는 낭포성 섬유증 (CF) 및 그밖 만성 폐 질병의 진행에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 생각됩니다. 미생물은 전통적으로 산소를 사용하거나 용인하는 능력에 따라 분류되었습니다. 보충 산소는 낭포성 섬유증을 가진 사람들에게 투여되는 일반적인 의학 치료입니다 (pwCF); 그러나, 산소와 기도 미생물군유전체에 대한 기존 연구는 아옥시아(high oxygen)가 아닌 저산소증(저산소)이 주로 호기성 및 촉진성 혐기성 폐 미생물 공동체에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞추고 있다. 이러한 중요한 지식 격차를 해결하기 위해 이 프로토콜은 pwCF의 가래 구성을 모방한 인공 가래 매체를 사용하여 개발되었습니다. 투명 배지를 산출하는 필터 살균을 사용하면 광학 방법이 서스펜션 배양에서 단세포 미생물의 성장을 따를 수 있습니다. 과산화 조건을 만들기 위해,이 모델 시스템은 hyperoxic 조건을 연구하기 위해 설립 혐기성 배양 기술을 활용; 산소를 제거하는 대신, 산소는 압축 산소와 공기의 혼합물과 혈청 병의 매일 스파깅에 의해 배양에 추가됩니다. 50 pwCF에서 가래는 차동 산소 조건을 유지하기 위해이 모델의 능력을 확인하기 위해 72-h 기간 동안 매일 스파깅을 겪었다. 산탄총 메타게놈 시퀀싱은 11 pwCF로부터 배양 및 비배양식 가래 샘플에서 수행되어 낭포성 섬유증 가래에서 흔히 발견되는 발생성 및 병원성 미생물의 성장을 지원하는 이 매체의 능력을 검증하였다. 성장 곡선은 일반적인 낭포성 섬유증 병원균의 성장을 지원하기 위해 이러한 인공 가래 배지의 능력을 확인하기 위해 pwCF로부터 얻은 112개의 분리물로부터 수득되었다. 우리는 이 모형이 CF 가래에 있는 병원균 및 교근의 다양한 문화가, normoxic 조건하에서 비배양되지 않은 가래와 매우 유사한 지역 사회를 복구하고, 다양한 산소 조건하에서 다른 문화 표현형을 창조할 수 있다는 것을 것을을 발견합니다. 이 새로운 접근은 기도 미생물 지역 사회와 일반적인 호흡 병원체에 pwCF에 있는 산소의 사용에 의해 유도된 예기치 않은 효력의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.

서론

낭포성 섬유증 (CF)은 폐에서 두꺼운 점액을 지우지 못하는 것을 특징으로하는 유전 질환으로, 반복되는 감염과 종종 폐 이식 또는 사망의 필요성을 초래하는 진보적 인 폐 기능 감소로 이어진다. 낭포성 섬유증(pwCF)을 가진 사람들의 기도 미생물군유전체는 질병 활동1을추적하는 것으로 나타났으며, 불리한 장기 결과2,3과관련된 미생물 다양성의 감소와 함께. pwCF의 임상 연구에서, 보충 산소 요법은 보다 진보된 질병4,5와연관되어 있다, 그러나 전통적으로, 산소 치료의 사용은 단순히 질병 심각도6에대한 마커로 간주되었습니다. 호흡기 부전 환자의 임상 시험에서 최근 연구는 높은 환자 산소 수준이 역설적으로 심각한 세균 감염의 증가와 관련된 것으로 나타났습니다7,보충 산소가 질병 병인에 기여할 수 있음을 시사. 낭포성 섬유증 폐 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과와 관련 폐 및 기도 미생물 공동체는 잘 연구되지 않았습니다.

기계학 연구는 종종 물류 어려움과 알 수없는 의료 혜택 이나 해의 개입과 관련된 잠재적 인 윤리적 문제로 인해 인간의 주제에 직접 수행 할 수 없습니다. 인간 바이오시편을 모델 시스템에 통합하는 번역 적 접근 법은 이러한 경우에 중요한 생물학적 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 산소를 사용하거나 용인하는 능력은 전통적으로 미생물 분류의 중요한 구성 요소였지만, 환경에 보충 산소의 치료 도입이 어떻게 기도 미생물 공동체를 방해할 수 있는지에 대해서는 거의 알려져 하지 않습니다. pwCF의 기도 미생물군유전체에 보충 산소의 알 수없는 효과에 빛을 비추기 위해, 우리는 두 가지 주요 과제를 해결해야했습니다. 첫째, CF 가래의 조성을 생리적으로 근사화하는 배양 배지의 생성; 둘째, 장기간 배양시 높은 산소 농도의 유지를 허용하는 모델 시스템의 생성.

인공 가래 매체(ASM)는 폐 가래 를모방하는 데 널리사용되며,9,10,특정 레시피에 대한 명확한 합의는 없다. 이 프로토콜은 pwCF에서 생리학적으로 대략적인 가래를 위해 신중하게 설계된 인공 가래 매체 레시피 및 준비 전략을 설명합니다. 표 1은 게시된 문헌을 기반으로 선택한 레시피 값을 간략하게 설명합니다. 기본 화학 성분 및 pH는 인간 CF 가래11,12,13의연구에 의해 확인된값과일치시켰다. 저농도 생리영양분은최종부10의0.25%로 포함된 달걀 노른자를 사용하였으며, 비타민및미량금속믹스(14,15)를첨가하였다. 가래16의핵심 성분인 Mucin은 1%w/v14로포함되었다. 더 많은 노동 집약적이지만, 필터 살균은 필수 미디어 성분의 열 유도 데마튜레이션으로부터 잠재적인 문제를 줄이기 위해 열 살균의 전통적인 관행을 통해선택되었다(10). 필터 살균의 또 다른 이점은 투명한 매체를 생성한다는 것입니다 (열 살균은 소금과 단백질의 강수량 및 응고로 인해 탁구 미디어를 만들 수 있습니다), 이 인공 가래 매체는 탁도의 증가에 따라 미생물 성장을 따르는 데 사용할 수 있도록.

과옥배양을 위한 이 모델 시스템은 산소가 제거되지 않고 첨가되는 혐기성 배양 기술을 기반으로 pwCF에 대한 산소 보충 사용의 효과를 위한 모델을 생성한다. 도 1 및 관련 산소 스파깅 프로토콜은 일반 실험실 및 병원 공급 업체로부터 저렴한 비용으로 얻을 수있는 산소 스파징 시스템의 구성 요소를 간략하게 설명합니다. 이 시스템은 압축 산소와 공기를 21%-100% 산소에 이르는 고정 농도로 혼합할 수 있게 합니다. 산소 센서의 통합을 통해 출력 가스 혼합물의 농도를 검증할 수 있을 뿐만 아니라 이전에 분리된 혈청 병의 유출 가스 조성을 확인하여 산소 조건이 원하는 범위 내에서 유지되었는지 확인할 수 있습니다.

이 프로토콜은 인공 가래 매체를 만드는 절차를 간략하게 설명하고, 산소 스파깅 시스템의 구성 및 사용, 및 차동 산소 조건하에서 배양 CF 가래에 둘 다의 적용을 한다.

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프로토콜

이 연구는 파트너 기관 검토 위원회 (프로토콜 # 2018P002934)의 승인을 받았습니다. 포함 기준은 낭포성 섬유증을 가진 성인 환자를 포함한 연구 결과에 대한 서면 통보 된 동의를 제공. 배제 기준은 없었다. 프로토콜 지침에 따르면, 모든 가래 샘플은 임상 공급자와 예정된 외래 환자 방문 중에 낭포성 섬유증 환자로부터 수집되었습니다.

1. 인공 가래 중간 준비

참고: 여기에 나열된 수량은 최종 인공 가래 매체 의 1 L의 생산을 위한 것이며 재료 표에나열된 특정 시약을 가정합니다. 동일한 최종 제품을 보장하기 위해 다른 볼륨또는 다른 시약을 사용하기 위해 숫자를 조정해야 합니다. 대상 농도의 표 1을 참조하십시오.

  1. 인공 가래 화학 혼합 (ASCM)
    참고: ASCM은 최종 중간 량의 25%를 차지합니다. 선반안정이며 대량 또는 사전에 준비할 수 있습니다. 나중에 사용할 준비가되면 화학 혼합물을 오토클레이브하고 실온에서 안전하게 보관하십시오.
    1. 성분 화학 주식 솔루션을 혼합합니다.
      1. M NaCl 스톡 1개 준비: 멸균수 리터당 58.44g의 NaCl을 추가합니다.
      2. 1 M KCl 스톡 준비: 멸균 수의 리터 당 KCl 74.55 g를 추가합니다.
      3. 준비 1 M MgSO4 재고: MgSO4·7H2O 의 MgSO 4,47 g, 또는 멸균 수의 리터 당 120.37 g를 추가 하십시오.
      4. 1M 포도당 육수를 준비: 멸균 수의 리터 당 포도당 180.16 g를 추가하십시오.
    2. 오토클레이브는 화학 적 재고 솔루션뿐만 아니라 빈 250 mL 병을 살균합니다. 30분 동안 121°C 및 15 PSI의 적어도 표준 값으로 자동 절제 단계를 수행합니다.
    3. 빈 250mL 병에 멸균 수의 80.59 mL을 추가합니다.
    4. 믹스에 1 M NaCl 스톡의 152.30 mL을 추가합니다.
    5. 믹스에 1 M KCl 스톡의 15.8 mL을 추가합니다.
    6. 믹스에 1 M MgSO4 스톡의 610 μL을 추가합니다.
    7. 믹스에 1 M 포도당 스톡의 700 μL을 추가합니다.
  2. 인공 가래 뮤신 믹스 (ASMM)
    참고: ASMM은 최종 중간 볼륨의 50%를 차지합니다. 최종 중간 배치와 같은 날에 준비되었는지 확인합니다.
    1. 빈 1 L 병에 멸균 물 450mL를 추가합니다.
    2. 병에 10x 인산염 완충식식염(PBS)의 50mL를 추가합니다.
    3. 병에 일회용 마그네틱 교반 바를 추가합니다.
    4. PBS와 교반 바가 들어 있는 병을 자동 복제합니다.
    5. 뮤신 파우더 10g을 측정하고 PBS에 추가합니다.
    6. 예비 믹싱을 위해 병을 힘차게 흔들어 주세요.
    7. 마그네틱 교반기로 병을 핫 플레이트에 놓습니다. 50°C를 대상으로 중간 고체로 열을 설정하고 1100 rpm으로 교반 속도를 설정합니다. 바가 자석에서 날지 않도록 속도를 서서히 증가시킵니다.
      1. 가열하고 15 분 동안 저어.
      2. 내열 장갑으로 병을 집어 들십시오. 뮤신 파우더가 용액에서 정착하는지 확인하십시오.
      3. 뮤신 파우더가 완전히 용해되지 않으면 병을 완전히 용해 될 때까지 5 분 간격으로 가열 / 교반기로 돌려줍니다.
    8. 뮤신 믹스를 실온으로 식힙니다.
  3. 인공 가래 생물학적 혼합 (ASBM)
    참고: ASBM은 최종 중간 량의 25%입니다. 최종 중간 배치와 같은 날에 준비하고 다른 믹스와 달리 구성 요소를 열에 노출시키지 마십시오.
    1. 4°C 냉장고 또는 얼음에 100x 비타민 육수를 해동하십시오.
      참고: 비타민 육수를 10mL 알리쿼트에 미리 분배하여 동결/해동 주기 수를 최소화합니다.
    2. 빈 오토클레이브 250mL 병에 멸균 수의 124.24 mL을 추가합니다.
    3. 믹스에 50x 필수 아미노산 스톡의 25.76 mL을 추가합니다.
    4. 혼합에 100x 비 필수 아미노산 스톡의 80.14 mL을 추가합니다.
    5. 믹스에 10 mL (해동) 100 x 비타민 육수를 추가합니다.
    6. 믹스에 1000x 미량 금속 스톡 1mL를 추가합니다.
    7. 혼합에 30 % 달걀 노른자 에멀젼의 8.33 mL을 추가합니다.
    8. 믹스에 10 g / L 페리틴 재고의 400 μL을 추가합니다.
    9. 수동 흔들림을 통해 솔루션을 잘 섞습니다.
  4. 인공 가래 매체 (ASM)
    1. ASMM이 포함된 1L 병에 ASCM 250mL를 추가합니다.
    2. 중간 병에 ASBM 250mL를 추가합니다.
    3. 기본 MOPS 버퍼(1M)로 배지를 적시하여 좁은 범위 pH 용지에서 6.3의 pH에 도달합니다. 적정 전에, 중간 혼합은 너무 산성 될 것입니다.
    4. 여과준비가 될 때까지 결과 인공 가래 매체를 4°C에서 냉장 보관합니다.
    5. 여과 공정을 시작하려면 필터링되지 않은 인공 가래 배지 200mL을 0.22 μm 모공 크기 필터가 있는 진공 여과 시스템으로 이송합니다.
    6. 여과 시스템을 진공 펌프에 연결하고 진공 펌프를 켜고 70mbar로 설정한 다음 4 °C의 차가운 방에서 90 rpm에서 흔들리는 궤도 셰이커에 챔버를 놓습니다.
      1. 상당한 양이 필터링됨에 따라 배지의 추가 150mL로 위로 를 드시면 됩니다. 1L의 중간을 완전히 걸게 하는 데 1-2일이 걸립니다.
      2. 모든 용지가 필터링될 때까지 추가 챔버로 반복합니다.
        참고: mucin이 시간이 지남에 따라 필터를 연결하기 때문에 동일한 0.22 μm 필터를 통해 매체의 350mL 이상을 필터링하지 않도록 하십시오.
    7. 여과된 인공 가래 매체를 4°C에서 냉장 보관하여 사용할 준비가 될 때까지 냉장 보관합니다. 최상의 결과를 위해 준비 한 달 이내에 ASM을 사용합니다.

2. 산소 스파깅

  1. 스파깅 스테이션 설정
    참고: 이 프로토콜은 한 번만 완료해야 하며, 그 후에필요한 간단한 유지 관리를 통해 설정을 유지할 수 있습니다. 산소 스파기 시스템의 시각적 회로도는 그림 1을 참조하십시오.
    1. 압축 공기 및 산소 탱크를 확보하고 적절하게 고정하십시오.
      주의: 고압으로 인해 탱크를 잘못 다룰 때 매우 위험합니다. 탱크가 완전히 밀봉되고 고정되어 있는지, 탱크가 닫히면 누출이 없으며 모든 취급 인력이 완전히 사용하도록 하십시오.
    2. 렌치가 있는 압축 공기 탱크에 공기 레귤레이터를 부착합니다. 레귤레이터에서 최적의 흐름 판독을 위해 레귤레이터를 가능한 한 똑바로 세워 두는 위치에 부착하십시오.
    3. 압축 된 산소 탱크에 산소 레귤레이터를 부착하여 가능한 한 똑바로 세워 놓습니다. 산소 탱크에 따라 조여기 방향으로 반전해야 할 수도 있습니다.
    4. 레귤레이터의 튜브를 Y 커넥터에 연결하여 두 탱크의 가스 흐름을 결합합니다.
    5. Y 커넥터의 출력을 중앙 T-접합 밸브에 연결합니다.
    6. 중앙 T-접합 밸브의 한쪽을 가스 압력 게이지에 연결합니다.
    7. 가스 압력 게이지의 다른 쪽을 0.22 μm 모공 크기의 25mm 직경멸균 주사기 필터에 연결합니다.
    8. 두 번째 25mm 직경 주사기 필터를 감미 전 시 가스 방출로 사용할 플런저 없이 주사기에 부착합니다.
    9. 중앙 T-접합 밸브의 마지막 면을 산소 모니터의 두 번째 T 접합 밸브에 연결합니다.
    10. 25mm 직경 주사기 필터를 이 두 번째 T-접합 밸브의 한쪽에 연결하고 튜브와 함께 18G 바늘을 부착합니다.
    11. 제2 T-접합 밸브의 마지막 면을 산소 모니터링 장치에 연결합니다.
    12. 모니터링 하는 동안 가스 방출로 사용할 산소 모니터링 장치의 반대편에 컷오프 튜브를 연결합니다.
      주의: 산소 스파기 시스템을 테스트/사용할 때T-접합의 위치를 주의 깊게 살펴보고 시스템을 통과하는 의도된 경로와 일치하는지 확인합니다. 이렇게 하지 않으면 시스템 내부의 압력 축적이 발생하고 구성 요소가 실패하고 분해됩니다.
    13. 시스템의 유지 보수와 최적의 성능으로 작동하도록 하려면 다음 관행이 유용합니다.
      1. 분리된 양의 Teflon 테이프와의 연결을 강화하여 씰을 크게 개선하고 내부 압력에서 분리되는 구성 요소의 가능성을 줄입니다.
      2. 최대 압력을 완화하고 오류를 방지하기 위해 결합 된 유량은 10 L / min 미만을 유지합니다.
      3. 누출이 의심되는 경우, 가스 누출 보다 거품이 발생하므로 시판되는 액체 누출 감지기와 같은 세제 용액을 사용하여 해당 위치를 쉽게 식별할 수 있습니다. 폴리테트라플루오로틸렌 테이프(예: 테플론)를 사용하여 누수 패치.
      4. 산소 스파기 시스템에서 25mm 직경 주사기 필터를 격주마다 교체하지만 사용 빈도에 따라 다릅니다. 시간이 지남에 따라 필터에 걸린 입자는 가스 유량을 줄이고 압력 축적을 유발합니다.
      5. 측정을 수행하기 전에 산소 모니터를 산소 압축 공기를 21%로 보정합니다.
      6. 시스템 사용이 완료되면 탱크를 끄고 흐름이 완전히 멈출 때까지 레귤레이터에서 과도한 가스를 출혈합니다.
  2. 세럼 병 문화 스파깅
    1. 샘플 식별자, 접종 날짜/시간 및 표적 산소 백분율로 500mL 자동 혈청 병을 라벨로 지정합니다.
    2. 생물학적 후드에 인공 가래 배지의 24mL을 설정 중인 각 혈청 병에 추가합니다.
    3. 각 혈청 병에 18G 바늘로 균질화 된 환자 가래 1 mL (각 배양 조건에 대한 충분한 양의 샘플을 얻기 위해 필요한 경우 멸균 식염수로 희석)를 추가하십시오.
    4. 멸균 핀셋을 사용하여 오토클레이브 고무 스토퍼를 각 세럼 병 의 상단에 놓습니다.
    5. 고무 스토퍼를 누르고 스토퍼의 밑면을 손으로 만지지 않도록주의하십시오.
    6. 후드에서 병을 제거하고 알루미늄 씰을 바르고 압착합니다. 씰에서 중앙 조각을 제거합니다.
    7. 술 닦아병 의 상단을 닦아 분젠 버너 불꽃을 통해 전달합니다.
    8. 멸균 18-G 바늘을 플런저리스 주사기에 필터를 부착합니다. 이 가스 방출을 병에 먼저 삽입합니다.
    9. 멸균 18-G 바늘을 시스템에서 가스 출력에 부착하고 가스 출력 바늘을 병에 삽입합니다.
    10. 탱크에서 산소 모니터를 통해 T-접합을 라우팅합니다. 대상 산소 농도가 시스템을 통해 흐르는지 확인합니다. 약 5 L/분의 가스 흐름을 목표로 합니다.
    11. 탱크에서 가스 출력으로 T-접합을 다시 라우팅합니다. 가스가 혈청 병을 통해 흐르기 시작합니다.
      주의: 산소 스파징 중 압력 게이지에 주의를 기울이세요. 압력이 예기치 않게 증가하면 즉시 시스템을 종료하십시오.
    12. 혈청 병을 통해 산소 스파지를 1 분 동안 실행합니다. 5 L/min에서 10개의 항공 교환을 허용하고 내부 대기가 원하는 부분 압력에 도달할 수 있습니다.
    13. 가스 방출 18-G 바늘을 제거합니다.
    14. 혈청 병의 압력이 +1 대기 (해수면의 대기 2)로 구축 한 다음 즉시 가스 출력 바늘을 제거합니다.
      참고: 압력을 유지하여 시간이 지남에 따라 hyperoxic 조건을 유지합니다.
    15. 혈청 병을 37°C 인큐베이터 셰이커에 150 RPM에 넣습니다. 3개의 24-h 간격에 대한 샘플을 배양합니다. 각 24-h 간격에서, 다운스트림 분석을 위해 알리쿼트를 취하고, 샘플을 다시 분리하고, 72h의 총 배양 시간 동안 인큐베이션으로 돌려보세요.
  3. 유출 산소 측정
    1. 산소 계수를 압축 공기를 21%로 보정한 다음 탱크를 끕니다.
    2. 혈청 병 섭취를 산소 모니터를 통해 라우팅하고 멸균 바늘을 끝까지 부착합니다.
    3. 고무 스토퍼를 통해 바늘을 혈청 병에 삽입합니다.
    4. 유출 판독이 안정화될 때까지 기다립니다. 혈청 병에서 낮은 유량은 최대 2 분이 걸릴 수 있음을 의미합니다. 객실 공기와 가장 큰 차이를 보고합니다(21%에서 가장 먼 숫자).
    5. 여러 판독값을 수행하는 경우 판독값 사이에 압축 공기로 시스템을 플러시합니다.

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결과

이 프로토콜은 매사추세츠 주 보스턴에 있는 매사추세츠 종합 병원에 있는 외래 환자 낭포성 섬유증 진료소에 일상적인 배려를 위해 제출하는 pwCF에서 50의 예상한 가래 견본에 적용되었습니다. 각 환자의 가래는 인공 가래 매체를 사용하여 21%, 50%, 산소 100% 산소 조건 하에서 배양되었으며, 각 배양에서 0.5mL 알리쿼트가 24시간, 48h, 72h의 배양 시간으로 배양하였다. 시각적 변화를 추적하기 위해 추출할 때 문화가 촬영되었습니다. 또한, 각 1차 가래 샘플의 0.5mL 알리쿼트(aliquot)는 배양 전에 채취하였다. 이로 인해 환자당 10개의 개별 샘플과 500개의 샘플의 최종 N이 발생했습니다. 이들 중 11명의 환자(11명의 배양되지 않은 스푸타, 11개의 배양스스퍼타, 11개의 배양된 스푸타에서 48h의 인큐베이션에서 산소)가 핵산 추출17을받았으며, 시퀀싱 라이브러리는 상업용 DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성되었으며, 메타게노믹 시퀀싱 플랫폼은 전체...

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토론

이 연구에서는, 체외 모형은 폐 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 연구하기 위하여 개발되었습니다. 이 모델은 인공 가래 매체와 혈청 병의 일일 스파깅을 기반으로 산소 농도가 상승하여 pwCF에서 가래로 확인된 미생물의 성장을 지원합니다.

이 방법의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 인공 가래 매체의 열 살균보다는 필터 살균을 사용하는 선택입니다. 필터 멸균은 뮤신 및 기타 열에 민감한 성분의 절전을 방지하고 미생물 성장의 광학 측정에 사용할 수 있는 명확한 매체를 생성합니다. 다른프로토콜(10)에서필터 멸균이 제안되었지만, 준비된 매체의 최소량이 여과되었을 때 그렇지 않으면 발생하는 필터의 막힘을 방지하기 위해 여과 과정에서 궤도 흔들림을 첨가하는 것이 필수적이라는 것을 발견했습니다. 여과된 인공 가래 배지는 필터내의 머신 내막 작용으로 인해 의도된 최종 뮤신 농도보다 낮을 수 있지만, pwCF의 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업의 일부는 해양 생물 연구소, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (보조금 번호 5600373), 사이먼스 재단의 선물의 지원을 받아 해양 생물 연구소에서 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BME 비타민(100개) 용액MilliporeSigmaB6891비타민 보충 농축 용액.
크림퍼, 30mmDWK Life Sciences224307크림퍼는 알루미늄 씰을 혈청 병에 부착하기 위한 것입니다.
D-(+)-포도MilliporeSigmaG7021고체 포도당 분말(덱스트로로테이터 이성질체).
다이어프램 펌프 ME 2 NTVACUU 20730003진공 여과용 진공 펌프.
달걀 노른자 에멀젼HiMediaFD045식염수 30% 달걀 노른자의 멸균 에멀젼.
페리틴, Horse SpleenMilliporeSigmaF7879페리틴(철 저장 단백질) 용액
FIREBOY 플러스 안전 분젠 버너Integra Biosciences144000분젠 버너는 사용자 인터페이스 및 안전 기능을 갖추고 있습니다.
하이드리온 pH 종이 (1.0– 14.0)Micro Essential Laboratory94pH 테스트 용지 1.0– 14.0 범위.
Hydrion pH 종이 (4.0– 9.0)Micro Essential Laboratory55pH 테스트 용지 4.0– 9.0 범위.
Hydrion pH 종이 (6.0– 8.0)Micro Essential Laboratory345pH 테스트 용지 6.0– 8.0 범위.
피하 주사 Needle-Pro EDGE 안전 장치, 18GSmiths Medical401815안전 캡이 있는 18G 바늘.
인라인 압력 게이지MilliporeSigma20469병 압력 모니터링용 가스 압력계.
Innova 42 Incubated ShakerEppendorf2231000756인큐베이터/오비탈 Shaker 조합
바늘이 부착된 Luer-Lok 주사기Becton Dickinson309580조합 3mL 주사기 및 18G 바늘.
Luer 밸브 구색World Precision Instruments14011가스 흐름 튜브용 밸브.
LSE 오비탈 쉐이커ThermoFisher Scientific6780-NP오비탈 쉐이커는 여과 중 매체를 교반합니다.
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트MilliporeSigmaM2773고체 엡솜염(마그네슘 황산염 헵타하이드레이트).
유량계가 있는 의료용 공기 1단 조절기Western EnterprisesM1-346-15FM15L/min 미터의 공기 유량 조절기.
MEM 아미노산 (50x) 용액MilliporeSigmaM5550필수 아미노산 농축 용액.
MEM 비필수 아미노산 (100x) 용액MilliporeSigmaM7145비필수 아미노산 농축 용액.
Millex-GP 필터, 0.22 &마이크로; mMilliporeSigmaSLMP25SS0.22 &마이크로; M 폴리에테르설폰 멤브레인 멸균 주사기 필터.
Milli-Q 아카데믹MilliporeSigmaZMQS60E01Milli-Q 멸균 정수 여과 시스템.
MiniOX 3000 산소 모니터MSA814365가스 유량 산소 퍼센트 모니터.
MOPS 완충액(1M, pH 9.0)Boston BioProductsBBM-90MOPS 완충액.
돼지 위MilliporeSigmaM2378뮤신(글리코실화 겔 형성 단백질) 분말의
천연 폴리프로필렌 가시 피팅 키트Harvard Apparatus72-1413가스 흐름 튜브용 커넥터.
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1096염기서열분석 중 식별을 위한 라이브러리 준비.
NovaSeq 6000 염기서열분석 시스템Illumina770-2016-025-N시료 판독 생성을 위한 Shotgun 염기서열분석 플랫폼.
유량계가 있는 산소 단일 단계 조절기Western EnterprisesM1-540-15FM15L/min 미터의 산소 유량 조절기.
2개의 표준 커넥터가 있는 산소 튜빙SunMed2001-01가스 시스템 구성 요소를 연결하기 위한 튜빙.
인산염 완충 식염수, 10x, pH 7.4Molecular Biologicals InternationalMRGF-6235농축 인산염 완충 식염수.
PC 420 핫 플레이트/교반기Marshall ScientificCO-PC420조합 핫 플레이트/교반기.
염화칼MilliporeSigmaP9541고체 염화칼륨 염.
PTFE 일회용 교반 막대ThermoFisher Scientific14-513-95일회용 자기 교반 막대
PTFE 스레드 씰 테프론 테이프VWR470042-938가스 시스템 연결 강화용 테프론 테이프.
Q-Gard 2 정제 카트리지MilliporeSigmaQGARD00D2Milli-Q 시스템용 정제 카트리지.
재사용 가능한 배지 보관 병ThermoFisher Scientific06-423A배양 배지 혼합 및 보관용 병.
고무 마개, 30mm, 회색 브로모부틸DWK Life Sciences224100-331세럼 병용 고무 마개.
성형 눈금이 있는 세럼 병, 밀봉 배양을 위한 500mLDWK Life Sciences223952유리 세럼 병.
스몰 보어 확장 세트Braun Medical471960루어 잠금 커넥터가 있는 튜빙 확장.
염화나트륨MilliporeSigmaS3014고체 염화나트륨 소금.
스파이크인 제어 I (높은 미생물 부하)ZymoBIOMICSD6320절대 미생물 부하 계산을 위한 스파이크인 미생물(I. halotolerans 및 A. halotolerans)
Stericup 퀵 릴리스 멸균 진공 여과 시스템MilliporeSigmaS2GPU02RE250 mL 0.22 µ M 진공 여과 챔버.
Super Sani-Cloth 살균 일회용 물티슈Professional Disposables InternationalH04082살균용 일회용 살균 물티슈.
미량 금속 혼합물, 1000xThermoFisher Scientific NC0112668생리학적 미량 금속의 농축 용액.
안감 없는 알루미늄 씰, 30mmDWK Life Sciences224187-01고무 스토퍼 위에 크림핑 처리된 알루미늄 씰.
USP 의료용 에어 탱크AirgasAI USP200살포 시스템에 입력하기 위한 압축 공기 탱크.
USP 의료용 산소 탱크에어가스OX USP200살포 시스템에 입력하기 위한 압축 산소 탱크.
당 에서 양이온화..매체 pH 조정을 위한 뮤신.륨 .

참고문헌

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