이 프로토콜의 목표는 낭포성 섬유증 기도 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 위한 모형 시스템을 개발하는 것입니다. 인공 가래 배지는 가래의 조성을 모방하고, 과옥배양 조건은 폐 미생물 공동체에 대한 보충 산소의 효과를 모델링한다.
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이 논문에서
요약
초록
기도 미생물 지역 사회는 낭포성 섬유증 (CF) 및 그밖 만성 폐 질병의 진행에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 생각됩니다. 미생물은 전통적으로 산소를 사용하거나 용인하는 능력에 따라 분류되었습니다. 보충 산소는 낭포성 섬유증을 가진 사람들에게 투여되는 일반적인 의학 치료입니다 (pwCF); 그러나, 산소와 기도 미생물군유전체에 대한 기존 연구는 아옥시아(high oxygen)가 아닌 저산소증(저산소)이 주로 호기성 및 촉진성 혐기성 폐 미생물 공동체에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞추고 있다. 이러한 중요한 지식 격차를 해결하기 위해 이 프로토콜은 pwCF의 가래 구성을 모방한 인공 가래 매체를 사용하여 개발되었습니다. 투명 배지를 산출하는 필터 살균을 사용하면 광학 방법이 서스펜션 배양에서 단세포 미생물의 성장을 따를 수 있습니다. 과산화 조건을 만들기 위해,이 모델 시스템은 hyperoxic 조건을 연구하기 위해 설립 혐기성 배양 기술을 활용; 산소를 제거하는 대신, 산소는 압축 산소와 공기의 혼합물과 혈청 병의 매일 스파깅에 의해 배양에 추가됩니다. 50 pwCF에서 가래는 차동 산소 조건을 유지하기 위해이 모델의 능력을 확인하기 위해 72-h 기간 동안 매일 스파깅을 겪었다. 산탄총 메타게놈 시퀀싱은 11 pwCF로부터 배양 및 비배양식 가래 샘플에서 수행되어 낭포성 섬유증 가래에서 흔히 발견되는 발생성 및 병원성 미생물의 성장을 지원하는 이 매체의 능력을 검증하였다. 성장 곡선은 일반적인 낭포성 섬유증 병원균의 성장을 지원하기 위해 이러한 인공 가래 배지의 능력을 확인하기 위해 pwCF로부터 얻은 112개의 분리물로부터 수득되었다. 우리는 이 모형이 CF 가래에 있는 병원균 및 교근의 다양한 문화가, normoxic 조건하에서 비배양되지 않은 가래와 매우 유사한 지역 사회를 복구하고, 다양한 산소 조건하에서 다른 문화 표현형을 창조할 수 있다는 것을 것을을 발견합니다. 이 새로운 접근은 기도 미생물 지역 사회와 일반적인 호흡 병원체에 pwCF에 있는 산소의 사용에 의해 유도된 예기치 않은 효력의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다.
서론
낭포성 섬유증 (CF)은 폐에서 두꺼운 점액을 지우지 못하는 것을 특징으로하는 유전 질환으로, 반복되는 감염과 종종 폐 이식 또는 사망의 필요성을 초래하는 진보적 인 폐 기능 감소로 이어진다. 낭포성 섬유증(pwCF)을 가진 사람들의 기도 미생물군유전체는 질병 활동1을추적하는 것으로 나타났으며, 불리한 장기 결과2,3과관련된 미생물 다양성의 감소와 함께. pwCF의 임상 연구에서, 보충 산소 요법은 보다 진보된 질병4,5와연관되어 있다, 그러나 전통적으로, 산소 치료의 사용은 단순히 질병 심각도6에대한 마커로 간주되었습니다. 호흡기 부전 환자의 임상 시험에서 최근 연구는 높은 환자 산소 수준이 역설적으로 심각한 세균 감염의 증가와 관련된 것으로 나타났습니다7,보충 산소가 질병 병인에 기여할 수 있음을 시사. 낭포성 섬유증 폐 미생물군유전체에 대한 보충 산소의 효과와 관련 폐 및 기도 미생물 공동체는 잘 연구되지 않았습니다.
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프로토콜
이 연구는 파트너 기관 검토 위원회 (프로토콜 # 2018P002934)의 승인을 받았습니다. 포함 기준은 낭포성 섬유증을 가진 성인 환자를 포함한 연구 결과에 대한 서면 통보 된 동의를 제공. 배제 기준은 없었다. 프로토콜 지침에 따르면, 모든 가래 샘플은 임상 공급자와 예정된 외래 환자 방문 중에 낭포성 섬유증 환자로부터 수집되었습니다.
1. 인공 가래 중간 준비
참고: 여기에 나열된 수량은 최종 인공 가래 매체 의 1 L의 생산을 위한 것이며 재료 표에나열된 특정 시약을 가정합니다. 동일한 최종 제품을 보장하기 위해 다른 볼륨또는 다른 시약을 사용하기 위해 숫자를 조정해야 합니다. 대상 농도의 표 1을 참조하십시오.
- 인공 가래 화학 혼합 (ASCM)
참고: ASCM은 최종 중간 량의 25%를 차지합니다. 선반안정이며 대량 또는 사전에 준비할 수 있습니다. 나중에 사용할 준비가되면 화학 혼합물을 오토클레이브하고 실온에서 안전하게 보관하십시오.- 성분 화학 주식 솔루션을 혼합합니다.
- M NaCl 스톡 1개 준비: 멸균수 리터당 58.44g의 NaCl을 추가합니다.
- 성분 화학 주식 솔루션을 혼합합니다.
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결과
이 프로토콜은 매사추세츠 주 보스턴에 있는 매사추세츠 종합 병원에 있는 외래 환자 낭포성 섬유증 진료소에 일상적인 배려를 위해 제출하는 pwCF에서 50의 예상한 가래 견본에 적용되었습니다. 각 환자의 가래는 인공 가래 매체를 사용하여 21%, 50%, 산소 100% 산소 조건 하에서 배양되었으며, 각 배양에서 0.5mL 알리쿼트가 24시간, 48h, 72h의 배양 시간으로 배양하였다. 시각적 변화를 추적하기 위해 추출할 때 문화가 촬영되었습니다. 또한, 각 1차 가래 샘플의 0.5mL 알리쿼트(aliquot)는 배양 전에 채취하였다. 이로 인해 환자당 10개의 개별 샘플과 500개의 샘플의 최종 N이 발생했습니다. 이들 중 11명의 환자(11명의 배양되지 않은 스푸타, 11개의 배양스스퍼타, 11개의 배양된 스푸타에서 48h의 인큐베이션에서 산소)가 핵산 추출17을받았으며, 시퀀싱 라이브러리는 상업용 DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성되었으며, 메타게노믹 시퀀싱 플랫폼은 전체.......
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토론
이 연구에서는, 체외 모형은 폐 미생물 지역 사회에 hyperoxia의 효력을 연구하기 위하여 개발되었습니다. 이 모델은 인공 가래 매체와 혈청 병의 일일 스파깅을 기반으로 산소 농도가 상승하여 pwCF에서 가래로 확인된 미생물의 성장을 지원합니다.
이 방법의 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 인공 가래 매체의 열 살균보다는 필터 살균을 사용하는 선택입니다. 필터 멸균은 뮤신 및 기타 열에 민감한 성분의 절전을 방지하고 미생물 성장의 광학 측정에 사용할 수 있는 명확한 매체를 생성합니다. 다른프로토콜(10)에서필터 멸균이 제안되었지만, 준비된 매체의 최소량이 여과되었을 때 그렇지 않으면 발생하는 필터의 막힘을 방지하기 위해 여과 과정에서 궤도 흔들림을 첨가하는 것이 필수적이라는 것을 발견했습니다. 여과된 인공 가래 배지는 필터내의 머신 내막 작용으로 인해 의도된 최종 뮤신 농도보다 낮을 수 있지만, pwCF의 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업의 일부는 해양 생물 연구소, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (보조금 번호 5600373), 사이먼스 재단의 선물의 지원을 받아 해양 생물 연구소에서 수행되었습니다.
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참고문헌
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060(2018).
- Acosta, N., et al. Sputu....
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