방법 논문

재조합 퍼프렌고리신 O-퍼메아빌화 세포에서 미토콘드리아 기질 플럭스 측정

DOI:

10.3791/62902

⸱

2021년 8월 13일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 작품에서는, 우리는 마이크로 플레이트 기지를 둔 호흡측정과 조합하여 재조합 퍼프렌고리신 O를 사용하여 미토콘드리아 호흡 기질 플럭스를 시험하기 위하여 수정된 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜을 통해 메트포르민이 두 개의 다른 종양 세포주의 미토콘드리아 호흡에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다.

초록

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미토콘드리아 기질 플럭스는 각 세포 유형의 구별되는 특성이며, 수송기, 채널 또는 효소와 같은 성분의 변화는 여러 질병의 발병기전에 관여한다. 미토콘드리아 기질 플루는 그대로 세포, 과밀 세포 또는 분리된 미토콘드리아를 사용하여 연구될 수 있다. 그대로 세포를 조사하는 것은 다른 기판의 동시 산화로 인해 여러 가지 문제가 발생합니다. 게다가, 몇몇 세포 모형은 결과 해석을 복잡하게 하는 다른 기판의 내부 상점을 포함합니다. 미토콘드리아 절연 또는 투과성 제제를 사용하는 것과 같은 방법은 쉽게 재현할 수 없습니다. 작은 견본에서 충분한 양에 있는 그대로 막으로 순수한 미토콘드리아를 격리하는 것은 문제가 됩니다. 비선택적 과미빌라이저를 사용하면 피할 수 없는 미토콘드리아 막 손상의 다양한 정도를 유발합니다. 재조합 퍼프렌고리신 O(rPFO)는 미토콘드리아 무결성에 영향을 미치지 않으면서 플라즈마 멤브레인을 선택적으로 투과화할 수 있는 능력 덕분에 보다 적절한 퍼미알로이저로 제공되었다. 마이크로 플레이트 호흡측정기와 함께 사용하면 최소한의 수의 세포를 사용하는 동안 한 실험 내에서 충분한 복제로 여러 미토콘드리아 기판의 플럭스를 테스트할 수 있습니다. 본 작품에서, 프로토콜은 2개의 상이한 세포 표현형 또는 유전자형의 미토콘드리아 기질 플럭스를 비교하고 각종 미토콘드리아 기판 또는 억제제를 시험하기 위하여 사용자 정의될 수 있는 방법을 기술합니다.

서론

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마이크로플레이트 계 호흡학은 작은 샘플 크기1의세포 호흡 연구를 가능하게 함으로써 미토콘드리아 연구에 혁명을 일으켰습니다. 세포 호흡은 일반적으로 미토콘드리아 기능 또는 '기능 장애'의 지표로 간주됩니다, 기능의 미토콘드리아 범위가 에너지 생산을 넘어 확장한다는 사실에도 불구하고2. 호기성 조건에서, 미토콘드리아는 구연산 주기3(도 1)에연료를 공급할 수 있는 대사 중간체로 이러한 기판을 분해하고 변환하여 상이한 기판에 저장된 에너지를 추출한다. 기판의 연속 플럭스는 구연산 주기의 흐름에 필수적으로 높은 에너지 '전자 기증자'를 생성하여 전자를 전자 수송 사슬로 전달하여 내부 미토콘드리아 멤브레인을 가로질러 양성자 그라데이션을 생성하여 ATP-synthase를 ATP4로인계할 수 있게 한다. 따라서 미토콘드리아 호흡을 분석하는 실험적 설계에는 시료 특성(그대로 세포, 과구세포 또는 분리된 미토콘드리아) 및 미토콘드리아 기판을 포함해야 한다.

세포는 토착 기판5의저장을 유지하고, 미토콘드리아는 여러 종류의 기판을 동시에산화6,이는 그대로 세포에 수행 된 실험에서 얻은 결과의 해석을 복잡하게. 선택된 기판을 산화시키는 미토콘드리아 능력을 조사하는 일반적인 접근법은 미토콘드리아를 분리하거나 조사된 세포를 과미로 하는것이다 5. 고립 된 미토콘드리아는 정량적 연구에 이상적이지만 격리 과정은 힘들다. 큰 시료 크기, 수율의 순도 및 기술5의재현성 등의 기술적 어려움에 직면해 있다. 과미성세포는 미토콘드리아 절연의 단점에 대한 용액을 제공한다; 그러나, 세제 성질의 일상적인 충고제는 특이하지 않으며 미토콘드리아 막5를손상시킬 수 있다.

재조합 퍼프렌고리신 O(rPFO)는 선택적 혈장 막 과미경화제7으로제공되었고, 여러 연구에서 세포외 플럭스 분석기와 함께 성공적으로 사용되었다7,8,9,10. XFe96 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 미토콘드리아 기질 플럭스를 검사하기 위해 rPFO를 사용하여 프로토콜을 수정했습니다. 이 프로토콜에서, 2개의 세포 표현형에 있는 4개의 다른 기질 산화 통로는 충분한 복제및 각 시험된 물질에 대한 적당한 통제를 가진 동안 비교됩니다.

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프로토콜

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1. 분석 하루 전

  1. 시약 및 기판의 준비.
    1. 미토콘드리아 분석 용액(MAS): 표 1에설명된 바와 같이 모든 시약의 재고 용액을 준비한다. 매니톨과 자당의 주식을 37°C로 따뜻하게 하여 완전히 녹입니다. 시약을 섞어 2배 MAS를 준비한 다음 혼합물을 37°C로 데우도록 데우게 합니다. 5N KOH를 7.4(~7mL)로 조정한 다음 물을 추가하여 최대 1L. 필터 살균을 하고 측정일까지 -20°C에 알리쿼트를 저장합니다.
    2. 소 세럼 알부민 (5 % BSA): 자기 교반기에 예온 멸균 수의 90 mL에 BSA의 5 g을 용해하고 흔들림을 피하십시오. 5N KOH로 pH를 7.4로 조정한 다음 물을 추가하여 최대 100mL의 부피를 가져옵니다. 측정일까지 알리코를 -20°C에 걸결시키고 보관합니다.
    3. 미토콘드리아 기판: 간결한 나트륨, 피루바테 나트륨, 글루타민나트륨 1M 스톡 솔루션을 멸균수에 준비합니다. 멸균물에 말린 나트륨 100m 스톡 용액을 준비하고 예동 살균수를 사용하여 팔미토닐 카르니틴의 10m 스톡 용액을 준비합니다. 각 솔루션의 pH를 7.4~5N KOH로 조정하고 필터 멸균을 한다. 기판을 2-8°C에 저장합니다. 사용 시, 따뜻한 팔미토일 카르니틴을 37°C로 하여 침전수를 용해시합니다. 나중에 사용, -20 °C에서 피루바테를 제외한 모든 기판의 알리쿼트저장.
    4. 미토콘드리아 억제제: 디메틸 설프산화물(DMSO)을 사용하여 25m 올리고마이신, 50m 의 탄산원시안 4-(트리플루오로메톡시) 페닐하이드라존(FCCP), 20mM 로테네톤, 20mM 항미암아 점의 20m 의 재고 용액을 준비한다.
  2. 세포를 파종 및 치료: 도 2에도시된 바와 같이, 2-11의 세포를 시드한다. 열 1과 12는 배경 우물역할을 하려면 비어 있어야 합니다. 이 작품에서 HepG2 및 A549 세포가 사용되었습니다.
    1. 잘 당 20,000 세포의 밀도로 세포를 시드. 종싱을 위해 세포 배양 배지의 50-80 μL을 사용합니다.
    2. 빈 우물을 동일한 양의 세포 배양 배지로 채우고 5% CO2를가진 가습 된 인큐베이터에서 37 °C에서 세포를 배양한다. 세포가 3-4시간 동안 부착한 다음 모든 우물에 세포 배양 배지 100 μL을 추가합니다.
    3. 최종 중간 크기 추가와 함께, 열에 치료를 적용 7-11. 본 작업에서, 실험군은 16시간 동안 1mM 메트포르민 염산염으로 처리되었고, 대조군은 차량 제어로서 멸균 증류수의 동등한 부피로 처리되었다.
  3. 센서의 수분 공급: 파이프 200 μL당 멸균 물 은 유틸리티 플레이트에 잘 들어간 다음 센서 카트리지를 조심스럽게 반환하면서 센서를 물에 담급니다. 다음날까지 37°C에서 CO2-무료인큐베이터에서 카트리지를 배양합니다.
  4. 분석 프로토콜 템플릿: 분석기(재료 표참조) 및 컨트롤러 단위를 켭니다. 계측기 제어 및 데이터 수집 소프트웨어를 시작하고 표 2에설명된 대로 분석 프로토콜을 설계합니다. 그룹 정의에따라, 주입된 기판에 따라 포트 A가 다른 4개의 사출 전략을 만듭니다(그림3). 기판 또는 약어 의 이름을 지정합니다.
  5. 포트 B, C 및 D, 화합물 올리고마이신, FCCP 및 로테네/항마이신 A를 각각 할당한다. 그림 4에표시된 대로 8개의 그룹을 만들고 이름을 지정합니다. 플레이트 맵에서 해당 우물에 그룹을 할당한 다음 프로토콜을 즉시 사용할 수 있는 템플릿으로 저장합니다. 밤새 온도가 안정될 수 있도록 분석기를 켜두십시오. 갑작스런 온도 변화를 피하기 위해 안정적인 온도가 있는 장소에 분석기를 유지합니다.

2. 분석의 날

  1. 보정판으로 물을 교체: 유틸리티 플레이트와 파이프 200 μl당 예온 보정제의 물을 유틸리티 플레이트에 잘 넣습니다. 분석 시간까지 카트리지를 CO2-무료인큐베이터로 반환합니다. 교정판의 급속한 증발을 방지하려면 인큐베이터 내부의 습도원을 유지하고 팬 속도를 최소한으로 끄거나 줄입니다.
  2. 작업 솔루션 준비: 2x MAS, 5% BSA 및 멸균 수를 37°C로 데우는 것으로 시작합니다. 한편, 억제제 주식이 실온에 도달 하도록 허용 합니다. 따뜻한 2x MAS및 멸균 증류수를 사용하여 표 3에기판 및 억제제의 작동 농도 5mL을 준비한다.
  3. 주사 포트로드: 도 3에도시된 바와 같이, 포트 A. 로드 간결/로테네 혼합물을 포트 A에 로드하는 A. 로드 피루바테/malate 혼합물을 포트 A행 C와 D. 로드 글루타메이트/malate 혼합물을 포트 A행 E및 F. 로드 팔미토틸 카니틴/모레이트 혼합물에 포트 A에 로드합니다. 전체 플레이트의 경우, 올리고마이신 제제의 22 μL, FCCP 제제의 25 μL을 가진 포트 C, 로테네/항마이신 A 혼합물의 27 μL을 가진 포트 D를 로드한다.
  4. 교정 단계 시작: 실행 분석 탭에서 시작 실행을 클릭하여 분석기를 시작합니다. 로드된 센서 카트리지를 삽입하고 교정 단계를 시작합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 교정이 완료될 때까지 기다립니다.
  5. 분석 매체(MAS-BSA-rPFO)의 제제: 분석 매체의 20mL를 제조하고, 2x MAS의 10mL, 멸균수 9.2mL, 50mL 튜브에 5%의 BSA를 혼합한다. 10 μM rPFO의 2 μL을 추가하여 1 nM의 농도를 달성하고 부드러운 파이펫팅으로 혼합물을 다시 중단합니다. 흔들림을 피하고 혼합에 대한 소용돌이 믹서를 사용하지 마십시오. 사용 시간까지 37°C에서 튜브를 배양합니다.
  6. 세포 세척: 멀티채널 파이펫을 사용하여 전동된 칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 완충식염(PBS)으로 셀과 빈 우물을 두 번 씻으세요. 동일한 팁을 재사용하여 세포 배양 배지를 폐기하고 PBS를 추가하지 마십시오. 라미나르 흐름 밖에서 이 단계를 수행하여 공기 흐름에 의해 건조되는 세포를 보호합니다.
  7. 분석 매체의 세포 투과화: 멀티채널 파이펫을 사용하여 PBS를 폐기하고 예동 분석 매체(MAS-BSA-rPFO)의 180 μL로 대체합니다.
  8. 측정 시작: 투과화 직후 보정된 센서 카트리지의 유틸리티 플레이트를 셀 플레이트로 교체하고 측정을 시작합니다.

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결과

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먼저 결과를 기준선 호흡의 두 번째 측정값으로 정상화하여 산소 소비율 비율(OCR%)으로 값을 표시합니다. 분석 결과는 그림 5, 그림 6, 그림 7 및 그림 8에표시됩니다. 각 그룹에 적합한 배경 우물을 할당하고 다른 그룹의 배경 우물을 비활성화하는 것이 중요합니다. 도 5는 처리된 단이 간결한 유도한 호흡의 더 높은 비율을 가지고 있음을 보여줍니다. 메트포르민 치료에 대한 A549 세포의반응(도 5A)은HepG2 세포(도5B)보다높았다. 배경 제어 우물은 비교 된 그룹의 동일한 행에서 만, 이 경...

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토론

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이 프로토콜은 이전에 게시된 연구7,8,9,10 및 제품 사용자 가이드를 수정한 것입니다. 제조업체의 프로토콜과 달리 2x MAS는 2× MAS가 용해하기 쉽고 동결 후 강수량을 형성하지 않기 때문에 3배 MAS 대신 사용됩니다. 냉동 2x MAS 별칭은 최대 6개월까지 저장하여 일관된 결과를 보여줄 수 있습니다. 또 다른 차이점은 2x MAS의 구성 요소에 ADP를 포함하고 공식에서 BSA를 생략하는 것입니다. BSA를 포함하는 해결책은 주입하기 더 어렵고 오류 및 이상값의 더 큰 가능성을 일으키는 원인이 됩니다. 그러나, BSA의 존재는 적절한 투과화를 달성하기 위해 rPFO의 필요한 양을 줄이는 데 필수적이다. 따라서, BSA는 세포 세척 후 투과화 단계에서 사용되는 분석 매체(MAS-BSA-rP...

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공개 사항

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저자는 선언할 이해상충이 없습니다.

감사의 글

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저자는 흐라데크 크랄로베의 의학 학부의 생리학과 직원과 화학 물질 및 샘플 준비에 대한 도움을 위한 제 3 학부의 병리학학과에 감사드립니다. 이 작품은 찰스 대학 교부 금교 프로그램 PROGRES Q40/02, 체코 보건부 보조금 NU21-01-00259, 체코 과학 재단 교부 18-10144 및 INOMED 프로젝트 CZ.02.1.01/0.01/0.0/0/0/18_069/0010046 교육부, 청소년 및 유럽 연합 (EU)의 유럽 연합 (EU)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아데노신 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrateMerckA5285-20 ° C
Antimycin AMerckA8674-20 °에 저장; C
소 혈청 알부민MerckA38032 - 8 ° C
카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존MerckC2920-20 °에 저장; C
디메틸 설폭사이드MerckD8418RT
D-MannitolMerck63559매장 RT
Dulbecco의 인산염 완충 식염수Gibco14190-144RT
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acidMerck03777매장
HEPESMerckH7523RT
L(-)말산 디소듐 염MerckM9138저장 RT
L-글루탐산 나트륨 염 수화물MerckG5889저장 RT
OligomycinMerckO4876-20 ° C
Palmitoyl-DL- 카르니틴 클로라이드MerckP4509-20 °에 저장; C
수산화 칼륨Merck484016RT에서 저장
산 칼륨 인산 칼륨 monobasicMerckP5655RT
RotenoneMerckR8875-20 °에서 저장; C
Seahorse Wave 데스크탑 소프트웨어애질런트 기술www.agilent.com 에서 다운로드
Seahorse XFe96 분석기애질런트 기술
Seahorse XFe96 FluxPak애질런트 기술102416-100XFe96 센서 카트리지 및 XF96 세포 배양 마이크로플레이트
피루브산 나트륨MerckP22562 - 8°C에 보관; C
나트륨 숙시네이트 이염기성 육수화물MerckS2378RT
SucroseMerckS7903매장
RT WaterMerckW3500매장 RT
XF 캘리브런애질런트 기술100840-000RT
XF 플라즈마 멤브레인 투과제Agilent Technologies102504-100매장재조합 perfringolysin O (rPFO) - 부분 표본 및 -20 °°C에서 보관; 씨
RT 저장 인에서 트

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

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재인쇄 및 허가

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Perfringolysin OSeahorse XFA549

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