전 비보 망막 조직 샘플에서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 결정

요약

여기에 기재된 미토콘드리아 응력 분석기 및 글리코리질 속도 분석기의 상세한 프로토콜은 상용 생체 분석기를 이용한 전 생체 망 막 조직 샘플에서 이다.

초록

미토콘드리아 호흡은 모든 세포, 특히 고활성 신진 대사를 가진 망막 광수용체에서 중요한 에너지 생성 경로입니다. 또한, 광수용체는 또한 암세포와 같은 높은 유산소 글리코리시스를 나타낸다. 이러한 신진 대사 활동의 정확한 측정생리 조건 및 질병 상태에서 세포 항상성에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 높은 처리량 마이크로 플레이트 기반 의 소사는 살아있는 세포에서 미토콘드리아 호흡 및 다양한 대사 활동을 측정하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 이들 중 대부분은 배양 된 세포를 위해 개발 되고 그대로 조직 샘플 및 응용 프로그램 ex vivo에 대 한 최적화 되지 않았습니다. 여기에 설명된 상세한 단계별 프로토콜은 마이크로플레이트 기반 형광 기술을 사용하여 미토콘드리아 호흡의 지표로서 산소 소비율(OCR)을 직접 측정하고, 전 생체 망막 조직에서, 글리코리시스의 지표로서 세포외산성화율(ECAR)을 직접 측정한다. 이 방법은 성공적으로 성인 마우스 망막에서 신진 대사 활동을 평가하고 노화와 질병의 세포 메커니즘을 조사에 그것의 응용 프로그램을 입증하는 데 사용되었습니다.

서론

미토콘드리아는 여러 가지 중요한 생리적 과정을 조정하여 세포 대사, 신호, 항상성 및 세포 사멸을 조절하는 필수 세포기관입니다¹. 미토콘드리아는 산화 인산화(OXPHOS)를 통해 아데노신 삼위산염(ATP)을 생성하고 거의 모든 세포 이벤트를 지원하는 에너지를 제공하는 세포의 강국역할을 합니다. 세포 산소의 대다수는 유산소 호흡 도중 전자 수송 사슬 (ETC)에 있는 최종 전자 수용자로 작용하는 미토콘드리아에서 대사됩니다. 낮은 양의 ATP는 또한 포도당이 피루바테로 변환되는 시토솔의 글리코리시스로부터 생산될 수 있으며, 이는 젖산으로 더 변환되거나 미토콘드리아로 이송되고 삼환산성 사이클(TCA 사이클)의 기판인 아세틸-코아로 산화될 수 있다.

망막은 포유류에서 가장 신진 대사 활성 조직 중 하나입니다², 미토콘드리아 호흡의 높은 수준을 표시하 고 매우 높은 산소 소비³. 막대와 콘 광수용체는 미토콘드리아⁴의 고밀도를 함유하고 있으며, OXPHOS는 망막⁵에서 대부분의 ATP를 생성한다. 또한, 망막은 또한 유산소 글리코리시스

프로토콜

모든 마우스 프로토콜은 국립 안과 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다 (NEI ASP # 650). 마우스는 12h 어두운 조건에 보관하고 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 가이드의 권고, 실험실 동물 자원 연구소 및 실험실 동물의 인도적인 배려 그리고 사용에 대한 공중 위생 서비스 정책의 권고에 따라 배려되었습니다.

1. 센서 카트리지를 수분화하고 분석 매체의 준비

1. 실험 전날, 교정 매체의 1mL을 유틸리티 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 하이드로 부스터 커버를 상단에 놓고 커버의 개구부를 통해 센서 카트리지를 낮춥니다. 센서가 교정 매체에 침수되었는지 확인합니다. 37°C의 _CO2 가없는 인큐베이터에서 센서 카트리지를 하룻밤 동안 배양하여 형광을 활성화합니다.
   참고: 증발을 방지하기 위해 인큐베이터는 물 트레이를 내부에 보관하여 가습되고 센서 카트리지 카세트는 투명한 플라스틱 랩으로 감쌉니다.
2. 원하는 농도로 포도당, 피루바테 및 글루타민을 첨가하여 해마 DMEM 배지를 재구성하여 분석 매체를 준비한다. 이 문서에서 보고된 분석서에서, 분석 매체에 있는 기판의 최종 농도는: 포도당의 6mM, pyruvate의 0.12 mM, 및 글루타민의 0.5 mMMM입니....

결과

여기에 보고된 데이터는 OCR 추적(도 1) 및 OCR 추적 및 ECAR 추적(그림 2)을 보여주는 대표적인 미토콘드리아 응력 분석서이며, 이는 4개월 된 트랜스제닉 Nrl-L-EGFP ^mice36 (C57B/L6 배경)에서 갓 해부된 1mm 망막 펀치 디스크를 사용하여 수행되었다. 이 마우스는 일반적인 망막 발달, 조직학 및 생리학을 변경하지 않고 막대 광수용체에서 GFP를 구체적으로 발현하고 망막 연구에서 야생 형 대조군으로 널리 사용되어 왔다. 2개의 Nrl-L-GFP 쓰레기메이트 마우스가 여기에 제시된 에세이에서 사용되었다. Nrl-L-GFP 마우스에서 발현된 GFP는 이 프로토콜에서 OCR 및 ECAR의 측정을 방해하지 않는다. 각 망막에서 5개의 망막 펀치를 가져갔습니다. 망막 펀치의 10미토콘드리아 스트레스 분석에 사용되.......

토론

여기에 제공된 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스 활성의 마이크로플레이트 기반 의 작용을 전 생체, 갓 해부한 망막 펀치 디스크를 사용하여 수행하기 위한 자세한 지침이 있습니다. 프로토콜은 최적화되었습니다 : 1) 전 생체 망막 조직에 적합한 분석 매체의 사용을 보장; 2) 장비의 최적의 검출 범위에 속하는 OCR 및 ECAR 판독값을 얻기 위해 망막 펀치 디스크의 적절한 크기를 고용; 3) 측정 주기 동안 안정적인 판독을 위한 망막 펀치의 접착력을 향상시키기 위한 코팅 메쉬 인서트; 4) 각 주입 약물 화합물의 최적의 농도의 사용; 및 5) 각 단계에서 미토콘드리아 상태의 고원에 도달하기 위해 변경 된 사이클 길이를 보장합니다. 시약 및 프로토콜은 이전 게시된 버전²³에서 수정되어 차세대 Seahorse XFe24 기계에 적응합니다. 이전 프로토콜²³에 사용된 에임스의 버퍼 대신, 포도당, 글루타민 및 피루바테를.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1X PBS	Thermo Fisher	14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM 스톡 솔루션	Sigma	D6134	Seahorse XF DMEM 배지에 용해, 미리 준비
30-게이지 니들	BD Precision Glide	305106
Antimycin A, 10 mM 스톡 솔루션	Sigma	A8674	DMSO에 용해, 미리 준비
Bam15, 10 mM 스톡 해결책	TimTec	ST056388	DMSO에 용해, 미리 준비
생검 펀처, 1 mm	Integra Miltex	33-31AA
Cell-Tak	Corning 생명 과학	CB40240
CO2 질식 챔버
해부 겸자 - Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-10	Stright tip
Dissection 겸자-Dumont #7	Fine Science Tools	11274-20	곡선 팁
해부 현미경
DMSO	Sigma	D2438
Graefe 집게	Fine Science Tools	11051-10	곡선, 톱니 모양 팁
Microscissors	Fine Science Tools	15004-08	곡선 팁
NaOH 용액, 1 M	Sigma-Aldrich	S8263	수용액, 미리 준비
Rotenone, 10mM 원액	Sigma	R8875	DMSO에 용해, 미리 준비
Seahorse 보정 배지	Agilent	100840-000
Seahorse XF 1.0M 포도	Agilent	103577-100
Seahorse XF 100mM 피루브산	Agilent	103578-100
Seahorse XF 200 mM 글루타민	Agilent	103579-100
Seahorse XF DMEM 배지	Agilent	103575-100	pH 7.4, 5 mM HEPES 포함
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent		103518-100	센서 카트리지 및 Islet Capture microplate
포함Seahorse XFe24, 추가 세포 플럭스 분석기	Agilent
중탄산나트륨 용액, 0.1 M	Sigma-Aldrich	S5761	수용액, 미리 준비
극상 속눈썹 브러시	Ted Pella	113

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