탈세포화된 인간 피부는 조직 재생에 적합합니다. 탈세포화(decellularization)의 주요 문제는 구조 단백질, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans, GAG) 및 성장 인자(growth factor)의 적절한 함량과 함께 네이티브 구조를 보존하는 것입니다. 제안된 방법은 빠르고 효과적인 탈세포화를 가능하게 하여 잘 보존된 본래 특징을 가진 탈세포화된 피부를 생성합니다.
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방법 논문
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탈세포화된 인간 피부는 조직 재생에 적합합니다. 탈세포화(decellularization)의 주요 문제는 구조 단백질, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans, GAG) 및 성장 인자(growth factor)의 적절한 함량과 함께 네이티브 구조를 보존하는 것입니다. 제안된 방법은 빠르고 효과적인 탈세포화를 가능하게 하여 잘 보존된 본래 특징을 가진 탈세포화된 피부를 생성합니다.
세포외 기질(ECM)은 다양한 생체 활성 분자의 함량으로 인해 주변 세포의 자가 재생, 증식, 생존 및 분화를 지원하기 위해 생물물리학적, 생화학적 자극을 제공합니다. 이러한 특성으로 인해 ECM은 최근 조직 재생을 촉진하기 위한 생물학적 골격을 만들 수 있는 유망한 후보로 간주되고 있습니다. 새로운 연구에 따르면 탈세포화된 인간 조직은 3차원(3D) 구조와 기본 생물학적 분자의 내용을 보존하면서 구조적 및 생화학적 프로필에서 네이티브 ECM과 유사할 수 있음을 보여주었습니다. 따라서 탈세포화된 ECM은 많은 장기의 조직 리모델링, 복구 및 기능적 재건을 촉진하는 데 사용할 수 있습니다. 적절한 탈세포화 절차를 선택하는 것은 세포에 이상적인 미세환경의 특성을 유지하는 무세포 조직을 얻는 데 중요합니다.
여기에 설명된 프로토콜은 재현 가능하고 효과적인 cell-free 생물학적 ECM을 얻기 위한 탈세포화 방법에 대한 자세한 단계별 설명을 제공합니다. 성형 수술을 받은 환자의 피부 조각을 도데실황산나트륨(SDS), 트리톤 X-100 및 항생제의 조합을 사용하여 축소하고 탈세포화했습니다. 샘플을 통한 용액의 규칙적이고 균일한 운반을 촉진하기 위해, 기계적 모욕으로부터 보호하기 위해 임베딩 카세트로 동봉되었습니다. 탈세포화 시술 후 피부 조각의 백설공주는 완전하고 성공적인 탈세포화를 나타냅니다. 또한 탈세포화된 샘플은 손상되지 않고 잘 보존된 구조를 보여주었습니다. 결과는 제안된 탈세포화 방법이 효과적이고 빠르며 재현 가능하고 구조적 손상으로부터 샘플을 보호한다는 것을 시사합니다.
ECM은 세포의 골격 역할을 하여 다양한 구성 요소로 유지되는 복잡한 구조를 통해 세포를 지원하며, 심장 및 심장 조직 기능의 기계적 특성을 담당하는 주요 요인 중 하나입니다 1,2. ECM이 조직 리모델링에 적극적인 역할을 한다는 증거가 증가함에 따라 ECM이 수동 구성 요소라는 기존의 가정은 더 이상 쓸모가 없어졌습니다 3,4,5,6. ECM의 역할은 상주 세포에 생물물리학적, 생화학적 신호를 제공하는 것입니다. 이러한 신호가 많은 근본적인 세포 행동에 영향을 미쳐 수축 기능, 증식, 이동 및 분화 가능성에 영향을 미칠 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다 7,8,9. 따라서 ECM은 조직 공학 및 재생 의학에서 치료 지원 도구로 점점....
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인체 조직의 표본은 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수집되었으며 대학 병원 "Federico II" 지침을 준수했습니다. 이 연구에 참여한 모든 환자는 서면 동의서를 제공했습니다.
1. 솔루션 준비
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이 프로토콜의 목적은 잘 조직된 3D 구조와 잘 보존된 생물학적 분자 함량을 유지하면서 생물학적 조직에서 skin d-ECM 샘플을 얻는 것이었습니다(그림 1). 이 방법은 주로 Triton X-100 및 SDS의 두 가지 세제가 결합된 용액에서 샘플을 지속적으로 교반하는 것을 기반으로 하여 천연 조직의 전형적인 생물학적 및 구조적 특성을 보존하고 탈세포화 과정에서 노출 시간을 줄입니다. 수령 시, 샘플을 세척하고 절차를 위해 준비하여 머리카락이나 지방 조직이 없는 3cm x 2.5cm의 깨끗한 피부 조각을 얻었습니다(그림 2 및 그림 3). 임베딩 카세트를 사용하여 조직 파괴를 최소화할 수 있었으며(그림 3), 그 결과 보다 .......
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위에서 설명한 프로토콜은 이전에 발표된 프로토콜에 비해 최적화되고 개선되었지만, 주의와 정밀도가 필요한 몇 가지 중요한 단계를 제시합니다. 세제의 잘못된 희석을 방지하기 위해 탈세포화 용액을 준비하는 동안 거품 형성을 피해야 합니다. 이것은 용액을 부드럽게 붓고 실린더 내부를 따라 흐르게 함으로써 해결할 수 있습니다. 또한 Triton X-100 및 SDS와 같은 세제를 사용한 탈세포화는 지방을 제거하지 않으며 지질 잔여물이 방법의 효과에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 샘플에서 지방 조직을 수동으로 제거할 때 주의해야 합니다. 또 다른 중요한 단계는 샘플에서 표피를 제거하는 것입니다. 탈세포화가 진행되는 동안 표피는 피부 표면에서 점차 분리됩니다. 이 단계에서는 완전히 쓸어낸 후에만 집게로 벗겨내는 것이 중요하므로 찢어지거나 파쇄되어 샘플 내에 파편이 갇히는 것을 방지할 수 있습니다.
이 프로토콜은 두 가지 주요 전.......
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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.9% NaCl 등장성 생리학적 용액 | Sigma-Aldrich | S8776 | 0.9% 물 1 |
| L 비커 | VWR | 511-0318 | 사용 전에 세척 및 오토클레이브 |
| 10 mL 혈청학적 피펫 | Falcon | 357551 | Sterile, 폴리스티렌 |
| 100 mm 플레이트 | Falcon | 351029 | 처리된, sterile 세포 배양 접시 |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | 원심분리기 멸균 튜브, 폴리프로필렌 |
| 1 L 졸업 실린더 | VWR | 612-1524 | 사용 전에 청소 및 자동클레이브 |
| 2 L 병 | VWR | 215-1596 | 사용 전에 청소 및 자동클레이브 |
| 25 mL 혈청학적 피펫 | Falcon | 357525 | Sterile, 폴리스티렌 |
| 2 L 졸업 실린더 | VWR | 612-3072 | 깨끗하고 사용 전 오토클레이브 |
| 500 mL 비커 | VWR | 511-0317 | 사용 전 세척 및 오토클레이브 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich Y0000005 | 분말 | |
| 해부 보드 | VWR | 100498-398 | 고밀도 폴리에틸렌으로 제작되었습니다. |
| 해부 메스 | VWR | 233-5526 | 멸균 및 일회용 |
| 임베딩 카세트 | Diapath | 070191 | 외부 치수: 40x26x7mm(WxDxH) |
| 미세 집게 | VWR | 232-1317 | 사용 전 세척 및 오토클레이브 |
| 퍼넬 | VWR | 221-1861 | 사용 전 세척 및 오토클레이브 |
| 육각형 계량 보트 크기 M | Sigma-Aldrich | Z708585 | 육각형, 폴리스티렌, 51mm 하단 I.D., 64mm 상단 I.D. |
| 육각형 계량 보트 크기 S | Sigma-Aldrich | Z708577 | Hexagonal, 폴리스티렌, 25mm 하단 I.D., 38mm 상단 I.D. |
| 대형 수술 용 가위 | VWR | 233-1211 | 사용 전에 청소 및 오토 클레이브 |
| 긴 집게 | VWR | 232-0096 | 사용 전에 청소 및 오토 클레이브 |
| 페니실린 및 스트렙토 마이신 | 시그마 - 알드리치 | P4333-100ml | 안정화, 10.000 단위 페니실린 및 10 mg 스트렙토 마이신 / mL, 0.1 μ M이 필터링되었습니다. -20°C. 에서 보관하십시오. 솔루션 반복되는 동결/해동 주기를 피하기 위해 더 작은 작업량으로 분주해야 합니다. |
| 피펫 건 | Eppendorf | 613-2795 | Eppendorf Easypet® 3 |
| 플라스틱 트레이 | VWR | BELAH162620000 | 부식 방지 폴리프로필렌 플라스틱 트레이 |
| 염화칼 | Sigma-Aldrich | P9333 | 분말 |
| 인산칼륨 일염기 | 성 Sigma-Aldrich | P5665 | 분말 |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S7653 | 분말 |
| : 나트륨 도데 실 설페이 | 시그마 - 알드리치 | 62862 | 분말 |
| 인산 나트륨 이염 기성 | 시그마 - 알드리치 | 94046 | 분말 |
| 주걱 | VWR | RSGA038.210 | 사용 전 세척 및 오토 클레이브 |
| 스푼 | VWR | 231-1314 | 사용 전 세척 및 오토 클레이브 |
| 교반 바 | VWR | 442-0362 | 청소 및 사용 전 오토클레이브 |
| 교반 바 리트리버 | VWR | 89026-262 | 순수하고 FDA 승인 PTFE |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | 액체 |
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