방법 논문

재생 의학을 위한 고도로 보존된 인간 무세포 피부 매트릭스의 준비를 위한 탈세포화(Decellularization for the Preparation of highly Preserved Human Acellular Skin Matrix for Regenerative Medicine)

DOI:

10.3791/62935

⸱

2021년 9월 8일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Public Health, University of Naples Federico II, Naples, Italy, 2Department of Medicine, Surgery and Dentistry, Scuola Medica Salernitana, University of Salerno, Baronissi, Italy

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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탈세포화된 인간 피부는 조직 재생에 적합합니다. 탈세포화(decellularization)의 주요 문제는 구조 단백질, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans, GAG) 및 성장 인자(growth factor)의 적절한 함량과 함께 네이티브 구조를 보존하는 것입니다. 제안된 방법은 빠르고 효과적인 탈세포화를 가능하게 하여 잘 보존된 본래 특징을 가진 탈세포화된 피부를 생성합니다.

초록

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세포외 기질(ECM)은 다양한 생체 활성 분자의 함량으로 인해 주변 세포의 자가 재생, 증식, 생존 및 분화를 지원하기 위해 생물물리학적, 생화학적 자극을 제공합니다. 이러한 특성으로 인해 ECM은 최근 조직 재생을 촉진하기 위한 생물학적 골격을 만들 수 있는 유망한 후보로 간주되고 있습니다. 새로운 연구에 따르면 탈세포화된 인간 조직은 3차원(3D) 구조와 기본 생물학적 분자의 내용을 보존하면서 구조적 및 생화학적 프로필에서 네이티브 ECM과 유사할 수 있음을 보여주었습니다. 따라서 탈세포화된 ECM은 많은 장기의 조직 리모델링, 복구 및 기능적 재건을 촉진하는 데 사용할 수 있습니다. 적절한 탈세포화 절차를 선택하는 것은 세포에 이상적인 미세환경의 특성을 유지하는 무세포 조직을 얻는 데 중요합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 재현 가능하고 효과적인 cell-free 생물학적 ECM을 얻기 위한 탈세포화 방법에 대한 자세한 단계별 설명을 제공합니다. 성형 수술을 받은 환자의 피부 조각을 도데실황산나트륨(SDS), 트리톤 X-100 및 항생제의 조합을 사용하여 축소하고 탈세포화했습니다. 샘플을 통한 용액의 규칙적이고 균일한 운반을 촉진하기 위해, 기계적 모욕으로부터 보호하기 위해 임베딩 카세트로 동봉되었습니다. 탈세포화 시술 후 피부 조각의 백설공주는 완전하고 성공적인 탈세포화를 나타냅니다. 또한 탈세포화된 샘플은 손상되지 않고 잘 보존된 구조를 보여주었습니다. 결과는 제안된 탈세포화 방법이 효과적이고 빠르며 재현 가능하고 구조적 손상으로부터 샘플을 보호한다는 것을 시사합니다.

서론

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ECM은 세포의 골격 역할을 하여 다양한 구성 요소로 유지되는 복잡한 구조를 통해 세포를 지원하며, 심장 및 심장 조직 기능의 기계적 특성을 담당하는 주요 요인 중 하나입니다 1,2. ECM이 조직 리모델링에 적극적인 역할을 한다는 증거가 증가함에 따라 ECM이 수동 구성 요소라는 기존의 가정은 더 이상 쓸모가 없어졌습니다 3,4,5,6. ECM의 역할은 상주 세포에 생물물리학적, 생화학적 신호를 제공하는 것입니다. 이러한 신호가 많은 근본적인 세포 행동에 영향을 미쳐 수축 기능, 증식, 이동 및 분화 가능성에 영향을 미칠 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다 7,8,9. 따라서 ECM은 조직 공학 및 재생 의학에서 치료 지원 도구로 점점....

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프로토콜

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인체 조직의 표본은 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수집되었으며 대학 병원 "Federico II" 지침을 준수했습니다. 이 연구에 참여한 모든 환자는 서면 동의서를 제공했습니다.

1. 솔루션 준비

  1. 1200mL의 1% 탈세포화 용액 준비
    1. 눈금이 매겨진 실린더에서 588mL의 이중 증류수를 계량하고 1L 비커에 옮겨 600mL의 2% Triton X-100 용액을 준비합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 Triton X-100 12mL와 교반 막대를 비커에 추가합니다. 비커를 자석 교반기에 놓고 Triton X-100이 완전히 용해될 때까지 용액을 혼합합니다.
    2. 동요를 멈추십시오. 교반 막대 리트리버를 사용하여 교반 막대를 제거합니다. 실온에서 보관하십시오.
    3. 눈금이 매겨진 실린더에서 550mL의 이중 증류수를 계량하여 600L 비커에 옮겨 2% SDS 용액 600mL를 준비합니다.
    4. 플라스틱 계량 보트에 SDS 분말 12g의 무게를 측정하고 1.1.3단계에서 이중 증류수가 들어 있는 비커로 옮깁니다.
      알림: 1.1.4단계는 화학 물질 후드 아래에서 수행해야 하며 사용자는 개인 보호 장비를 착용해....

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결과

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이 프로토콜의 목적은 잘 조직된 3D 구조와 잘 보존된 생물학적 분자 함량을 유지하면서 생물학적 조직에서 skin d-ECM 샘플을 얻는 것이었습니다(그림 1). 이 방법은 주로 Triton X-100 및 SDS의 두 가지 세제가 결합된 용액에서 샘플을 지속적으로 교반하는 것을 기반으로 하여 천연 조직의 전형적인 생물학적 및 구조적 특성을 보존하고 탈세포화 과정에서 노출 시간을 줄입니다. 수령 시, 샘플을 세척하고 절차를 위해 준비하여 머리카락이나 지방 조직이 없는 3cm x 2.5cm의 깨끗한 피부 조각을 얻었습니다(그림 2 및 그림 3). 임베딩 카세트를 사용하여 조직 파괴를 최소화할 수 있었으며(그림 3), 그 결과 보다 온전한 구조를 가진 샘플을 얻을 수 있었습니다. 탈세포화된 피.......

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토론

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위에서 설명한 프로토콜은 이전에 발표된 프로토콜에 비해 최적화되고 개선되었지만, 주의와 정밀도가 필요한 몇 가지 중요한 단계를 제시합니다. 세제의 잘못된 희석을 방지하기 위해 탈세포화 용액을 준비하는 동안 거품 형성을 피해야 합니다. 이것은 용액을 부드럽게 붓고 실린더 내부를 따라 흐르게 함으로써 해결할 수 있습니다. 또한 Triton X-100 및 SDS와 같은 세제를 사용한 탈세포화는 지방을 제거하지 않으며 지질 잔여물이 방법의 효과에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 샘플에서 지방 조직을 수동으로 제거할 때 주의해야 합니다. 또 다른 중요한 단계는 샘플에서 표피를 제거하는 것입니다. 탈세포화가 진행되는 동안 표피는 피부 표면에서 점차 분리됩니다. 이 단계에서는 완전히 쓸어낸 후에만 집게로 벗겨내는 것이 중요하므로 찢어지거나 파쇄되어 샘플 내에 파편이 갇히는 것을 방지할 수 있습니다.

이 프로토콜은 두 가지 주요 전.......

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% NaCl 등장성 생리학적 용액Sigma-AldrichS87760.9% 물 1
L 비커VWR511-0318사용 전에 세척 및 오토클레이브
10 mL 혈청학적 피펫Falcon357551Sterile,  폴리스티렌
100 mm 플레이트Falcon351029처리된, sterile 세포 배양 접시
15 mL sterile tubesFalcon352097원심분리기 멸균 튜브, 폴리프로필렌
1 L 졸업 실린더VWR612-1524사용 전에 청소 및 자동클레이브
2 L 병VWR215-1596사용 전에 청소 및 자동클레이브
25 mL 혈청학적 피펫Falcon357525Sterile,  폴리스티렌
2 L 졸업 실린더VWR612-3072깨끗하고 사용 전 오토클레이브
500 mL 비커VWR511-0317사용 전 세척 및 오토클레이브
Amphotericin BSigma-Aldrich Y0000005분말
해부 보드VWR100498-398고밀도 폴리에틸렌으로 제작되었습니다.
해부 메스VWR233-5526멸균 및 일회용
임베딩 카세트Diapath070191외부 치수: 40x26x7mm(WxDxH)
미세 집게VWR232-1317사용 전 세척 및 오토클레이브
퍼넬VWR221-1861사용 전 세척 및 오토클레이브
육각형 계량 보트 크기 MSigma-AldrichZ708585육각형, 폴리스티렌, 51mm 하단 I.D., 64mm 상단 I.D.
육각형 계량 보트 크기 SSigma-AldrichZ708577Hexagonal, 폴리스티렌, 25mm 하단 I.D., 38mm 상단 I.D.
대형 수술 용 가위VWR233-1211사용 전에 청소 및 오토 클레이브
긴 집게VWR232-0096사용 전에 청소 및 오토 클레이브
페니실린 및 스트렙토 마이신시그마 - 알드리치P4333-100ml안정화, 10.000 단위 페니실린 및 10 mg 스트렙토 마이신 / mL, 0.1 μ M이 필터링되었습니다. -20°C. 에서 보관하십시오. 솔루션  반복되는 동결/해동 주기를 피하기 위해 더 작은 작업량으로 분주해야 합니다.
피펫 건Eppendorf613-2795Eppendorf Easypet® 3
플라스틱 트레이VWRBELAH162620000부식 방지 폴리프로필렌 플라스틱 트레이
염화칼Sigma-AldrichP9333분말
인산칼륨 일염기성 Sigma-AldrichP5665분말
염화나트륨Sigma-AldrichS7653분말
: 나트륨 도데 실 설페이시그마 - 알드리치62862분말
인산 나트륨 이염 기성시그마 - 알드리치94046분말
주걱VWRRSGA038.210사용 전 세척 및 오토 클레이브
스푼VWR231-1314사용 전 세척 및 오토 클레이브
교반 바VWR442-0362청소 및 사용 전 오토클레이브
교반 바 리트리버VWR89026-262순수하고 FDA 승인 PTFE
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1액체
륨 트 로 성형

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. Journal of Cell Science. 121 (3), 255-264 (2008).
  2. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degrad....

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