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방법 논문

시투 혼성화에서 멀티플렉스를 사용하여 마우스 Vagal afferent 뉴런에서 G 단백질 결합 수용체 발현의 검출

3.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/62945

⸱

2021년 9월 20일

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

이 논문에서

요약

시투 혼성화(ISH)의 멀티플렉스는 성인 마우스의 전체 vagal ganglionic 복합체에서 2개의 G 단백질 결합 수용체 및 1개의 전사 인자에 대한 성적증명서를 동시에 시각화하기 위해 사용되었다. 이 프로토콜은 vagal 포렌트 뉴런의 전사 프로파일의 정확한 지도를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

이 연구는 G 단백질 결합 수용체(GPCR)의 발현을 검출하는 데 특히 중점을 둔 마우스 경정맥 중형화(ISH)의 주악성화(ISH)에서 멀티플렉스에 대한 프로토콜을 설명합니다. 포르말린 고정 경정맥 신경리아는 RNAscope 기술로 처리되어 두 개의 대표적인 GPCRs(cholecystokinin 및 ghrelin 수용체)의 발현을 동시에 검출하여 nodose(쌍형 동종박스 2b, Phox2b) 또는 경정맥 성신경(PR도메인 아연+121)의 하나의 마커 유전자와 결합하여 동시에 검출하였다. 표지된 간리아는 앞서 언급한 성적증명서의 분포 및 발현 패턴을 결정하기 위해 공초점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. 간단히, Phox2b 포이퍼트 뉴런은 담낭스토키닌 수용체(Cck1r)를 풍부하게 표현하지만 그렐린 수용체(Ghsr)는 발현하는 것으로 나타났다. Prdm12 포퍼런트 뉴런의 작은 하위 집합은 또한 Ghsr 및/또는 Cck1r를 표현하는 것으로 나타났습니다. 이 문서에 설명 된 접근 방식은 vagal 포퍼런트 뉴런의 전사 프로파일의 정확한지도를 생성하는 과학자를 도울 수 있습니다.

서론

vagal afferents의 세포 체는 경정맥, 석유, 및 nodose ganglia1,2,3에포함된다. 그들의 축축은 두개골, 흉부 및 복부 영토4,5,6,7에미주 신경의 여러 가지를 통해 함께 여행한다. 그들의 내장 엔딩에서, vagal afferents는 생리적이고 유해한 자극의 넓은 범위에 반응할 수 있습니다8,9,10. 그러나, 바갈 감지에 관여하는 신호 분자 및 수용체의 분포는 제대로 특성화 남아 있습니다. 이는 부분적으로 그들의 작은 크기에도 불구하고, 많은 수의GPCRs8,11,12,13을포함하여 광범위한 수용체 스펙트럼을 표현하기 때문이다. 더욱이, vagal 발포성 뉴런은 본질적으로 이질적이며 뚜렷한 분자프로파일(14)을표시한다. 문제를 복잡하게 하기 위해 경정맥, 석유 및 노도스 신경리아가 마우스에 부착되어 단일 신경절 질량을 형성합니다. 마지막으로, 동물의 하위 집합에서, 노도스 신경절은 공감 우수한 자궁 경부신경절(15)에부착된다.

과거에, 조사자들은 vagal 포퍼트 뉴런의 신경화학적 구성을 연구하기 위해 면역히토화학으로 전환했다16,17,18. 검증된 항체를 이용한 면역히스트토화학이 유용하지만, 면역히스토케미칼 연구의 결과는 주의해서 해석되어야 한다. 예를 들어, GPCRs에 대한 특정 항체를 식별하는 수많은 노력은19,20,21,22, 23,24,25에실패했으며, 주요 연구자들은 GPCRs에 대한 항체의 대부분이 신뢰할 수 없다는 결론을 내렸다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 정량적 PCR(qPCR)은 설치류 혈관 신경절 질량26,27,28,29에서유전자 발현을 평가하는 데 널리 사용되어 왔다. 그러나, qPCR을 이용한 유전자 발현을 검사하는 것은 공간 정보의 손실의 희생으로 발생한다. 특히, 관심 있는 특정 유전자(예를 들어, 노도스 대 경정맥 세포)를 발현하는 세포 또는 셀 유형(들)의 수를 예측할 수 없다. 되풀이되는 문제점은 또한 인접한 조직으로 오염및 해부15도중 미주 신경의 가변 길이, 우수한 자궁 경부 및 경정맥 의 포함을 포함합니다. 위의 어려움의 결과로, 논쟁은 vagal 포성 뉴런에서 여러 GPCRs의 표현과 분포를 둘러싸고 있습니다. 한 특히 수수께끼 예는 ghrelin 수용 체에 관한 (Ghsr). 일부 연구는 vagal afferent뉴런30,31,32에서이수용체의 광범위한 표현을 발견하는 반면, 다른 사람은 Ghsr mRNA가 nodose 신경절11,14에서거의 감지 할 수없는 것으로 나타났습니다. 따라서 vagal ganglionic 질량에 있는 Ghsr mRNA의 상세한 매핑은 그러므로 보증됩니다.

시투 혼성화(ISH)에서도 vagal ganglionic 질량7,11,12,33,34,35에서유전자 발현 패턴을 평가하는 데 사용되었습니다. RNA 기반 기술은 대부분의 상황에서 항체 기반 기술보다 더 신뢰할 수 있고 특이적으로 남아 있기 때문에36,37,ISH 연구는 vagal 포성 뉴런의 신경 화학 코딩을 더 잘 이해하는 데 가치가 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 전통적인 ISH 기술 자체는 주의없이하지 않습니다. 방사성 이스는 민감하지만 배경을 생성하고 성가신38남아있다. 비 방사성 ISH는 덜 복잡하지만 덜민감하지 도 38. 대조적으로, 최근에 개발된 RNAscope ISH 방법은 매우 민감하고 최소한의배경(39)을생성한다. 현재 연구는 마우스의 vagal 포성 뉴런에서 GPCRs의 검출에 멀티플렉스 형광 RNAscope를 적용. 우리는 Ghsr의 분포를 매핑에 초점을 맞추고 cholecystokinin 수용체 (Cck1r)의 분포를 비교, 또 다른 GPCR잘 노도스 신경절에서 발현 될 것으로 알려진(34). 마지막으로, 쌍과 같은 동종박스 2b(Phox2b) 및 PR 도메인 아연 핑거 단백질 12(Prdm12)는 각각14개의노도스와 경정맥 성신경에 대한 선택적 마커로 사용되었다. Phox2b 또는 Prdm12를 시각화하지 않으면 경정맥 대 노도스 포렌티를 확실하게 식별하는 것이 어려울 것입니다. 잠재적인 기술적 함정은 또한 기사 전반에 걸쳐 논의됩니다.

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프로토콜

참고 : 이 연구에서 사용되는 마우스는 순수한 C57BL / 6J 배경에 야생 형 남성이었다. 총 4마리의 마우스가 멀티플렉스 ISH에 사용되었다. 모든 마우스는 희생 시에 약 8주 전에 생후이었습니다. 한 남성 마우스 (대략 1 세) 또한 노화와 관련 된 내 인 성형을 입증 하는 데 사용 되었다. 동물들은 음식과 물에 대한 광고 리비툼이 있는 장벽 시설 내의 통풍 케이지에 보관되었습니다. UT 남서부 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 아래에 설명 된 절차를 검토하고 승인했습니다. 시약 및 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표에서찾을 수 있습니다.

1. 샘플 컬렉션

  1. 희생의 날에, 염소 수화물의 과다 복용을 관리 (500 mg/kg, i.p.) 마우스에. 심층 마취 마우스를 1x 인산염 완충식식염수(PBS)의 5mL로 연동 펌프를 사용한 후 실온에서 10% 포르말린의 50mL가 뒤따릅니다.
    참고 : 이것은 포르말린의 흡입을 방지하기 위해 연기 후드에서 수행됩니다.
  2. 노도스, 페트로살 및 경정맥은마우스(15)에서단일 신경절 질량을 형성하기 위해 융합되기 때문에, 각 측면(왼쪽과 오른쪽)에서 전체 vagal ganglionic 질량을 신중하게 수집하고, 해부범위와 미세한 스프링 가위 및 포셉(재료의 표참조).
  3. 큰 가위 한 쌍으로 마우스를 참수 할 때 (재료의 표참조), 뇌간을 분쇄하지 마십시오.
  4. 쥐(40)에서이전에 설명된 해부 접근법에 따라, 후두뼈를 노출시키기 위해 작은 집게(재료표)로 기관으로 스테르노로이드 및 오모로이드 근육을 제거한다. 경동맥, 미주 신경, 저혈압 신경, 그리고 포멘 매그넘이 보일 때까지 근육, 지방 조직 및 결막 조직의 전체 영역을 취소합니다. 작은 스프링 가위로 전체 저혈압신경을잘라냅니다(재료의 표).
  5. 요새 매그넘15에가까운 반투명 질량으로 노도스 신경절을 찾습니다. 작은 가위(재료의 표)를사용하여, 조심스럽게 황두골 뼈를 깨고 경추 신경절을 더 노출합니다. 경구 표면에서 시각적 인 랜드 마크로 검은 멜라닌세포를 찾습니다.
  6. 미갈 신경절 질량 사이의 신경 부착물을 자르고 미주 신경의 말초 끝을 부드럽게 당기면서 동시에 작은 스프링 가위로 뇌간을 향해 경정맥을 절단하여 전체 신경절 질량을추출합니다(재료의 표).
  7. 가능한 한 미주 신경과 신경절 질량에 집착 하는 결막 조직 및 지방을 제거 합니다.
  8. 한 튜브에서 다른 튜브로 옮기는 동안 하나의 신경절을 잃기 쉽기 때문에 미주 신경의 ~0.5 cm를 유지하여 시료의 취급 및 국소화를 용이하게 하십시오.
  9. 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 미세포프의 도움으로 간리를 놓고 24시간 동안 포르말린의 4°C에서 배양하고 또 다른 24시간 동안 30% 자당합니다.
  10. 알루미늄 호일 조각에 최적의 절삭 온도(OCT) 매체의 작은 드롭(~4mm Ø) 내부에 간질을 배치합니다. 다음으로, 드라이 아이스 의 침대에 샘플을 동결.
  11. -20°C에서 저온으로 샘플을 14 μm 두께의 섹션으로 자르고 유리 현미경 슬라이드에서 3 시리즈 42 μm 떨어져 수집합니다.
    참고: 슬라이드의 가장자리에 섹션이 가까이 놓지 마십시오. 시약을 저장하려면 조직 섹션을 가능한 한 단단히 포장하지만 겹치지 않도록 유지하십시오.
  12. 적어도 6 개월 동안 ISH에 필요할 때까지 -80 °C 냉동고에 샘플을 저장합니다.
    참고: 내인성 형광에 대한 문제 해결을 위한 그림 1을 참조하십시오.

2. 전처리 및 이시

  1. 실험 전날, autoclave 실험실 유리 제품은 설거지 염색 및 완충항아리 세척을 포함하여 ISH에 사용됩니다.
    참고: RNase 가 없는 조건에서 일하는 것은 중요하지 않지만 항상 장갑을 착용하십시오. 오염이 의심되는 경우 RNase 오염 제거 용액병(재료 표)을손이 닿지 않는 곳에 보관하십시오.
  2. 첫날, ISH 전용 벤치에 실온에 슬라이드를 가져. 슬라이드를 1x PBS로 헹구고 베이킹 오븐에서 60°C에서 30분 동안굽습니다(재료 표).
  3. 4°C에서 15분 동안 슬라이드를 4% 포르말린으로 수정합니다.
  4. 시약을 멀티플렉스 키트(재료표)에실온으로 가져옵니다.
  5. 슬라이드를 50%, 70%, 100% 에탄올로 탈수하여 각각 5분 동안 탈수합니다. H2O2 용액을 10분 동안 시료에 적용한 다음 이중 증류수(ddH2O)로 헹구습니다.
  6. 5분 동안 대상 검색 시약으로 샘플을 처리하고 ddH2O로 헹구고 100% 에탄올및 공기 건조를 처리합니다. 소수성 펜을 사용하여 샘플 주위에 장벽을 만듭니다.
    참고: 소수성 장벽을 조직 섹션에 너무 가깝게 적용하지 마십시오.
  7. 하이브리드화오븐(재료표)에40°C에서 30분 동안 프로테아이즈를 적용합니다.
  8. 그 동안, 40 °C에서 프로브를 예열하고 사용하기 전에 실온에서 냉각. 하이브리드화 오븐에서 40°C에서 2시간 동안 대상 프로브(Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; 또는 Cck1r-C3; 또는 Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2)의 원하는 조합으로 슬라이드를 배양한다.
  9. 혼성화 오븐에서 40°C에서 2시간 동안 디하이드로디피콜리나테 환원효소(DapB) 표적 C1 프로브를 통해 음극관 조직을 배양한다.
  10. 슬라이드를 세척 버퍼로 헹구고 실온에서 5배식식염수 나트륨 구연산나트륨(SSC)으로 하룻밤 을 보관하십시오. 편의를 위해 실험을 2일로 나눕이됩니다. 다음 날, 세척 버퍼로 슬라이드를 헹구고 아래에 나열된 증폭 시약으로 인큐베이션합니다(재료 표의사용자 설명서 참조).
  11. AMP1(40°C에서 30분), AMP2(40°C에서 30분), AMP 3(40°C에서 15분)을 적용합니다. 각 단계 사이에 세척 버퍼로 헹구세요.
  12. 각 오팔염료(재료표)를디메틸 설플옥사이드에 녹이고 필요할 때까지 용액을 4°C로 저장합니다.
  13. 채널 1의 경우 HRP-C1(40°C에서 15분) 및 오팔 520(녹색 색, 희석 1/1,500; 40°C에서 30분)으로 슬라이드를 배양합니다. 각 단계 사이에 세척 버퍼로 헹구세요.
  14. 채널 2의 경우 HRP-C2(40°C에서 15분) 및 오팔 570(노란색 색; 희석 1/1,500; 40°C에서 30분)으로 슬라이드를 배양한다. 각 단계 사이에 세척 버퍼로 헹구세요.
  15. 채널 3의 경우 HRP-C3(40°C에서 15분) 및 오팔 690(먼 붉은 색; 희석 1/1,500; 40°C에서 30분)으로 슬라이드를 배양한다. 각 단계 사이에 세척 버퍼로 헹구세요.
  16. 슬라이드를 세척하고 30 s에 대한 4′,6-diamidino-2-페닐린돌 (DAPI)에 노출.
  17. 각 슬라이드에 즉시 마운팅 배지를 바르고 티슈 섹션 에 커버슬립을 놓습니다.
  18. 이미징될 때까지 4°C의 슬라이드 홀더에 조직을 수평으로 유지합니다.

3. 현미경 검사 및 데이터 분석

참고: 멀티플렉스 ISH 데이터는 적절한 필터가 있는 다양한 계측기로 이미지화할 수 있습니다. 그러나, 바람직한 이미징 방법은 20x 및 63x(오일) 목표를 가진 공초점 현미경 검사법입니다. 이유를 위해 토론을 참조하십시오. 최적의 신호 대 잡음 비율을 측정하려면 그림 2를 참조하십시오.

  1. 488, 561 및 633 nm 레이저 라인을 갖춘 공초점 현미경을 사용합니다. 다음 획득 매개 변수(표 1참조): 오팔 690(HeNe 633 nm, 검출 범위 668-696 nm, 전원 2.0, 게인 724); 오팔 570 (DPSS 레이저 561 nm, 검출 범위 579-627 nm, <파워 15.0,
  2. 이미지의 품질을 향상하려면 평균 4개의 라인과 픽셀 크기가 1024 x 1024 이상인 경우 를 획득하십시오.
    참고: 상기 매개변수는 예로만 제공되며, 특정 조직에 대한 하나의 계측기, 배율(20배 또는 63배), 발현 수준 및 내인성 수준의 형광에 따라 수정이 권장됩니다.
  3. 획득 매개 변수에 만족하면 동일한 설정을 사용하여 이미지를 수집합니다. 시각화를 용이하게 하기 위해 각 채널에 거짓 색상을 특성화합니다.
    참고: 예를 들어 빨간색(Phox2b 또는 Prdm12), 시안(Cck1r), 노란색(Ghsr), 회색(DAPI).
  4. DAPI로 가볍게 염색된 핵 1개로 RNAscope 양성 프로파일의 윤곽을 식별하여 디지털 이미지를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 각 성적증명서를 표현하는 RNAscope 양성 프로파일의 백분율을 계산합니다 [ 그림3A-C].
  5. 추정의 엄격하고 정확도를 향상하기 위하여는, 적어도 4개의 다른 동물에서 적어도 2,000개의 신경 단면도를 계산합니다. 왼쪽과 오른쪽 간골에서 따로 계산을 수행합니다.
  6. 집계된 총 프로파일 수로 원형 차트에 데이터를 입력합니다.
  7. 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하고 20배 이미지를 함께 스티치합니다. ImageJ-Fiji와 다른 사진 및 디자인 소프트웨어를 사용하여 최종 플레이트를 생성합니다. 모든 이미지에 대비 및 가벼움을 균일하게 조정합니다.

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결과

RNAScope는 모든 연령, 성별 또는 유전 적 배경의 동물에게 적용 될 수 있지만 젊은 성인 (<3 개월)과 함께 일하는 것이 좋습니다. 이는 형광 유물(예를 들어, 리포우신)이 구형 동물의뉴런(41)에서흔히 발견되기 때문이다. 오래된 마우스에서 포르말린 고정 된 간리아는 종종 쉽게 진짜 염색으로 착각 할 수있는 놀라 울 정도로 강렬한 내인성 형광을 포함(도 1A,B). 어쨌든, 처리하기 전에 조직에서 내인성 형광의 수준을 확인하는 것이 좋습니다.

도 2A,B에도시된 바와 같이 DapB 음성 프로브로 배양된 음의 대조군 조직에서 단면을 사용하여 각 레이저 및 배율에 대한 최적의 획득 파라미터 및 신호 대 잡음 비율을 결정하는 것이 중요하다. DapB는

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토론

ISH의 기술은 1960 년대 후반42에발명되었다. 그러나, 1980년대 중반까지는 중추 및 말초 신경계에서 mRNA검출을 위해 적용된 것이아니다(43·44). 신경계의 이질성과 항체에 대한 반복되는 문제를 고려할 때, 세포 수준에서 특정 성적증명서를 국소화하는 것은 여전히 귀중한 도구로 남아 있다. 그럼에도 불구하고 전통적인 ISH 방법은 힘들고 다양하게 민감하게 남아 있습니다. 다행히도, 이 연구는 RNAscope에게 불린 높게 민감한 ISH 절차를 채택했습니다, 일반적으로 배경을 생성하지 않으며 낮은 수준45,46에서표현된 몇몇 성적증명서의 검출을 허용합니다. 구체적으로, 멀티플렉스 형광 RNAScope는 Ghsr 및 Cck1r 전사체의 동시 검출을 위해 적용되었다. 전사 ...

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공개 사항

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH 교부금 #5P01DK119130-02에 의해 투자된 신경 해부학/히스토로지/뇌 주입 코어에 의해 지원되었습니다. 저자는 UT 남서부 라이브 세포 이미징 시설 (펠프스 박사가 이끄는)과 그 직원 (Abhijit Bugde 및 마르셀 Mettlen)의 도움을 인정하고 싶습니다, NIH 그랜트 #1S10OD021684-01에 의해 부분적으로 지원, 해롤드 C. 시몬스 암 센터의 공유 자원, NCI 암 센터 지원 보조금에 의해 부분적으로 지원, P30 CA142543.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10x PBS피셔 사이언티픽BP399-4
20x SSC인비트로젠AM9763-80
° C 냉동고PHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobe사진 및 디자인 소프트웨어
베이킹 오븐Thermo Scientific모델: 658
컨포칼 현미경ZeissLSM880 Airyscan
커버 유리뇌 연구소2460-1.5D
저온 유지 장치라이카CM 3050 S
뒤몽 #5 집게F.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897L장착 매체
HybEZ 오븐혼성화 오븐
소수성 펜Vector LaboratoriesH-4000
이미지J-FijiNIH
대형 가위Henry Schein100-7561
마이크로 원심분리기 튜브VWR20170-333
미니 펌프 가변 흐름Fisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KT형광 바이오마커
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KT형광 바이오마커
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KT형광 바이오마커
ProLong Gold 형광 표지된 세포용
RNAscope 멀티플렉스 형광 시약 키트 v2ACD /Bio-Techne323100멀티플렉스 키트
RNAscope 프로브 마우스 Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
RNAscope 프로브 마우스 DapBACD /Bio-Techne310043
RNAscope 프로브 마우스 GhsrACD /Bio-Techne
RNAscope 프로브 마우스 Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
RNAscope 프로브 마우스 Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase 오염 제거 솔루션
소형 해부 가위Millipore SigmaZ265977
Superfrost Plus 슬라이드Fisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
사용자 설명서ACD323100 USM
Vannas Spring ScissorsRobozRS 5620
ZEN 이미징 소프트웨어Zeiss
안티페이드 마운트 매 질 426141

참고문헌

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시투 혼성화에서 멀티플렉스를 사용하여 마우스 Vagal afferent 뉴런에서 G 단백질 결합 수용체 발현의 검출
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